应用PCR和琼脂扩散检测禽白血病病毒的比较

根据已报道禽白血病病毒基因序列设计了一对引物 ,用于扩增禽白血病病毒群特异性抗原基因p2 7片段 ,用RT -PCR方法从人工感染禽白血病病毒的SPF鸡羽髓中扩增出预期大小的扩增产物 ,表明感染率为10 0 %。同时 ,应用琼脂扩散试验对相同的人工感染SPF鸡羽髓进行检测 ,结果阳性率为 73%。检测结果表明 ,PCR方法比琼脂扩散试验更为敏感、特异 ,但PCR方法不适用于现场大面积应用 ,可应用于实验室禽白血病的检测工作。

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因克隆与序列分析

自感染RHDV致死的兔肝脏组织中提纯病毒 ,提取病毒总RNA ,以RT_PCR方法扩增得到RHDVVP6 0基因全长片段 ,克隆到T载体中 ,经酶切分析及PCR鉴定后进行序列测定。同一毒株不同克隆产物进行 3次测序 ,测序结果已输送到GeenBank中 (注册号为AF45 376 1)。将测得序列与GeneBank中记录的RHDV不同分离株进行比较。比较结果表明 :各毒株间核苷酸的同源性为 91%～ 98% ,氨基酸同源性为 94%～ 99% ,氨基酸变异多发生在高变区 ,进一步证明了毒株的高度保守性 ,为明确我国RHDV地方株VP6 0蛋白的分子特征。

兔出血症抗体间接ELISA检测试剂盒的研制与初步应用

目的建立检测兔病毒性出血症（RHD）血清抗体的间接ELISA方法并组装成试剂盒，进行初步应用。方法通过差速离心和蔗糖密度梯度离心提纯RHDV病毒粒子作为包被抗原，优化反应条件和筛选试剂，建立间接ELISA检测方法，组装试剂盒并对其总体性能进行评价。结果试剂盒敏感性为血凝抑制试验的4～32倍，重复性和特异性良好，保质期为4℃ 3个月。对105份兔血清进行随机检测，与血凝抑制试验的复核率为95％。结论本试剂盒可以在检测和科研中初步应用。

兔出血症病毒VP60蛋白的原核表达及检测方法初步应用

VP60是免出血症病毒（RHDV）的主要结构蛋白，也是免疫原性蛋白，与诱导抗病毒免疫反应直接相关，因而也是检测用首选抗原。本实验在原核系统pPRoEX^TMHTa中表达了VP60基因，经SDS—PAGE电泳中可见表达带。Western blot鉴定结果表明，重组蛋白可被RHD阳性血清特异性识别，具有相应的抗原性。将表达蛋白经SDS—PAGE电泳切胶纯化后免疫BALB／c小鼠，免疫血清经全病毒ELISA检测，效价可达1：3200-1：6400，经琼脂扩散试验检测效价为1：16。重组蛋白纯化、复性后，作为包被抗原初步建立了间接ELISA方法，并检测了48份免血清样品，与全病毒间接ELSIA试剂盒检测结果相同。实验结果表明．用原核系统表达的VP60蛋白．可以作为RHD新型诊断试剂的候选抗原。

转大麻哈鱼生长激素基因鲤生态安全性检测与分析

评价了转大麻哈鱼(Oncorhynchus Suckley)生长激素基因鲤生态安全性问题及研究转基因鱼对天然野生鲤群体遗传污染程度。通过RAPD和SSLP方法,用265个RAPD标记和35对鲤的微卫星标记对受杂交鲤污染的哈尔滨江段黑龙江鲤群体、未受污染的抚远江段黑龙江鲤群体及模拟转基因鲤占普通鲤群体的1%和10%比例获得繁殖子代等实验群体的DNA样本进行全基因组扫描统计分析得出结论,即转基因鲤占普通鲤群体1%时对普通群体的基因污染程度是微乎其微的,远远低于杂交鲤对野生群体基因污染,转基因鲤占普通鲤群体10%时对普通鲤遗传背景的影响稍有升高,但仍然远远低于杂交鲤对野生群体基因污染程度。总之,在现有的检测技术条件及有效的监控条件下,与杂交鲤相比转基因鲤对鲤野生群体的遗传背景的影响是微弱的,而外来种和杂交种则对生态环境有严重威胁。

