2010年4月至11月,江苏等地鸭、鹅发生了一种以产蛋率、采食量显著下降,出现脑炎样神经症状为特征的传染病。对发病鹅进行剖检观察,鸭胚尿囊腔途径接种发病鹅病料分离病原,电镜观察病毒粒子。对健康鹅接种分离病毒进行动物回归试验。在...2010年4月至11月,江苏等地鸭、鹅发生了一种以产蛋率、采食量显著下降,出现脑炎样神经症状为特征的传染病。对发病鹅进行剖检观察,鸭胚尿囊腔途径接种发病鹅病料分离病原,电镜观察病毒粒子。对健康鹅接种分离病毒进行动物回归试验。在病毒核酸背景未知的情况下,应用非序列依赖性单引物扩增法结合DNA酶处理（DNase-sequence independent single primer amplification,DNase-SISPA）对病原基因进行扩增,并在此基础上设计了1对特异性引物对病毒基因进行PCR扩增。剖检结果发现病鹅的脑膜、肺脏、肝脏、心脏、卵巢等多器官出血,脾脏肿大坏死。含毒鸭胚尿囊膜超薄切片电镜观察显示：病毒粒子直径为50~60 nm。动物回归试验成功复制出该病并分离到病毒。应用DNase-SISPA方法发现了3个病毒相关基因片段,经序列比对分析,与黄病毒属（Flavi-virus）坦布苏病毒（Tembusu virus）基因序列有很高的同源性,分别为96%、88%、93%。据此设计特异性引物扩增出一段985 bp基因片段,该片段与黄病毒属坦布苏病毒E基因的核苷酸同源性为91%,氨基酸同源性为97%。将分离的鹅黄病毒毒株命名为Goose/Jiangsu/804/2010（简称JS804）。研究结果表明：此次鸭、鹅新发疫病的病原为一种新的黄病毒。展开更多
采用分批式培养方法研究了Marc-145细胞微载体悬浮培养及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖工艺。结果表明,在3 g/L的微载体用量下,采用1 ml 3×105个细胞的初始接种密度及培养至第3 d进行换液操作工艺可以获得最佳的Marc-145细胞...采用分批式培养方法研究了Marc-145细胞微载体悬浮培养及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖工艺。结果表明,在3 g/L的微载体用量下,采用1 ml 3×105个细胞的初始接种密度及培养至第3 d进行换液操作工艺可以获得最佳的Marc-145细胞生长效能。采用感染复数为0.05的接毒比例及接毒后48 h收获毒液可获得最高的PRRSV增殖效价。在5 L反应器中重复验证上述工艺,获得较为稳定的试验结果,最大细胞密度均可高于1 ml 2×106个细胞,PRRSV的增殖效价均高于108.0TCID50/ml。为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。展开更多
本研究通过筛选驯化的MDCK细胞获得无血清悬浮生长MDCK细胞(命名为MDCK-sus),测定该细胞的比生长速率、细胞活力及细胞最大生长密度等生长特性,采用间接免疫荧光法和流式细胞仪检测法比较母本MDCK细胞与MDCK-sus细胞流感病毒受体[唾液酸...本研究通过筛选驯化的MDCK细胞获得无血清悬浮生长MDCK细胞(命名为MDCK-sus),测定该细胞的比生长速率、细胞活力及细胞最大生长密度等生长特性,采用间接免疫荧光法和流式细胞仪检测法比较母本MDCK细胞与MDCK-sus细胞流感病毒受体[唾液酸-α-2,3-半乳糖糖链受体(SAα2,3Gal)和唾液酸-α-2,6-半乳糖糖链受体(SAα2,6Gal)]的丰度,用荧光定量PCR检测比较细胞中α-2,3唾液酸转移酶(ST3Gals)基因与α-2,6唾液酸转移酶(ST6Gals)基因表达水平的差异,通过测定流感病毒血凝HA效价比较母本MDCK细胞与MDCK-sus细胞对流感病毒的增殖能力。结果表明,经驯化获得的适合无血清悬浮培养的MDCK-sus细胞,细胞密度最高可达1ml 3.6×106个细胞,最大比生长速率可达1 d 0.56。MDCK-sus细胞表面流感病毒受体SAα2,3Gal的丰度明显高于母体MDCK细胞,ST3Gal转移酶基因表达水平也明显高于母本MDCK细胞。MDCK细胞驯化后增殖禽流感病毒的能力增强,其中H9亚型禽流感病毒AH1102株在MDCK-sus细胞中HA效价达到9lg2(25μl)。MDCK-sus细胞各种生长特性表明,其适于H9亚型禽流感的繁殖,可以为采用悬浮细胞培养禽流感疫苗的大规模工业化生产提供技术支持。展开更多
