慢性乙型肝炎患者血清HBV基因分型

为了解长春市慢性乙型肝炎患者血清中的乙型肝炎病毒(HBV)基因型情况及其与临床特点的相关性,应用型特异性引物进行巢式PCR方法对长春市69例慢性乙型肝炎患者血清HBV进行基因分型检测。在69例血清标本中,B型10例(占14.5%);C型41例(占59.4%);B+C混合型8例(占11.6%);未分型的患者共10例(占14.5%)。C基因型患者的HBV-DNA定量、HBeAg阳性率明显高于B基因型患者(HBV-DNA:P<0.01;HBeAg:χ2=3.98,P<0.05),C基因型患者肝功检查指标谷丙转氨酶(ALT)和总胆红素(TB IL)均较B基因型患者高(P<0.01)。长春地区存在HBV B基因型、C基因型、B+C混合基因型及未分型,C基因型为优势基因,引起的肝脏活动性炎症较B基因型明显。

定点突变去除抗乙酰胆碱受体抗体的补体结合功能

[目的]制备无补体结合功能的免疫球蛋白样抗乙酰胆碱受体抗体,用于重症肌无力的特异性免疫治疗.[方法]应用定点突变技术,将致病性抗乙酰胆碱受体抗体IgG 637的重链CH 2区的第322位氨基酸进行K 322 A突变,获得的突变型抗体IgG 637/K 322 A基因经转化大肠杆菌XL 1-Blue进行增殖,测定序列证实为突变序列,转染哺乳类细胞CHO-k 1进行表达,其产物经酶联免疫吸附试验检测与补体C 1 q的结合活性.[结果]突变型抗乙酰胆碱受体抗体IgG 637/K 322 A不能与补体C 1 q结合,而对照抗体IgG 637可与补体结合.[结论]经定点突变,成功地获得了失去补体结合功能的抗乙酰胆碱受体抗体.

扶正解毒通络方对人肝癌HepG2细胞MMP-2、MMP-9表达及细胞侵袭作用的影响

目的:探讨扶正解毒通络方对肝癌HepG2细胞侵袭作用和基质金属蛋白酶(Matrix metallo proteinases,MMP)-2、MMP-9表达水平的影响及可能的作用机制。方法:CCK8实验检测扶正解毒通络方对HepG2细胞活性影响;Transwell侵袭实验检测扶正解毒通络方对HepG2侵袭能力的影响;ELISA法检测扶正解毒通络方干预HepG2细胞后MMP-2和MMP-9的表达水平。结果:CCK8实验结果显示,扶正解毒通络方对HepG2细胞意志呈剂量时间相关性。Transwell侵袭实验显示,2.65 mg/ml扶正解毒通络方对HepG2细胞侵袭力抑制率为52.45%(P<0.05)。ELISA检测结果显示,扶正解毒通络方干预后HepG2细胞上清液中MMP-2和MMP-9表达水平下降(P<0.05)。结论:扶正解毒通络方可以抑制肝癌HepG2细胞的生长和侵袭,其机制可能是通过下调MMP-2、MMP-9在肝癌细胞HepG2的表达。

IL-28B基因变异与丙型肝炎的易感性及其自然清除的关系

目的探讨IL-28B基因变异与丙型肝炎的易感性和丙型肝炎病毒(HCV)自然清除之间的关系。方法利用焦磷酸测序的方法对411例HCV感染者(男性225人,女性186人)及100例健康对照人群进行了IL-28B基因变异位点rs12979860的多态性检测;对HCV感染者进行病毒定量的检测,比较HCV感染人群和健康对照人群,慢性丙型肝炎(CHC)人群和丙型肝炎自愈人群IL-28B基因变异位点的差异以及不同基因型的携带者病毒定量的差异。结果中国健康人群IL-28B基因变异位点rs12979860的最小等位基因频率为6%,与日本人相近,与欧洲人群相差较大。SNP(rs12979860)位点的等位基因频率和基因型频率在HCV感染人群和健康对照人群之间差异无统计学意义(P=0.066;P=0.072),C/C基因型CHC人群病毒定量水平高于C/T基因型,二者之间差异有统计学意义(P=0.02);丙型肝炎自愈人群中C/C基因型和C/T基因型差异无统计学意义(P=0.64)。结论 CHC人群rs12979860 SNP基因型与健康人群表达无明显差别,该基因型(rs12979860)不是HCV的易感基因,其CC基因型并不能预测丙型肝炎发生自愈的病程。

