未成熟卵母细胞体外成熟不同培养结局的多因素分析

目的应用多因素分析探讨人未成熟卵母细胞进行体外成熟(IVM)培养后不同培养结局(卵母细胞成熟和D3可利用胚胎)的影响因素。方法收集2020年6月至2023年6月于中山市人民医院生殖中心进行常规助孕治疗、有未成熟卵母细胞剩余患者的临床资料。按照纳排标准共纳入45例患者的207枚未成熟卵母细胞,使用商品化IVM培养液和自配IVM培养液进行IVM培养。培养24 h和48 h后,观察卵母细胞成熟情况。当卵母细胞成熟后,行常规卵胞浆内单精子注射(ICSI)、胚胎培养和胚胎观察,记录D3可用胚胎数。并采用Logistic回归分析不同培养液、女性年龄、不孕因素、体质量指数(BMI)等因素对卵母细胞成熟率和D3可用胚胎率的影响。结果纳入研究的207枚未成熟卵母细胞进行IVM培养后,获得成熟卵母细胞159个,成熟率为76.81%;获得D3可用胚胎73个,D3可用胚胎率为35.27%。不同IVM培养液、女方年龄、促排卵方案、BMI、基础FSH(bFSH)、基础LH(bLH)、FSH/LH比值、抗苗勒管激素(AMH)、不孕年限、不孕类型、不孕因素及未成熟卵状态的卵母细胞成熟率无显著性差异(P>0.05)。使用商品化IVM培养液的D3可用胚胎率为42.86%,显著高于使用自配IVM培养液的27.45%(P<0.05);不同女方年龄、促排卵方案、BMI等因素的D3可用胚胎率无显著性差异(P>0.05)。多因素Logistic回归分析显示,IVM培养液、女方年龄等都不是卵母细胞成熟的独立影响因素;而IVM培养液和女方年龄是D3可用胚胎率的独立影响因素(P<0.05)。结论经HCG刺激的未成熟卵母细胞进行IVM培养时,使用商品化IVM培养液比使用自制培养液可能更有利于后续D3可利用胚胎的形成;且随着女方年龄增加,IVM成熟卵母细胞来源的D3可用胚胎率下降。

小鼠附睾特异性辅脂酶的原核表达及其抗体的制备

目的:利用原核表达系统重组表达小鼠附睾特异性辅脂酶(meClps),并制备抗meClps抗体。方法:通过生物信息分析meClps蛋白结构,Oligo 6设计引物,PCR法从小鼠附睾cDNA中扩增meClps全长序列并克隆到pMD19-T载体中。将含meClps序列pMD19-T载体通过PCR扩增成熟肽区段序列,重组到pET-21b原核表达载体上,经菌落PCR及测序鉴定后,转化到表达菌株E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导蛋白表达后用Tricine-SDS-PAGE和Western blotting检测重组meClps的表达。包涵体沉淀经浓度为2 mol/L尿素洗涤,Tricine-SDS-PAGE分离、染色、脱色,切下目的条带用生理盐水浸泡、磨碎与弗氏佐剂混合后免疫新西兰大白兔获取免疫血清,Western blotting检测抗体与meClps反应。结果:在原核表达系统成功重组表达meClps,目的蛋白主要以包涵体形式存在,制备了高效价的兔抗meClps抗体。结论:成功建立meClps的原核表达系统和获得兔抗meClps抗体。

