秦川牛成纤维细胞的分离培养体系优化

为建立秦川牛体细胞分离培养体系,分别选用组织块培养法、胰酶-胶原酶消化法和胶原酶-胰酶消化法提取秦川牛耳缘成纤维细胞。结果表明:组织块培养法获取成纤维细胞所需周期长,组织块贴壁17 d后可获得原代成纤维细胞,而双酶消化法在原代细胞贴壁至9 d时便可进行传代纯化培养;与双酶消化法Ⅱ相比,双酶消化法I获得的原代成纤维细胞浓度1.24×10^(6)/mL显著高于双酶消化法Ⅱ(0.9×10^(6)/mL)(P<0.05);传代培养5 d后,细胞汇合度达到80%,取第三代成纤维细胞进行免疫荧光和流式细胞术鉴定,成纤维细胞纯度达到95%以上;纯化后的成纤维细胞培养至第3天,开始进入对数生长期,第8天时增殖速度下降进入平台期。因此,双酶消化法I(0.25%胰酶处理30 min,再用1%胶原酶处理60 min)为分离培养秦川牛耳缘成纤维细胞的最佳方法。

味觉受体T1R1和T1R3在从江香猪附睾不同区段的差异表达

【目的】明确从江香猪附睾中不同区段味觉受体T1R1和T1R3的定位及表达情况,为揭示猪附睾不同区段形成特殊微环境保障精子成熟的作用机制提供参考依据。【方法】采集初情期(30d)和性成熟期(180d)从江香猪附睾组织样品,分别采用实时荧光定量PCR、免疫组织化学、蛋白免疫印迹(Western blotting)等检测从江香猪附睾不同区段味觉受体T1R1和T1R3的定位及表达情况。【结果】味觉受体T1R1/T1R3的编码基因TAS1R1/TAS1R3均表现为附睾Ⅳ区的相对表达量显著高于其他区段(P<0.05,下同),而Ⅰ区的相对表达量显著低于其他区段,具体排序为Ⅳ区>Ⅴ区>Ⅱ区>Ⅲ区>Ⅰ区。免疫组织化学定位分析结果显示,在从江香猪附睾不同区段均检测到T1R1/T1R3不同程度的免疫阳性信号。其中,T1R1在附睾Ⅰ区主要定位于肌样细胞层与基细胞核;在附睾Ⅱ区主要定位于附睾上皮细胞、肌样细胞和精子细胞;在附睾Ⅲ区强烈定位于附睾管腔和微绒毛根部;附睾Ⅳ区为5个区段中表达最强烈的部位,定位于附睾管腔精子、管腔内缘和狭窄细胞膜上;在附睾Ⅴ区主要定位于附睾间质组织和狭窄细胞膜上。T1R3定位于附睾Ⅰ区血管内皮细胞、脱落生精细胞和附睾上皮细胞(尤其是基细胞);在附睾II区的精子、晕细胞和狭窄细胞上有较强表达;在附睾Ⅲ区和Ⅳ区主要定位于空泡化的附睾上皮细胞;在附睾Ⅴ区定位于附睾管不规则处和空泡化附睾上皮细胞,其表达强度仅次于Ⅲ区。Western blotting检测结果显示,从江香猪附睾Ⅳ区的T1R1/T1R3表达水平最高,其次是Ⅱ区,二者显著高于其他区段。【结论】初情期从江香猪附睾T1R1和T1R3的表达具有区段特异性和细胞特异性,以Ⅳ区的表达水平最高,且主要定位于附睾上皮细胞顶端、狭窄细胞和微绒毛根部,提示T1R1/T1R3在建立促进猪附睾精子成熟和储存的特殊腔内微环境中发挥重要作用。

T1R1和T1R3在从江香猪附睾发育中的表达模式

为研究味觉受体第一家族亚型1(T1R1)和3(T1R3)在从江香猪附睾发育过程中的表达模式,探讨味觉受体在哺乳动物雄性生殖机能中可能发挥的作用及潜在医学价值,本试验以从江香猪附睾组织为研究对象,分析附睾发育4个关键时期:初情前(15 d)、初情时(30 d)、初情后(60 d)和性成熟期(180 d)T1R1与T1R3的差异表达。采用实时荧光定量PCR、免疫组织化学(IHC)和Western blot检测两个味觉受体在不同日龄从江香猪附睾组织中转录、翻译水平的变化及其分布情况。RT-qPCR结果表明:TAS1R1与TAS1R3 mRNA在从江香猪附睾初情前(15 d)至性成熟期(180 d)表达量逐渐增加,且任意两个时期间差异极显著(P<0.01)。Western blot结果显示,T1R1/T1R3蛋白在180 d表达量最高,在15 d表达量最低,两者之间差异显著(P<0.05),平均表达丰度依次为180 d>30 d>60 d>15 d。IHC结果显示,T1R1和T1R3蛋白在各日龄组从江香猪附睾组织均有分布,其中T1R1蛋白主要在上皮细胞膜上,尤其是基细胞和窄细胞;而T1R3蛋白主要在微绒毛、环状空泡和精子呈强阳性表达。综上,本研究发现不同日龄从江香猪附睾的T1R1/T1R3表达从15 d逐渐增加,至性成熟达到峰值,这一表达变化与附睾上皮基细胞和窄细胞及微绒毛的T1R1/T1R3的差异表达有关,这些特殊的表达模式与附睾生理功能存在时间关联,故推测T1R1和T1R3参与附睾内精子成熟和储存的调节过程。