禽白血病劳斯肉瘤病毒衣壳蛋白P27基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

从人工感染禽白血病劳斯肉瘤病毒的SPF鸡胚成纤维细胞(CEF)培养物中提取RNA,通过RT＿PCR方法扩增出720bp的gagP27基因片段,克隆至pMD18＿T载体,酶切鉴定后进行序列测定和分析,表明该片段编码序列与国外RSV分离株(JO2342)的同源性达97 3%。将该片段亚克隆至pGEX＿6P＿1原核表达载体,转化受体菌BL＿21,经IPTG诱导表达,12%SDS＿PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色,证明目的基因得到高效表达,所表达蛋白是大小为56kD的融合蛋白,占菌体总蛋白的23%。表达产物经GlutathionSpharose4B树脂亲和层析法纯化后,每100mL菌液最终可获得5mg重组P27蛋白,蛋白纯度在90%以上。用兔抗自然P27蛋白阳性血清进行Westernblot检测,表明重组P27蛋白有抗原反应活性。用纯化的重组P27蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,产生的抗体与禽白血病全病毒抗原可以发生特异性反应。所制备的重组P27蛋白和多克隆抗体将为禽白血病的诊断及ELISA试剂盒的研制奠定基础。

SARS动物模型的研究

利用分离的SARS CoV毒株BJ 0 1,经滴鼻等途径感染大鼠、豚鼠、黑线仓鼠、白化仓鼠和雏鸡等 5个种属的动物 ,筛选对SARS易感的小动物。在此基础上 ,选择食蟹猴和恒河猴进行SARS的人工感染实验 ,评价其作为SARS动物模型的可能性。结果表明 ,大鼠、豚鼠、黑线仓鼠、白化仓鼠和雏鸡等动物对SARS均不易感 ,感染后未观察到任何的临床及病理学改变 ,不过从感染 2周后的大鼠和豚鼠的肺和咽等组织样本中检测到了的特异的核酸 ,提示SARS CoV能够在这两种动物的体内复制。从感染猴子的分泌物和脏器中分离出了病毒 ,证明SARS CoV也能够在猴子体内复制。临床和病理组织学检查结果显示 ,SARS病毒接种食蟹猴和恒河猴后 ,可以引起所有实验猴发生间质性肺炎 ,其病理学改变与人类感染SARS病毒后肺部病变近似 ,但病变的严重程度比较人类的轻得多 ,除此之外无任何其它的明显的临床表现及组织病理学改变 ,按照动物模型的指标判断食蟹猴和恒河猴并不是SARS的理想动物模型 ,不过在目前尚没有更理想的动物模型情况下 ,以间质性肺炎为病理学检查指标 。

禽白血病研究进展

禽白血病是由反转录病毒科禽白血病 /肉瘤病毒群病毒 ( AL /SV)引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称 ,感染率高 ,发病率低。 AL /SV可通过水平和垂直两种方式传播感染鸡群。鸡群感染此病会导致严重的经济损失 ,一是产生肿瘤 ,导致鸡的死亡 ;二是生产指标下降。但至今人类还不能有效的预防和治疗本病 ,控制禽白血病的主要方法是通过病原检测 ,淘汰阳性鸡 ,净化种群。国内外相继建立了多种检测禽白血病的方法 ,其中 EL ISA法能高效的检测到蛋清中的 AL SV抗原 ,具有敏感、简便、快捷、适用于大面积检测的特点 ,在种群净化中得到了广泛的应用 ,但 EL ISA诊断试剂盒在我国还未实现商品化。随着我国养禽业的发展以及科研、生产和检疫的需要 ,建立高效、实用的禽白血病检测方法 ,研究和控制本病将是今后的重要任务。文章就禽白血病的病原、流行病学、种群净化及防制等方面的研究进展进行了综述。

生物安全实验室通风系统HEPA过滤器原位消毒及检漏方案

结合我国高等级生物安全实验室建设的现状及相关标准要求,介绍了HEPA过滤器扫描检漏法、效率检漏法及气体消毒法,探讨了室外箱式HEPA过滤器单元、室内HEPA过滤器单元及风口型HEPA过滤器单元的原位消毒及检漏技术方案。