文摘2010年4月至11月,江苏等地鸭、鹅发生了一种以产蛋率、采食量显著下降,出现脑炎样神经症状为特征的传染病。对发病鹅进行剖检观察,鸭胚尿囊腔途径接种发病鹅病料分离病原,电镜观察病毒粒子。对健康鹅接种分离病毒进行动物回归试验。在病毒核酸背景未知的情况下,应用非序列依赖性单引物扩增法结合DNA酶处理（DNase-sequence independent single primer amplification,DNase-SISPA）对病原基因进行扩增,并在此基础上设计了1对特异性引物对病毒基因进行PCR扩增。剖检结果发现病鹅的脑膜、肺脏、肝脏、心脏、卵巢等多器官出血,脾脏肿大坏死。含毒鸭胚尿囊膜超薄切片电镜观察显示：病毒粒子直径为50~60 nm。动物回归试验成功复制出该病并分离到病毒。应用DNase-SISPA方法发现了3个病毒相关基因片段,经序列比对分析,与黄病毒属（Flavi-virus）坦布苏病毒（Tembusu virus）基因序列有很高的同源性,分别为96%、88%、93%。据此设计特异性引物扩增出一段985 bp基因片段,该片段与黄病毒属坦布苏病毒E基因的核苷酸同源性为91%,氨基酸同源性为97%。将分离的鹅黄病毒毒株命名为Goose/Jiangsu/804/2010（简称JS804）。研究结果表明：此次鸭、鹅新发疫病的病原为一种新的黄病毒。
文摘采用分批式培养方法研究了Marc-145细胞微载体悬浮培养及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖工艺。结果表明,在3 g/L的微载体用量下,采用1 ml 3×105个细胞的初始接种密度及培养至第3 d进行换液操作工艺可以获得最佳的Marc-145细胞生长效能。采用感染复数为0.05的接毒比例及接毒后48 h收获毒液可获得最高的PRRSV增殖效价。在5 L反应器中重复验证上述工艺,获得较为稳定的试验结果,最大细胞密度均可高于1 ml 2×106个细胞,PRRSV的增殖效价均高于108.0TCID50/ml。为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。
文摘本研究通过筛选驯化的MDCK细胞获得无血清悬浮生长MDCK细胞(命名为MDCK-sus),测定该细胞的比生长速率、细胞活力及细胞最大生长密度等生长特性,采用间接免疫荧光法和流式细胞仪检测法比较母本MDCK细胞与MDCK-sus细胞流感病毒受体[唾液酸-α-2,3-半乳糖糖链受体(SAα2,3Gal)和唾液酸-α-2,6-半乳糖糖链受体(SAα2,6Gal)]的丰度,用荧光定量PCR检测比较细胞中α-2,3唾液酸转移酶(ST3Gals)基因与α-2,6唾液酸转移酶(ST6Gals)基因表达水平的差异,通过测定流感病毒血凝HA效价比较母本MDCK细胞与MDCK-sus细胞对流感病毒的增殖能力。结果表明,经驯化获得的适合无血清悬浮培养的MDCK-sus细胞,细胞密度最高可达1ml 3.6×106个细胞,最大比生长速率可达1 d 0.56。MDCK-sus细胞表面流感病毒受体SAα2,3Gal的丰度明显高于母体MDCK细胞,ST3Gal转移酶基因表达水平也明显高于母本MDCK细胞。MDCK细胞驯化后增殖禽流感病毒的能力增强,其中H9亚型禽流感病毒AH1102株在MDCK-sus细胞中HA效价达到9lg2(25μl)。MDCK-sus细胞各种生长特性表明,其适于H9亚型禽流感的繁殖,可以为采用悬浮细胞培养禽流感疫苗的大规模工业化生产提供技术支持。