鲜味受体TAS1R1/TAS1R3对从江香猪肌内前体脂肪细胞自噬及脂质代谢的调控研究

实验旨在研究鲜味受体(Taste Receptor Family 1 Subunit 1/Taste Receptor Family 1 Subunit 3,TAS1R1/TAS1R3)对从江香猪肌内前体脂肪细胞自噬及脂质代谢的影响,为发掘从江香猪肉质优良性状的形成机制提供思路。实验通过构建TAS1R3 shRNA干扰载体,并转染至从江香猪前体脂肪细胞以干扰TAS1R1/TAS1R3的表达水平;通过添加低浓度(2.5 mmol/L)、中浓度(5 mmol/L)、高浓度(10 mmol/L)L-谷氨酸作用于细胞不同时间以激活鲜味受体TAS1R1/TAS1R3,用qRT-PCR检测自噬相关基因以及脂质代谢相关基因的表达水平。结果表明:构建的干扰载体可有效干扰细胞内TAS1R1/TAS1R3的mRNA表达水平(P<0.01);哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达水平下降(P<0.01),自噬关键因子微管相关蛋白1轻链3B (MAP1LC3B)和Beclin 1表达水平上升(P<0.01);脂质代谢相关基因神经肽Y (NPY)、乙酰辅酶A羧化酶α(ACACA)表达水平均下降(P<0.01),脂蛋白脂肪酶(LPL)表达水平上升(P<0.01);10 mmol/L L-谷氨酸处理细胞6 h后,细胞内TAS1R1/TAS1R3的mRNA表达水平升高(P <0.01),mTOR表达水平上调(P<0.05),MAP1LC3B和Beclin1的表达水平下降(P<0.01),NPY、ACACA的表达水平升高(P<0.05),LPL表达水平下降(P<0.01)。本研究表明TAS1R1/TAS1R3调节从江香猪肌内前体脂肪细胞自噬和脂质代谢过程,但这两个过程是否相关仍需后续研究。

从江香猪睾丸支持细胞分离培养与鉴定

【目的】建立一种高效制备从江香猪睾丸支持细胞(Sertoli cells, SCs)体外分离培养方法,为后续香猪雄性繁殖研究提供细胞材料,为同类小型香猪支持细胞的分离培养提供参考。【方法】采用0.1%Ⅳ型胶原酶和0.25%胰酶-EDTA组合酶消化法消化睾丸组织,差速贴壁法纯化支持细胞,使用含10%胎牛血清完全培养基培养支持细胞,观察其形态特征并记录生长曲线,经苏木精—伊红(HE)染色、RT-PCR及免疫荧光染色进行支持细胞的鉴定。【结果】组合酶法消化后可获得大量生精上皮细胞混悬液,刚分离的支持细胞呈圆形或椭圆形,分离培养5~6 h后SCs贴壁,贴壁后细胞形态呈梭形或不规则形,培养3~4 d后细胞之间呈紧密连接,可清晰观察到细胞核及细胞质中的颗粒状物质或小空泡;SCs分离后1~2 d增殖速度缓慢,培养3~6 d细胞增殖速度加快,活性增强,进入对数生长期,培养7~8 d后细胞增殖速率下降,原代支持细胞生长曲线呈S形;HE染色显示SCs细胞核为深紫色,细胞质呈淡红色;RT-PCR结果显示支持细胞特异性基因WT1、SOX9均表达;免疫荧光染色结果显示特异性基因GATA-4抗体免疫阳性率达90%以上。【结论】成功建立从江香猪睾丸支持细胞的原代培养方法。

去势时间对从江香猪肉质性状的影响

【目的】综合分析不同日龄去势对从江香猪肉质性状的影响,为从江香猪最佳去势日龄的确定提供参考依据。【方法】选取12头20日龄从江香公猪,分为25日龄去势组(C25d组)、120日龄去势组(C120d组)、180日龄去势组(C180d组)和未去势组(UC组),统一饲养管理至240日龄屠宰,参照NY/T 821—2004《猪肌肉品质测定技术规范》测定肉质性状后采用主成分分析法构建肉质综合评分模型,并结合ELISA和实时荧光定量PCR检测香猪膻味物质含量及参与代谢膻味物质基因的表达水平。【结果】C25d组的肌肉pH24 h显著高于C120d组(P<0.05,下同);肉色评分中,UC组和C25d组显著高于C180d组和C120d组;剪切力和肌肉脂肪含量与肉色恰好相反,表现为C180d组和C120d组显著高于UC组和C25d组;肌肉水分含量表现为C25d组>UC组>C180d组>C120d组;肌肉蛋白含量表现为C120d组显著高于C180d组、C25d组及UC组。以主成分分析构建肉质性状综合评分模型,从10个肉质指标中提取出3个主成分(累积贡献率为100.00%),第一主成分包括肉色、剪切力、肌肉水分含量和肌肉脂肪含量,第二主成分包括pH24 h、大理石纹和滴水损失,第三主成分包括pH45 min、熟肉率和肌肉蛋白含量;从江香公猪肉质综合评分排序为C25d组>UC组>C180d组>C120d组。去势时间对从江香公猪肝脏和脂肪中的雄烯酮含量,以及脂肪、背最长肌和肝脏中的粪臭素含量影响均不显著(P>0.05,下同);但背最长肌中的雄烯酮含量表现为C25d组显著低于C120d组和UC组。粪臭素代谢关键酶CYP2E1基因在C120d组、C180d组和UC组从江香公猪的肝脏中均有表达,且组间差异均不显著。【结论】不同去势时间对从江香公猪肉色、剪切力、肌肉脂肪、肌肉水分和肌肉蛋白均存在影响。从江香公猪25日龄去势的肉质较好,错过该时间或考虑动物福利则建议不进行去势为宜。