流式细胞术分析不同剂量X射线对HL-60细胞周期的影响及其诱导的细胞凋亡

比较不同剂量 X射线对 HL- 60细胞的影响 ,建立 X射线诱导 HL- 60细胞凋亡的生物研究模型 ,探索细胞周期检测点对放射剂量的耐受性。采用对数生长期的 HL- 60细胞经 2 ,5 ,10 ,15 ,2 0 Gy的 X射线照射后培养 4 h,用流式细胞仪分析 HL- 60细胞周期的改变。结果发现 ,不同剂量 X射线照射均可诱导 HL- 60细胞凋亡 ,凋亡率有随照射剂量增大而增高的趋势。经 2 ,5 Gy剂量照射的 HL- 60细胞主要表现为 S期细胞的比例减少 ,G2 /M期细胞的比例增多 ,经 15 ,2 0 Gy剂量照射的 HL- 60细胞主要表现为 S期细胞和 G2 /M期细胞的比例均减少。结果显示 ,以 X射线照射 HL-60细胞可建立理想的射线诱导的细胞凋亡模型 ,小剂量照射和大剂量照射可能引起不同时相的细胞发生凋亡 ,提示细胞对放射剂量的反应性与细胞周期检测点之间存在一定的关系。

咖啡因对X射线诱导的HL-60细胞凋亡的影响

目的 探讨细胞周期检测点对不同放射剂量射线的耐受性及咖啡因对细胞周期检测点的影响。方法 对数生长期的急性早幼粒白血病细胞株(HL-60)细胞经不同剂量的X射线照射,并加入终浓度为5 mmol/L的咖啡因培养4 h后,用亚G1峰法检测细胞凋亡,用DNA链缺口标记法(TdT)分析凋亡细胞的细胞周期特异性。结果 不同剂量X射线照射均可诱导HL-60细胞凋亡,2 Gy X射线的照射主要诱导G1期细胞凋亡,20 Gy X射线照射诱导的细胞凋亡由G1期发展至以S期和G2期为主。加入咖啡因能使射线诱导的细胞凋亡减少,其中2 Gy X射线照射的细胞表现为G1期细胞凋亡减少,而20 Gy X射线照射的细胞主要表现为以S期和G2期为主的细胞凋亡的减少。结论 细胞对放射剂量的反应性与细胞周期检测点之间存在一定的关系,咖啡因对射线诱导的细胞凋亡及检测点的影响与射线的剂量有关。

丙型肝炎病毒准种在NS2区的变异状况初探

探讨HCV准种在NS2区的基因结构特征及变异状况。利用逆转录 巢式PCR从 1份HCV慢性携带者的阳性血清及 1份丙肝患者的血清中获得HCVNS2全长cDNA ,将其克隆于T载体 ,各随机挑取 5个阳性克隆进行序列测定。结果显示克隆到HCVNS2全长基因 ,所测克隆在核苷酸水平和氨基酸水平互不相同。该慢性携带者HCVNS2区序列以完整读码框架 (ORF)为主 ,一个于HCV多聚蛋白第 835位氨基酸的位置出现终止信号 ,而该丙型肝炎患者以NS2N端发现终止信号的序列为主 ,其中三个于第 835位氨基酸的位置出现终止信号 ,一个于第 887位氨基酸的位置出现终止信号 ,仅一个克隆的序列为完整ORF。对ORF完整的序列进行比较 ,发现丙型肝炎患者氨基酸变异主要集中于N端 ,蛋白二级结构模拟显示丙肝患者NS2与慢性携带者的优势二级结构类似。研究表明从我们选择的两例感染者的HCVNS2序列看 ,不同临床类型的HCV病人体内的HCV准种在NS2区存在差异 ,这种差异可能与病毒存在于机体的状态有一定的一致性。