2种消毒剂对HBsAg、HBV DNA灭活效果的试验观察

[目的]对复合季铵盐消毒剂与2%强化戊二醛破坏HBsAg及HBVDNA的效果进行对比观察。[方法]采用悬液定量法进行试验。[结果]在19℃～21℃,以含有效季铵盐成分5000mg/L该消毒剂水溶液对HBsAg悬液作用30min,6000mg/L时作用20min,10000mg/L时作用10min,可有效地破坏乙肝表面抗原的抗原性;以含有效季铵盐成分5000mg/L该消毒剂水溶液对含HBVDNA的血清作用30min,含有效季铵盐成分6000mg/L、10000mg/L分别作用10min,对HBVDNA的杀灭率达99.9%。2%强化戊二醛与HBsAg悬液作用10min,可有效地破坏乙肝表面抗原的抗原性,与含HBVDNA的血清作用10min,对HBVDNA的杀灭率达99.9%。[结论]复合季铵盐消毒剂与2%强化戊二醛均可将HBsAg及HBVDNA破坏,在消毒实践中可选择使用。

基于“毒损肝络”理论初步探讨扶正解毒通络方抗肝癌作用机制

目的探讨扶正解毒通络方对H22肝癌小鼠抗肝癌作用及对肝癌小鼠细胞因子的影响。方法将接种小鼠H22肝癌模型小鼠分为模型组、环磷酰胺组、扶正解毒通络方(FJTLF)高、中、低剂量组,另取10只小鼠为正常对照组、15d后处死小鼠,取血清、肝癌组织,观察扶正解毒通络方的抑瘤作用和对细胞因子白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平的影响。结果扶正解毒通络方高剂量对H22瘤体的可显著抑制肿瘤生长,FJTLF高剂量组能显著改善荷瘤小鼠血清IL-6和TNF-α水平(P<0.05)。结论 FJTLF对H22肝癌小鼠可有效抑制肿瘤生长,且可改善其炎症水平。

3种新型核苷类似物抗鸭乙型肝炎病毒活性及其对肝脏组织形态学的影响

目的:研究3种具有新型结构的核苷类似物在体内的抗鸭乙型肝炎病毒的活性及其对鸭肝脏组织形态学的影响,探寻新型高效核苷类抗乙型肝炎病毒药物。方法:实验组鸭分为2、10和50mg.kg-1 3个剂量组,分别给予核苷类似物030703、030605和030705,对照组鸭给予阿德福韦10mg.kg-1,每日1次,经口服连续给药30d。分别在给药前、给药第15天、第30天和停药后第2周时静脉采血,采用荧光定量PCR方法进行血清鸭乙肝病毒脱氧核糖核酸(DHBV DNA)检测,同时设DHBV DNA阳性和阴性对照组。实验结束后处死鸭,取肝脏,进行光镜下的病理组织形态学检查。结果:受试药物030703的高、中、低剂量组在给药后分别有3只(60%)、2只(40%)、1只(20%)鸭的DHBV DNA含量下降至原含量1/3,与阿德福韦对照组比较,高剂量组DHBV DNA含量差异有统计学意义(P<0.01),而中、低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。受试药物030605的高、中、低剂量组在给药后分别有4只(80%)、3只(60%)、1只(20%)鸭的DHBV DNA含量下降至原含量1/3,与阿德福韦对照组比较,高、中剂量组DHBV DNA含量差异均有统计学意义(P<0.01),而低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。受试化合物030705药物的高、中、低剂量组在给药后分别有3只(60%)、2只(40%)、0只(0%)鸭的DHBV DNA含量下降至原含量1/3,与阿德福韦对照组比较,高剂量组DHBV DNA含量差异有统计学意义(P<0.01),而中、低剂量组差异则无统计学意义(P>0.05)。所有测试药物高、中、低剂量各组干预后的鸭肝脏组织形态分别与病毒阳性对照组比较,炎症均有不同程度的减轻,与阿德福韦对照组的表现相似。结论:3种新型核苷类似物030703、030605及030705具有体内抗鸭乙型肝炎病毒的活性,并且能够不同程度地缓解鸭肝脏组织炎症,是一类高效的新型核苷类抗乙型肝炎病毒药物。