高等级生物安全实验室中Ⅱ级B2型生物安全柜气流控制模式研究

对22个高等级生物安全实验室项目共计79台Ⅱ级B2型生物安全柜的气流控制模式进行了统计分析,介绍了变送定排、定送变排和变送(双稳态)变排控制模式及其可能存在的问题,并对部分环节提出了解决思路。对定送变排、安全柜排风等量切换模式进行了探讨和实证研究,通过比较分析,认为该模式投资少,具有较好的适用性和稳定性。

不同H5N1亚型禽流感病毒在豚鼠体内的复制和传播能力评估

本研究以豚鼠作为哺乳动物模型,评价了6株H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的复制和水平传播能力。经滴鼻接种后,检测到6株病毒中有5株病毒在豚鼠上呼吸道和下呼吸道复制,病毒滴度为0.8LogEID50/mL～3.5LogEID50/mL(或g),豚鼠在感染后第2d至第10d可排出病毒。另外一株病毒A/duck/GX/22/02则仅能在豚鼠的下呼吸道低水平复制。在传播实验中,6株病毒中只有A/duck/GX/35/01能够在豚鼠间水平传播。上述研究结果表明,豚鼠适用于作为高致病性AIV哺乳动物水平传播的模型,而且H5N1亚型AIV在哺乳动物间的水平传播能力不同。本研究为进一步研究AIV在哺乳动物间水平传播的分子机制奠定了良好的基础。

鸡副嗜血杆菌(HPG-A221、C668)对10个家系BWEL-SPF鸡胚的感染试验

用鸡副嗜血杆菌国际标准株（HPGA-221、C668）分别接种1-10个家系的BWEL-SPF鸡6日龄鸡胚，观察攻毒后16-30小时鸡胚死亡的情况。结果，第5、7、8家系死亡率为100％;1、4、6家系死亡率为90％;2、3、9、10家系死亡率为80％-85％，10个家系HPG平均死亡率为90.5％。对照组（HWL-SPF鸡胚）平均死亡率为90％。从而评估BWEL-SPF鸡群每个家系对鸡副嗜血杆菌（HPG-A221、C668）的敏感性。

仙台病毒黑龙江省地方株的分离与鉴定

目的自本省普通级实验动物中分离并鉴定出仙台病毒地方毒株,为建立仙台病毒血清抗体检测方法奠定基础。方法通过鸡胚尿囊腔传代自普通级小鼠肺脏分离病毒,经血凝实验、血凝阻断实验和结构基因序列测定对分离得到的病毒进行鉴定;大量繁殖病毒并通过蔗糖密度梯度离心纯化,免疫动物制备阳性血清,用标准试剂盒检测阳性血清效价。结果自150份小鼠肺脏分离到2株有血凝性的病毒,经形态学、血清学和结构基因序列测定鉴定为仙台病毒,命名为SV-HLJ。SV-HLJ与标准毒株Fushimi核蛋白基因(N)的核苷酸、氨基酸同源性分别为99·6%和99·0%。结论分离并鉴定出了仙台病毒黑龙江省地方毒株,为检测试剂盒的研制奠定了基础。

犬瘟热病毒A株N蛋白基因编码区的克隆与序列分析

本试验对犬瘟热病毒 ( CDV) A株 N蛋白基因编码区进行了克隆与序列分析。结果表明 :CDV A株 N蛋白基因编码区核苷酸序列与Onderstepoor株。 A75/ 1 7株及 2 544/ han95株的同源性分别为 97.5%、94%及 93 % ,编码氨基酸的同源性分别为 98%、97%和 96%。

黑龙江野鲤细菌人工染色体基因组文库构建

为了开展鲤基因组研究,深入研究遗传连锁图谱遗传标记的定位及数量性状的定位和克隆,并最终为分子育种提供服务,本实验构建了鲤的BAC基因组文库。通过采集黑龙江野鲤(Cyprinus caxpio haematopterus)全血细胞制备琼脂糖凝胶包埋块的方法获得了高分子量(HMW)DNA。通过BamHⅠ部分酶切和PFGE电泳分离选择获得100～300kb的DNA片段,用电洗脱和透析的方法对产物进行浓缩和纯化。纯化的HMWDNA连接到大小为7.2kb的克隆载体pEZBAC上。为了评估构建的文库的质量使用一系列引物对文库进行了验证。本研究首次构建黑龙江野鲤的BAC文库,该库含有46656个克隆,插入片段大小在50～300kb之间,平均大小在100kb左右,覆盖鲤全基因组2.45倍,调取任一基因的概率为90%左右。获得的BAC克隆,保存在378块96孔板和27块384孔板中。建立了高效稳定的2步3维PCR筛选黑龙江野鲤BAC文库的方法。本实验为今后进一步进行鲤的功能基因定位及染色体步行、BAC-FISH等研究工作打下重要基础。