宫腔内人工授精早期妊娠丢失的Nomogram预测模型建立及其影响因素分析

目的基于临床数据分析宫腔内人工授精(IUI)后早期妊娠丢失的影响因素,根据影响因素建立Nomogram预测模型,用于评估IUI后早期妊娠丢失的风险。方法回顾性分析2014年1月至2022年7月于本院生殖中心行夫精IUI治疗的不孕症患者的临床资料,根据妊娠情况分为早期妊娠丢失组(51个周期)和继续妊娠组(170个周期),比较两组患者之间的基础资料。将70%患者随机分配至建模组,其余30%被分配到验证组,使用Logistic回归分析IUI后早期妊娠丢失的影响因素,并根据影响因素建立Nomogram预测模型;绘制ROC曲线,评估预测模型对IUI后早期妊娠丢失的的预测效能。结果早期妊娠丢失组和继续妊娠组在FSH/LH比值和精液处理方法的差异有统计学意义(P<0.05)。建模组单因素分析显示,对于早期妊娠丢失具有统计学意义的预测因素是精液处理方法、FSH/LH比值和男方乙肝病毒携带状态(P<0.05)。建模组多因素Logistic分析显示,具有统计学意义的预测因素是精液处理方法、FSH/LH比值、不孕类型和男方乙肝病毒携带状态(P<0.05)。在建模组中,预测模型的ROC曲线下面积(AUC)为0.701[95%CI(0.600,0.801)]。验证组显示出良好的区分度,AUC为0.658[95%CI(0.484,0.833)]。结论本研究建立了IUI后早期妊娠丢失的Nomogram预测模型;通过该预测模型,可以个性化地评估IUI早期妊娠丢失的风险。

体外受精中9号染色体臂间倒位对卵裂期胚胎发育的影响

目的 :探讨9号染色体臂间倒位对卵裂期胚胎发育的影响。方法 :回顾性分析9号染色体臂间倒位不孕夫妇14例共18个治疗周期的119个正常受精卵,与染色体正常不孕夫妇35例共进行35个治疗周期的303个正常受精卵,在发育速度、胚胎评级、Day3胚胎碎片方面的差异。结果 :两组胚胎比较,其发育速度、胚胎评级、Day3碎片方面的各项指标的差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:9号染色体臂间倒位对卵裂期胚胎发育没有产生不良影响。

Galectin-3在雌性小鼠生殖系统中的表达及脂多糖的影响

目的:研究galectin-3在雌性小鼠生殖系统的表达情况,利用小鼠生殖道感染模型研究galectin-3在女性生殖道感染过程中的可能作用。方法:采用RT-PCR的方法初步鉴定小鼠生殖系统各组织中的galectin-3 mRNA的表达水平,通过阴道黏膜注射LPS不完全弗氏佐剂乳液建立小鼠的生殖道感染模型,免疫组化对ga-lectin-3蛋白在雌性小鼠生殖系统的表达进行定位分析。结果:在正常小鼠的子宫、阴道、输卵管及卵巢中都能够检测到galectin-3 mRNA的表达。Galectin-3蛋白主要表达在生殖道黏膜的上皮细胞表面和子宫腺。经LPS刺激后,galectin-3蛋白在阴道、子宫颈及子宫体的表达水平提高(P<0.05),尤其是刺激后24h子宫颈中galectin-3的表达量增加最多(P<0.01)。结论:LPS刺激能增加小鼠生殖道中galectin-3的表达,galectin-3在生殖道抗感染中可能发挥重要的作用。

构建重组人CatSper1特异抗原原核表达载体

目的:构建重组人Catsper1特异抗原(含胞外区、钙选择孔区和破伤风类毒素通用T细胞表位TT580-599)原核表达载体并表达重组抗原。方法:设计引物,以RT-PCR法扩增人CatSper1的整个跨膜区DNA片段,利用重叠PCR方法合成重组人CatSper1特异抗原DNA片段,并插入到pET-21b和pET-21b-Trx(硫氧还蛋白)的原核表达载体。测序鉴定后转化工程菌株E.coliBL21(DE3)进行诱导表达,并纯化表达的重组蛋白。用Tricine-SDS-PAGE和Western blotting分析重组蛋白的表达情况。结果:成功构建pET-21b-Catsper1特异抗原和pET-21b-Trx-Catsper1特异抗原原核表达载体,并在BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白。Tricine-SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明,已获得重组人CatSper1特异抗原包涵体和纯化的可溶重组Trx-Catsper1特异抗原。结论:成功在原核表达系统表达重组人Catsper1特异抗原。