不同诱导条件对体外培养视网膜色素上皮细胞表达血小板源性生长因子A的影响

目的:血小板源性生长因子由多种细胞产生。为验证视网膜色素上皮细胞是血小板源性生长因子A的分泌细胞,在蛋白水平检测不同诱导条件对人视网膜色素上皮细胞表达血小板源性生长因子A的影响。方法:实验于2007-01/04在吉林大学第一临床医院传染科研究室完成,实验方法符合医学伦理学要求。①实验对象:人视网膜色素上皮细胞株(HRPED407)购自广州中山大学细胞库。②实验方法:分别应用体积分数为0.1的血清、50%巨噬细胞调理液、与单核细胞共培养的方法诱导视网膜色素上皮细胞,24h后撤掉各刺激因素继续培养。③实验评估:通过细胞免疫化学方法检测各种培养条件下血小板源性生长因子A在视网膜色素上皮细胞中的表达情况。结果:细胞免疫化学结果显示,有无诱导因素情况下,视网膜色素上皮细胞中血小板源性生长因子A的表达均呈阳性。结论:有无诱导因素情况下,视网膜色素上皮细胞均分泌血小板源性生长因子A,提示视网膜色素上皮细胞是血小板源性生长因子A的分泌细胞。

应用国产与进口试剂进行HBVDNA荧光定量检测的结果比较

目的评价国产试剂的实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)在检测乙型肝炎病毒(HBVDNA)中的临床应用。方法基于实时荧光定量应用瑞士罗氏公司的cobastaqman-48仪器和美国应用生物工程公司ABI-7300全自动系统,用国产试剂和进口试剂分别检测乙型肝炎患者血清中HBVDNA含量,比较国产试剂与进口试剂的偏倚及两者的相关性。结果进口试剂与国产试剂两次结果比较有显著差异(P<0.001),国产两次结果比较无差异(P>0.05)。结论本实验的实时PCR仪间的检测值有一定的差异,提示不同型号仪器的检测值不能相互取代,对于同一患者的HBV DNA定量监测及对抗病毒治疗疗效评价时,必须用同一型号的检测仪器(系统)。

人血小板源性生长因子A基因发夹结构小干扰RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的:血小板源性生长因子对诱发视网膜色素上皮细胞移行、最终导致增生性玻璃体视网膜病变起到了重要作用。构建人血小板源性生长因子A具有发夹结构小干扰RNA(shRNA)表达质粒,以观察其对人血小板源性生长因子A基因表达的沉默效果。方法:实验于2007-04/2007-07在吉林大学第一临床医院传染科研究室完成。根据血小板源性生长因子A基因mRNA序列,设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列,克隆到空载体pGPU6/GFP/Neo中,构建重组质粒,同时设计构建分别针对人GAPDH干扰质粒作为阳性对照,不针对任何特异基因的质粒作为阴性对照。通过酶切鉴定和测序验证阳性克隆。结果:经重组质粒筛选,重组质粒测序鉴定与设计的shRNA转录模板序列相同,均证实重组质粒构建成功。结论:利用RNA干扰技术路线可成功构建靶向人血小板源性生长因子A的发夹结构小干扰RNA表达载体。