克隆的丙型肝炎病毒NS2基因中发现数个N端终止突变序列

探讨丙型肝炎病毒 ( HCV)准种在 NS2区的基因结构特征。利用逆转录 -巢式 PCR从一份 HCV慢性携带者的阳性血清及一份急性丙肝患者的血清中获得 HCV NS2全长 c DNA,将其克隆于 T载体 ,各随机挑取 5个阳性克隆进行序列测定。结果显示在克隆到的 HCV NS2全长基因中 ,慢性携带者该区序列有一个于 HCV多聚蛋白第 83 5位氨基酸的位置出现终止信号 ,丙肝患者该区序列有三个于第 83 5位氨基酸的位置出现终止信号 ,一个小于第 887位氨基酸的位置出现终止信号。在克隆到的 HCV NS2基因中存在多个 N端终止突变序列 ,提示 NS2

用western blotting方法检测乙醇固定细胞中细胞周期素的表达

用 western blotting法测定乙醇固定细胞中细胞周期素 (cyclin)的表达情况 ,探索 western blotting和流式细胞仪对固定细胞在流式细胞术分选前或分选后对同批标本进行蛋白同步分析的可行性。采用对数生长期的 Molt- 4细胞 ,经两种常规固定方法固定后 ,用 western blotting方法检测 cyclin A、B1 、D和 E的表达。另取乙醇固定经流式细胞仪分选的 G1 期和 G2 / M期细胞裂解后 ,用 western blotting方法检测不同时相细胞中 cyclin B1 的表达。结果显示从固定细胞中提取的蛋白经 western blotting检测可得到清晰且分子量正确的条带 ,两种不同方法固定的细胞中检测到的 cyclins表达未见明显差异。乙醇固定细胞经分选后提取蛋白行 western blotting检测可见 G2 / M期细胞的 cyclin B1 有明显表达而 G1 期细胞不明显。细胞进行固定、洗涤、染色和分选等处理后不影响 western blotting对其 cyclins表达的分析 ,说明用 western

环境类雌激素双酚A通过上调Snail蛋白表达促进MCF-7乳腺癌细胞迁移

目的:探讨外源性双酚A(BPA)调控MCF-7乳腺癌细胞迁移的分子机制。方法:通过划痕实验和Transwell实验检测MCF-7乳腺癌细胞迁移能力,并以黏附实验反向辅助验证;通过质粒转染干扰Snail蛋白表达水平,进一步研究外源性BPA调控MCF-7乳腺癌细胞迁移的分子机制。结果:外源性BPA能上调细胞中Snail的表达水平,从而下调E-cadherin的表达并促进MCF-7乳腺癌细胞迁移;siRNA干扰Snail表达后MCF-7乳腺癌细胞迁移减慢。此外,BPA刺激能降低MCF-7乳腺癌细胞黏附能力。结论:外源性BPA可通过上调Snail表达水平,促进MCF-7乳腺癌细胞的迁移,为进一步阐明乳腺癌细胞侵袭与转移的分子调控机制提供了新线索。

新鲜肿瘤标本活细胞与固定细胞的DNA含量分析比较

目的:建立一种以新鲜细胞进行临床肿瘤DNA含量分析的方法。方法:血液肿瘤取肝素抗凝外固血或骨髓样本,用淋巴细胞分层液分离纯化单个核细胞;实体瘤组织则用机械法制成单细胞悬液。将细胞分成两份,一份酒精固定过夜,流式细胞术常规方法测定DNA含量,另一份直接用PIPESpiperazineNNbis2ethanesulfonicaciddisodiumsalt缓冲液配制的碘化丙锭(propidiumiodidePI)染色,以流式细胞术进行DNA含量测定,并与同期固定细胞的DNA含量检测结果进行比较。结果:同类型的肿瘤细胞,其固定前后G0/G1期细胞峰的变异系数(coefficientofvariationCV)没有明显差异(t检验,P>0.05)。重复实验结果显示,新鲜细胞DNA含量分析结果稳定。结论:用PIPES缓冲液配制的PI染液染色新鲜细胞,可以对临床肿瘤的细胞增殖状况和DNA倍性进行分析。