构建表达猪卵透明带抗原(pZP3α)的重组乳酸杆菌

目的:构建表达猪卵透明带蛋白(pZP3α)的重组乳酸杆菌。方法:用PCR方法扩增得到短小乳酸杆菌染色体中的S-层蛋白的信号肽序列和猪卵透明带的pZP3α基因,并依次克隆到乳酸杆菌整合型表达质粒pIlac的lac启动子下游,得到质粒pIlac-pZP3α。将质粒pIlac-pZP3α电穿孔转化干酪乳酸杆菌(L.casei CECT5276),挑选转化后的耐药菌落,在含5μg/mL红霉素的MRS培养基中培养,抽提其基因组DNA做模板,PCR鉴定验证pZP3α基因是否整合到乳酸杆菌的基因组中。筛选重组菌在无红霉素选择压力下传代培养直至发生第2次重组使红霉素抗性基因消失。结果:酶切与测序结果表明信号肽和pZP3α基因正确克隆到载体pIlac中;PCR鉴定证实pZP3α基因成功重组到乳酸杆菌的基因组中,培养50 d后重组乳酸杆菌抗性消失,用斑点免疫印迹化学发光法检测到经终质量分数为0.75%乳糖诱导后的上清中有pZP3α蛋白分泌。结论:成功构建表达pZP3α的重组乳酸杆菌,pZP3α在乳酸杆菌中得到了稳定的、分泌表达。

季节因素对男性精子受精功能的影响

目的通过分析广东中山地区不同季节不孕门诊男性患者精子受精功能的变化,为自然受孕及辅助生殖治疗的最佳受精时机提供参考。方法选取2019年3月至2021年5月中山市人民医院不孕门诊采集的精液标本7109份作为研究对象,其中春季(3月至5月)2772份,夏季(6月至8月)1885份,秋季(9月至11月)1579份,冬季(12月至次年2月)873份。对所有精液标本进行精液常规分析,其中414份标本进行精子顶体酶活性定量测定,275份进行诱发精子顶体反应测定,449份进行精子-透明质酸结合测定。结果前向运动(PR)精子数量夏季[(86.8±79.4)×10^(6)个]明显少于春季[(95.11±78.9)×10^(6)个]、秋季[(94.4±81.7)×10^(6)个]、冬季[(100.9±81.5)×10^(6)个],差异具有统计学意义(P<0.05),而秋、冬、春季之间差异无统计学意义(P>0.05);精子顶体酶定量测定值春季[(79.7±30.4)μIU/10^(6)精子],高于夏季[(74.1±34.7)μIU/10^(6)精子]、秋季[(72.4±33.9)μIU/10^(6)精子]、冬季[(71.5±33.1)μIU/10^(6)精子],差异具有统计学意义(P<0.05),而夏、秋、冬季之间差异无统计学意义(P>0.05);诱发精子顶体反应测定值春季[(44.0±14.1)%]和冬季[(46.8±17.2)%]高于夏季[(38.1±11.6)%]和秋季[(41.5±8.7)%],差异具有统计学意义(P<0.05),而春季和冬季及夏季和秋季之间差异无统计学意义(P>0.05);精子-透明质酸结合测定值春季[(57.3±12.3)%]和冬季[(57.4±12.2)%]高于夏季[(49.2±15.3)%]和秋季[(51.8±14.5)%],差异具有统计学意义(P<0.05),而春季和冬季及夏季和秋季之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论季节因素对不孕门诊患者精液常规参数及受精功能有影响。整体而言,春、冬季的精子受精功能比夏、秋季要更好,春、冬季是临床受孕的好时机。

无油安全套对精子受精功能与DNA碎片指数检测结果影响的观察

目的:观察无油安全套对精子的受精功能和精子DNA碎片指数(DFI)检测结果的影响。方法:实验组在无油安全套中加入1.0ml液化精液,置于振荡器轻柔振荡5min后取出,转移至5ml离心管,15min后检测精子活力,随后立即检测精子顶体酶活性、精子顶体反应率及DFI,并与未与无油安全套接触的对照组精液进行比较。结果:实验组精子活力(58.7±12.4)%,低于对照组(63.6±11.4)%(P<0.05);顶体酶活性(102.0±26.3)μU/106高于精子较对照组(84.6±23.0)μU/106(P<0.05);顶体反应率(40.7±14.8)%低于对照组(48.4±15.8)%(P<0.01);DFI结果两组无差异(P>0.05)。结论:进行精子活力、精子顶体酶活性及精子顶体反应检测时不建议使用无油安全套收集标本。