一种新型MCC-478衍生物抗乙型肝炎病毒活性及体外毒性实验

目的:研究一种具有新结构类型的MCC-478衍生物030705的抗乙肝病毒活性和体外毒性。方法:实验组以不同浓度受试化合物030705(0.01、0.03、0.10、0.30和1.0μmol.L-1)、对照组以不同浓度阿德福韦酯(0.10、0.30、1.0、3.0和10.0μmol.L-1),分别作用于HepG2.2.15细胞,采用Southern blotting杂交法测定其对HBV DNA的抑制率,计算其50%抑制浓度(IC50)和90%抑制浓度(IC90)值,采用ELISA法测定不同药物浓度受试化合物030705对HBeAg分泌的抑制率。采用MTT法测定不同浓度受试化合物030705(10、30、100、300和1 000μmol.L-1)对HepG2细胞毒性,计算其50%致死浓度(CC50)值。采用Dotblotting法分别测定不同浓度受试化合物030705(0.10、1.0和10.0μmol.L-1)对HepG2细胞线粒体含量的抑制率;同时设相应浓度双脱氧胞苷(ddC)阳性药物对照组和仅加入培养基的阴性对照组。结果:受试化合物030705抑制HepG2.2.15细胞HBV DNA作用与阿德福韦酯对照组比较差异无显著性(P>0.05),显示其具有与阿德福韦酯相近的抗乙肝病毒活性。不同浓度受试化合物030705(0.01、0.03、0.10、0.30和1.0μmol.L-1)对HBeAg分泌的抑制率分别为5.94%、6.08%、6.32%、10.31%和12.49%,与阴性对照组比较差异均无显著性(P>0.05)。受试化合物030705对HepG2细胞毒性的CC50值为2 014μmol.L-1(>1 000μmol.L-1),属于低细胞毒性药物。阳性对照药物ddC在不同浓度下(0.10、1.0和10.0μmol.L-1),对HepG2细胞线粒体含量的抑制率分别为38.43%、46.51%、56.51%,与阴性对照组比较差异均有显著性(P<0.05)。相同浓度下受试化合物030705抑制率分别为7.00%、5.81%、5.78%,与阴性对照组比较差异均无显著性(P>0.05)。结论:受试化合物030705对HepG2.2.15细胞HBV DNA的抑制作用与阿德福韦酯的作用相近,对HepG2细胞毒性的CC50值2 014μmol.L-1,无明显线粒体毒性,是一种低毒、高效的新型核苷类抗乙肝病毒药物。

大鼠agrin基因实时定量聚合酶链反应的检测方法

目的:agrin基因对神经肌肉接头的形成、维持起着决定作用,也对神经元轴突的形成、延长、维持有重要作用,其表达产物在机体内分布广泛。设计绝对定量嵌合荧光法检测大鼠agrin基因mRNA的实时定量聚合酶链反应方法,并检测其特异性、敏感性和可重复性。方法:实验于2007-04/11在吉林大学基础医学院三综合实验室和吉林大学第一医院传染科实验室完成。以Primer3软件设计大鼠agrin基因、ACTB基因mRNA嵌合荧光实时定量聚合酶链反应检测引物,经检索Blast验证特异性,并以Primer5设计构建agrin基因标准品引物。选择清洁级Wistar大鼠交配,获取3日龄乳鼠,取脑,获取mRNA、cDNA,常规反转录-聚合酶链反应获取agrin554个碱基DNA片断。PCR填加T7启动子后,T7 RNA Polymerase合成agrin基因标准品,消化模板。分光光度计测定其浓度,1:5倍比稀释3次;经反转录反应合成agrin基因cDNA标准品,测序验证特异性。以ACTB引物反转录cDNA,1:5倍稀释3次,构建ACTB基因标准品。常规聚合酶链反应确定、优化反应条件。标准曲线确定实时定量聚合酶链反应标准曲线的相关性,融解曲线验证检测方法的特异性,作重复性检测。结果:①agrin基因有意义链引物序列:GAA GGC CAG GTG CGA ATC A,反义链引物序列:CAC AGG TAG CAG TGG AGC CAA G,内标:ACTB基因有意义链引物序列:GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA,反义链引物序列:GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG,优化反应条件:95℃变性5s,60℃退火20s,72℃延伸20s。②agrin基因、ACTB基因标准品所获得的标准曲线确定实时定量聚合酶链反应标准曲线的相关性均>0.95。③聚合酶链反应产物电泳、测序、实时定量聚合酶链反应融解曲线证明特异性高、重复性好、灵敏度达到精确定量要求。结论:绝对定量嵌合荧光法检测大鼠agrin基因mRNA的实时定量聚合酶链反应方法可以作为大鼠agrin基因mRNA检测的标准方法。