siRNA抑制Ku80表达后对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

背景与目的:Ku80为细胞受辐射后DNA双链断裂(DNA doublestrand break,DSB)的主要修复蛋白。现阶段关于Ku80的研究主要集中在DSB修复方面,其他方面研究较少。本研究建立利用siRNA抑制Ku80表达的宫颈癌HeLa细胞模型,以此探讨Ku80在细胞增殖方面的作用。方法:构建靶向抑制Ku80的siRNA表达载体,转染HeLa细胞,筛选稳定表达siRNA的转化克隆;Western blot检测Ku80表达变化;克隆形成实验、MTT法和裸鼠皮下瘤形成实验分别检测细胞克隆形成率及细胞在体外和体内的增殖情况。结果:构建表达质粒pKu80-siRNA与pNeg-siRNA转染HeLa细胞,G418筛选后获得稳定转染克隆,Western blot分析表明转染pKu80-siRNA后的细胞Ku80蛋白表达受到明显抑制,将其命名为HeLa/Ku80-siRNA;转染pNeg-siRNA的HeLa细胞克隆形成率为0.62±0.02,而HeLa/Ku80-siRNA细胞的克隆形成率为0.46±0.05,明显低于对照细胞(t=5.11,P<0.01);MTT显示细胞培养48h和72h时,HeLa/Ku80-siRNA细胞的增殖率均显著低于对照细胞(P<0.05);裸鼠皮下瘤生长实验示种植25天时,HeLa/Ku80-siRNA细胞种植瘤的平均体积为(18.92±3.60)mm3,明显低于对照细胞种植瘤体积(194.88±30.61)mm3,(t=12.69,P<0.01)。结论:稳定转染及siRNA技术建立的Ku80表达抑制克隆可以成为简单实用的细胞模型;Ku80-siRNA抑制Ku80的表达后可以在体内外抑制HeLa细胞的增殖。

一种新的细胞周期分析方法

目的采用DNA含量流式细胞术细胞周期分析方法,可分辨出G0/G1期、S期及G2/M期3个细胞周期群体,但无法区分G0/G1期、G2/M期细胞。方法本研究建立的cyclinE+A/DNA多参数流式细胞术。结果可将细胞周期进行详细的分期,由传统的三分法(G0/G1期、S期以及G2/M期)为六分法(G0期、G1早期、G1晚期、S期、G2期以及M期),为细胞生物学研究,尤其是细胞增殖动力学提供新的、更为合理的分析方法。

骨代谢生化指标在恶性肿瘤骨转移诊断中的价值

目的:探讨溶骨性骨代谢生化指标尿Ⅰ型胶原交联氨基末端肽(NTx)、血Ⅰ型胶原交联羧基末端肽(ICTP)定量检测诊断恶性肿瘤骨转移的价值。方法:用ELISA方法测定77例恶性肿瘤患者尿NTx和血ICTP水平。结果:骨转移组患者尿NTx和血ICTP均明显高于无骨转移组以及正常值范围(P<0.01)。骨转移患者尿NTx与血ICTP成正相关(r=0.880,P<0.01)。尿NTx诊断恶性肿瘤骨转移的灵敏度、特异度和准确度分别为82.5%、83.8%和83.2%(P<0.05)。血ICTP的灵敏度、特异度和准确度分别为87.5%、73.0%和80.6%(P<0.05)。骨转移患者尿NTx与血ICTP水平与骨转移范围成正相关(r=0.453、0.475,P<0.01),与骨痛程度无显著相关(r=0.010、0.083,P>0.05)。结论:NTx和血ICTP对恶性肿瘤患者骨转移的诊断有重要的参考意义,可协助及时诊断恶性肿瘤骨转移。