TPO在COH/dhfr-中的表达及生物活性测定

目的:研究获得高效表达重组蛋白TPO-His的哺乳动物表达系统稳定细胞株。方法:采用overlap PCR拼接得到带有TPO信号肽的TPO N-端功能区序列;构建重组表达载体pCDNA3.1-TPO-His,然后将其与pSV2-dhfr载体磷酸钙法共转哺乳动物表达系统细胞系COH/dhfr-,经过G418、MTX及条件培养基多重压力筛选得到高效表达重组蛋白TPO-His的稳定细胞株;通过采用GIEMSA法检测TPO刺激UT-7/EPO-Mpl细胞的分化作用来测试重组蛋白TPO-His的生物活性。结果:经过多重压力筛选获得高效稳定分泌表达目的蛋白的细胞株CHO(dhfr-)/pCDNA3.1-TPO-His,其表达量可达2.8μg/106cells/24h,纯化蛋白具有较高的生物活性。结论:研究获得具有高效分泌表达目的蛋白的稳定细胞株,其表达产物TPO-His具有较高的生物学活性。

精子形态可否预测精子其他参数和受精结局

目的：探讨精子形态在辅助生殖治疗中对选择授精方法时有否预测价值和意义。方法回顾性分析2012年6月至2015年2月接受辅助生殖治疗的1951周期患者精液资料，根据《WHO人类精液检查与处理实验室手册》（第五版）精子正常形态率参考值下限为4%，将患者的精子正常形态率分成3组：A组＜1.0%470周期，B组1%-4% 562周期，C组≥4% 919周期，分别采用常规体外受精（IVF）或卵胞浆内单精子注射（ICSI）以及IVF受精失败后补救ICSI（RICSI）授精方式，比较3组精子正常形态与其他精液参数相关性，与授精方式、受精率、优质胚胎率的关系。结果除了顶体酶外，精子浓度、活力、前向运动率、DNA完整率在3组形态间都差异极显著（P＜0.01），而且它们与精子正常形态呈显著的正相关；授精方式上3组的IVF比例分别是72.3%、86.7%、96.8%，ICSI组27.7%、13.3%、3.2%，3组间授精方式差异极显著（P＜0.01），RICSI比例也随着精子正常形态率升高而降低；受精结局上，只有IVF组3组形态间受精率（67.0%、70.0%和79.6%）差异极显著（P＜0.01），且和精子正常形态率趋势一致；胚胎质量反映在不同授精方式上趋势各有不同。结论精子正常形态与其他大部分的精液参数有正相关性，影响IVF的受精率，故在辅助生殖治疗中对授精方式选择有一定指导意义。

猪卵透明带3α重组腺病毒的构建及纯化

目的构建猪卵透明带3α(pZP3α)重组腺病毒,并包装与纯化病毒,为研究猪ZP3α重组腺病毒避孕疫苗奠定基础。方法将pZP3α基因克隆至穿梭质粒pShuttle,重组穿梭质粒pSshuttle-pZP3α再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-5共转化大肠杆菌BJ5183,筛选重组腺病毒质粒pAd-pZP3α,脂质体法转染HEK293A细胞,包装并扩增病毒至第4代。收集重组病毒颗粒,经两轮氯化铯密度梯度离心纯化,紫外吸收法测定总病毒颗粒数(VP),并计算病毒的颗粒性滴度,空斑形成试验测定病毒的感染性滴度。以MOI为10的病毒剂量感染HeLa细胞,PCR鉴定插入病毒的目的基因,斑点免疫印迹法鉴定目的蛋白的表达。结果pZP3α基因成功插入病毒基因组,pZP3α蛋白能在病毒感染的HeLa细胞中正常表达。病毒的颗粒性滴度约为1.3×1011VP/ml,感染性滴度约为3×109PFU/ml。结论已成功构建猪ZP3α重组腺病毒质粒pAd-pZP3α,包装并纯化了重组pZP3α腺病毒颗粒。