氧乐果致运动神经元agrin基因mRNA水平改变

目的分析不同浓度氧乐果对运动神经元agrin基因mRNA转录水平的影响,探讨有机磷中毒突触前损害的发病机制。方法体外培养大鼠脊髓运动神经元,氧乐果染毒,检测不同浓度氧乐果对运动神经元agrin基因mRNA转录水平的影响,检测有机磷中毒是否对运动神经元的agrin基因表达产生影响。结果(1)正常组大鼠脊髓运动神经元agrin基因mRNA水平明显高于氧乐果染毒组大鼠脊髓运动神经元agrin基因mRNA水平;(2)不同浓度氧乐果染毒组(0.1mmol/L,0.01mmol/L)大鼠脊髓运动神经元agrin基因mRNA水平,各组间存在显著差异,损害程度与有机磷杀虫剂剂量存在正相关,即浓度大,agrin基因转录水平低;(3)0.1mmol/L浓度氧乐果染毒组大鼠脊髓运动神经元存活时间小于12h,0.01mmol/L浓度氧乐果染毒组大鼠脊髓运动神经元可较长时间存活。结论有机磷杀虫剂影响脊髓运动神经元agrin基因表达,且损害程度与有机磷杀虫剂剂量存在正相关,即浓度大,agrin基因转录水平低,神经肌肉接头损害严重,存在突触前损害。

吉林省延边地区朝鲜族与汉族HCV基因型特征分析

目的分析吉林省延边地区朝鲜族与汉族丙型肝炎病毒（HCV）基因型特征。方法采用荧光定量PCR方法和探针反向杂交技术对延边地区收治的62例朝鲜族和57例汉族慢性丙型肝炎患者进行HCV病毒载量检测和HCV基因型分析，比较HCV基因型在朝鲜族与汉族之间的分布差异，并分析HCV基因型与病毒载量、2型糖尿病和肝病严重程度之间的相关性。结果朝鲜族HCV基因型显示，1b型占45．16％（28／62）、2a型占38．71％（24／62）、未分型占16．13％（（10／62）；汉族HCV基因型显示，1b型占45．61％（26／57），2a型占40．35％（23／57），未分型占14．14％（8／57），朝、汉族之间各基因型分布差异无统计学意义（P〉0．05）。HCV各基因型之间HCV病毒载量差异和合并2型糖尿病分布差异之间无统计学意义（P〉0．05），而HCV1b型在中、重度慢性丙型肝炎患者与轻度慢性丙型肝炎患者中所占的比例差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论①吉林省延边地区HCV基因型中以1b型最多，2a型次之，还有少数其他基因型；②HCV基因型在朝、汉民族之间分布无差异；③HCV基因型与HCV—RNA载量无关；④HCV基因型在合并糖尿病者与未合并糖尿病者之间分布无差异；⑤1b型HCV感染者病情相对较重。