非小细胞肺癌组织EGFR突变及其临床意义的研究

目的:检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者表皮生长因子受体(EGFR)的突变,探讨突变特征及其在肺癌治疗中的意义。方法:收集46例手术切除肺癌组织及其癌旁组织,分别提取DNA,采用PCR法扩增编码EGFR基因的第18、19、20及21外显子片段,对扩增片段进行DNA测序及分析。结果:46例NSCLC中12例(26.1%)患者肺癌组织存在EGFR酪氨酸激酶结合域的体细胞突变;癌旁组织均未发现突变。12例突变中,9例(75.0%)19号外显子上发生缺失突变,3例(25.0%)21号外显子上发生替代突变。伴细支气管肺泡癌分化特征的肺腺癌突变率(7/9,77.8%)显著高于普通腺癌(5/23,21.7%)和鳞癌(0/12,0)的突变率,P<0.05;女性突变率(9/15,60%)显著高于男性(3/31,9.7%),P<0.05;不吸烟者突变率(9/20,45%)显著高于吸烟者(3/26,11.5%),差异均有统计学意义,P<0.05。结论:国内NSCLC患者存在EGFR突变,女性、非吸烟者及伴细支气管肺泡癌分化特征的肺腺癌提示突变的高发性。

协同抑制Ku80和DNA-PKcs对HeLa细胞放射生物学功能的影响

目的:研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)和LY29400抑制单个或多个DNA双链断裂(DNA double-strand break,DSB)修复蛋白后,HeLa细胞放射敏感性和细胞周期的变化。方法:Ku80受抑细胞HeLa/Ku80-siRNA和对照细胞HeLa/Neg-siRNA分别转染可以靶向抑制DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)表达的siRNA,或用DNA-PKcs活性抑制剂LY294002处理,经6 MV X线照射后,克隆形成实验检测细胞放射敏感性的变化,FCM法检测细胞周期。结果:DNA-PKcs-siRNA转染后的HeLa/Ku80-siRNA细胞,其2 Gy照射后的存活分数(sur-vival fraction,SF2)为0.08±0.01,LY294002作用后HeLa/Ku80-siRNA的SF2达0.03±0.01,均远低于未处理HeLa/Ku80-siRNA细胞的0.20±0.05。各组细胞照射6 Gy后均出现G2/M期阻滞,转染DNA-PKcs-siRNA的HeLa/Neg-siRNA细胞以及经LY294002处理的HeLa/Ku80-siRNA、HeLa/Neg-siRNA细胞G2/M期阻滞逐渐缓慢出现,照射后72 h仍未达到顶点,而其他细胞G2/M期阻滞均于照射后48 h达到顶点。结论:在抑制Ku80已达95%的基础上,DSB修复功能可以由其他DSB修复蛋白如DNA-PKcs和共济失调毛细血管扩张症突变基因(ataxia-telangiectasia mutant,ATM)代偿,协同抑制上述蛋白可以明显增加,如HeLa细胞的辐射敏感性;Ku80、DNA-PKcs和ATM在细胞的G2/M期阻滞过程中发挥的作用不同。

ASP技术在远程监控中的应用

随着Internet技术,特别是Web技术的迅速发展,使得基于Internet的远程应用系统的实现成为可能。针对某石化企业远程故障诊断和监控项目中的基于B/S的系统,进行了Web部分的设计与开发。

乳腺癌中Abi1和c-Abl及WAVE 2的表达及其相互关系

目的研究乳腺癌组织中Abi1、c-Abl和WAVE2蛋白的表达及其相互关系。方法应用免疫组化SP法检测66例乳腺癌组织和24例正常乳腺组织中Abi1、c-Abl和WAVE2蛋白的表达情况。结果 1.正常乳腺组织与乳腺癌组织相比,Abi1和WAVE2蛋白表达有显著性差异(P<0.05),而c-Abl蛋白表达无显著性差异(P>0.05),但有定位的改变。2.Abi1强阳性率与乳腺癌的肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移及临床分期呈负相关性(P<0.05);与患者年龄无关(P>0.05)。c-Abl阳性率及WAVE2强阳性率均与乳腺癌的组织学分级、淋巴结转移及临床分期呈负相关性(P<0.05);与患者年龄及肿瘤大小无关(P>0.05)。3.Abi1蛋白表达与c-Abl和WAVE2蛋白表达呈正相关(P<0.05)。结论乳腺癌中Abi1低表达与预后不良有关。乳腺癌中Abi1蛋白表达的变化可影响c-Abl蛋白的定位和WAVE2蛋白的表达。推测Abi1在Abl/Abi1/WAVE2通路中具有至关重要的地位。