CAV对BWEL-SPF鸡的致病性试验及毒价测定

本实验用鸡传染性贫血病病毒标准株 (CAV和Cux_1)和国内分离株 (CAVM990 5CAV和H990 6 )分别对BWEL_SPF雏鸡 1～ 7家系进行 1日龄和 1月龄攻毒的致病性试验。 1日龄雏鸡接种CAVCux_1毒株 ,12天后观察到感染鸡的喙、腿、冠和爪等部位颜色变浅 ,16天剖杀 ,观察剖检变化 ,并进行IFA和PCR检测 ,确定感染率和CAV毒价。结果CAVCux_1株对 1日龄BWEL_SPF雏鸡半数感染量 (CID50 )为 10 4 .3 / 0 .2ml。同时检测到CAVCux_1株对 1月龄BWEL_SPF雏鸡发病率为 6 0 %;CAVM990 5和CAVH990 6对 1日龄BWEL_SPF雏鸡发病率为 10 0 %,死亡率为 40 %、2 0 %。

HA 226/228双位点突变对H5N1禽流感病毒受体结合特异性和致病性的影响

禽流感病毒(AIV)主要识别SAα2,3Gal受体,而人源流感病毒主要识别SAα2,6Gal受体。本研究利用糖链受体结合特性检测方法检测表明,H5N1 AIV A/duck/Guangxi/35/2001(DK/35)可以同时识别SAα2,3Gal和SAα2,6Gal受体,然而HA 226位谷氨酸(Q)到亮氨酸(L)和228位甘氨酸(G)到丝氨酸(S)的双突变,可以导致DK/35更倾向于识别SAα2,6Gal受体。对BALB/c小鼠致病性试验显示,突变病毒株(rDK/35(Q226L/G228S))对小鼠的致病力比野毒株弱,其MLD50为4.7 log10EID50,而DK/35为1.8 log log10EID50。本研究表明H5N1 AIV通过突变可以获得优先与SAα2,6Gal受体特异性结合的能力,为H5N1 AIV的监测预防和对公共卫生风险评估提供一定的参考依据。

禽脑脊髓炎病毒VP1基因的克隆及表达

应用RT-PCR方法,扩增出AEV Van-roekel株结构蛋白基因VP1,测序结果表明VP1基因全长810 bp,编码270个氨基酸;和AEV 1143株相比,核苷酸同源性为94.2%,氨基酸同源性为99.26%。将VP1基因定向克隆到pGEX-6p-1载体谷胱苷肽转移酶基因的下游,并把重组质粒转入宿主菌BL21中,经IPTG诱导后,VP1基因得以表达。表达产物经SDS-PAGE和Western Blot鉴定,确定表达的融合蛋白大小约为58 Ku,且具有良好的反应原性。将表达产物纯化后免疫试验兔,琼脂扩散试验显示免疫血清能与禽脑脊髓炎琼脂扩散标准阳性抗原呈特异反应,表明重组VP1蛋白保留了天然蛋白的部分活性。

HVT国内株的分离鉴定

用来自国内某火鸡饲养场的健康火鸡血白细胞 ,接种于鸡胚成纤维细胞 ,分离到一株火鸡疱疹病毒的野毒—SY8_2。电镜下可观察到分离株SY8_2的鸡胚成纤维细胞培养物中存在典型的火鸡疱疹病毒粒子 ;分离株SY8_2的细胞培养物经卵黄囊途径接种 4日龄鸡胚 ,14天后在绒毛尿囊膜上形成痘斑 ;用分离物SY8_2细胞培养物接种 1日龄SPF雏鸡 ,感染雏鸡可产生病毒血症 ,并能从感染雏鸡的血液白细胞中重新分离到病毒 ;经 2个月的临床观察人工感染鸡无不良反应 ,剖检无任何病理解剖学变化 ;用HVT特异性单克隆抗体L78(3型 )做间接免疫荧光染色试验证实分离株SY8_2为MD血清 3型病毒—HVT。