趋化性细胞因子受体CXCR4基因沉默对大肠癌细胞体外侵袭及增殖能力的影响

目的:研究趋化性细胞因子受体CXCR4短干扰RNA(siRNA)对大肠癌细胞系体外侵袭及增殖能力的影响.方法:利用T7 RNA聚合酶体外合成以CXCR4为靶基因的siRNA,用脂质体转染大肠癌SW480细胞,同时设立空白对照组和无关对照组.于转染后48h采用RT-PCR方法检测CXCR4 mRNA水平,免疫印迹方法检测CXCR4和MT1-MMP的蛋白质水平,Boyden小室模型检测体外侵袭能力的变化,流式细胞术检测细胞周期的分布情况,MTT法测定细胞增殖状况.结果:SW480细胞转染CXCR4 siRNA 48h后,与空白对照和无关对照相比,CXCR4 mRNA水平明显下调(51.53%±6.1% vs 78.4%±3.3%.P<0.01:51.53%±6.1% vs 87.4%±5.3%,P<0.01),CXCR4的蛋白质水平明显降低(47.3%±3.7% vs 107.2%±3.6%,P<0.01;47.3%±3.7% vs 114.7%±4.8%,P<0.01),MT1-MMP蛋白表达水平也明显下降(43.8%±2.5% vs 64.4%±4.4%,P<0.01;43.8%±2.5% vs 67.0%±2.9%,P<0.01),细胞的体外侵袭能力减弱(26.5%±6.1% vs 73.7%±3.4%,P<0.01;26.5%±6.1% vs 64.5%±5.7%,P<0.01),细胞周期的分布无明显差异.在无SDF-1存在的情况下,各组细胞的增殖无明显改变;经SDF-1刺激后,各组细胞增殖增加,但CXCR4 siRNA转染组细胞的增殖显著低于空白对照组和无关对照组(24h:0.55±0.03 vs 0.68±0.06,0.71±0.04,P<0.05;48h:0.67±0.04 vs 0.89±0.03,0.94±0.07,P<0.05;72 h:0.72±0.06 vs 1.36±0.08,1.53±0.07,P<0.01).以上各指标在空白对照和无关对照之间无显著性差异(P>0.05).结论:以CXCR4为靶向的siRNA能够有效下调CXCR4基因,降低SDF-1诱导的大肠癌细胞系体外侵袭能力及增殖海性.

DNA双链断裂修复蛋白在宫颈癌和CIN组织中的表达

目的研究DNA双链断裂修复蛋白(Ku80、DNA-PKcs和ATM)在宫颈癌和宫颈上皮内瘤样病变(CIN)组织中的表达情况,探讨3种蛋白在宫颈癌发生发展中的作用及相互关系。方法应用免疫组化SP法检测41例宫颈癌组织和15例CIN组织中Ku80,DNA-PKcs和ATM蛋白的表达情况。结果Ku80、DNA-PKcs和ATM蛋白在宫颈癌患者中的阳性率分别为70.7%、68.3%和19.5%,在CIN患者中的阳性率分别为80.0%、73.3%和33.3%;3种蛋白在宫颈癌组织中的表达均低于CIN组织,但差异无统计学意义(P>0.05)。3种蛋白的表达在不同年龄、病理类型、分化程度和临床分期的宫颈癌患者中差异无统计学意义(P>0.05)。Spearman等级相关分析,在56例患者中,Ku80与DNA-PKcs的表达呈正相关(r=0.583,P=0.000);Ku80与ATM的表达亦呈正相关(r=0.274,P=0.041)。结论3种蛋白可能未在宫颈癌的发生发展中起主要作用;Ku80与DNA-PKcs及与ATM之间存在密切关系。

紫外线诱导的Molt-4细胞旁观者效应的研究

目的 探讨紫外线诱导的凋亡细胞是否具有旁观者效应。方法 将Molt=4细胞分为阴性对照组、DID对照组、空白对照组和细胞密度分别为2×10^5／ml和8×10^5／ml的两个实验组。每个实验组细胞被平分为两部分：一部分作为效应细胞，被标记示踪剂DID染料并予以UV照射40s；另一部分作为旁观者细胞，不经任何特殊处理。细胞联合培养共24h，每4h收获1次。运用Annexin V—FITC／PI法检测旁观者细胞的细胞凋亡率，激光共聚焦显微镜检测旁观者细胞的形态学变化。结果 阴性对照组、DID对照组和空白对照组在0、4、8、12、16、20和24h各个时间点细胞凋亡率均小于5％。2×10^5／ml实验组旁观者细胞凋亡率在0～24h分别为3．47％、4．58％、7．32％、10．41％、14．82％、19．37％和25．66％。8×10^5／ml实验组旁观者细胞凋亡率在相应时间点分别为3．76％、5．77％、10．17％、14．71％、18．92％、32．28％和38．90％。与对照组相比，实验组旁观者细胞凋亡率随时间的延长而明显升高，且旁观者细胞凋亡率随细胞密度增高而增加。对旁观者细胞进行激光共聚焦显微镜检测，发现一些经典的凋亡和坏死表现，如细胞染色体浓集、磷脂酰丝氨酸翻转、凋亡小体形成、细胞崩解等。结论 经紫外线照射的Molt-4细胞对旁观者细胞具有旁观者效应，且该效应与细胞密度相关。

综合性护理在肋骨骨折合并肺不张患者护理中的应用效果观察

目的观察综合性护理在肋骨骨折合并肺不张患者护理中的应用效果。方法将142例肋骨骨折合并肺不张的患者按照随机数字表法分为A、B 2组各71例,其中A组使用常规护理措施进行护理,B组在A组基础上使用综合性护理干预。护理8周后比较2组患者机械通气时间、ICU住院时间、气管插管率及并发症情况。结果B组患者机械通气时间以及ICU住院时间均短于A组,气管插管率及肺部感染均低于A组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论对肋骨骨折合并肺不张患者进行综合性护理干预,可有效降低患者肺部感染率,促进患者早日康复。

血NF-KB P65表达在创伤性湿肺并ARDS患者凝血功能中的意义及护理对策

目的 分析血NF-KBP65表达在创伤性湿肺并急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者凝血功能的意义,总结护理经验。方法 选择2017年2月~2018年4月我院收治的46例创伤性湿肺并ARDS患者纳入观察组。选择同期收治的46例创伤性湿肺住院患者纳入对照组。入院时均检测凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)、血NF-KBP65表达水平,将观察组按照预后进行分组,其中死亡、严重并发症纳入不良组,其余患者纳入良好组。并对凝血功能指标与血NF-KBP65表达进行相关性分析。结果 观察组入院时PT、APTT、TT、FIB、血NF-KBP65表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组入院时PT、APTT、TT、FIB与血NF-KBP65表达存在相关性,差异有统计学意义(P<0.05)。良好组PT、APTT、TT、FIB、血NF-KBP65表达水平低于不良组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 对于创伤性湿肺并ARDS患者,需要重视病情及预后观察、指标监测,对于预后不良高风险的患者,需采取积极的护理干预。

临床乳腺癌细胞周期蛋白非时相性表达的初步探讨

目的 初步探讨临床乳腺癌细胞的细胞周期蛋白 (Cyclin)表达规律并予以归类 ,为进一步研究肿瘤的细胞周期机制提供依据。方法 采用Cyclin/DNA双参数流式细胞术对临床上获取的乳腺癌细胞的Cyclin (CyclinD1、E、A和B1)和DNA表达进行检测。结果 在 16例乳腺癌标本中 ,细胞周期蛋白的非时相性表达可以归类如下 :①Ⅰ型CyclinD1、E、A和B1均呈非时相性过表达 (5例 )。②Ⅱ型CyclinsD1、E、A和B1均呈低表达或不表达 (3例 )。③Ⅲ型CyclinD1呈过表达并贯穿于整个细胞周期 ,而CyclinsE、A和B1呈低表达或不表达 (3例 )。④Ⅳ型CyclinsE、A和B1呈不同程度的非时相性过表达 ,而CyclinD1呈低表达或不表达 (5例 )。结论 Cyclins在乳腺癌细胞中的非时相性表达存在着一定的规律 。