非洲猪瘟病毒p30蛋白与CRM197的融合表达及对小鼠的免疫原性评价

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、高传染性和致死性的传染病,对猪养殖业造成了巨大的影响。安全有效的疫苗和有效治疗药物的缺乏给非洲猪瘟防控带来了巨大的挑战。作者尝试设计一种融合蛋白以改善非洲猪瘟病毒p30的免疫原性。白喉毒素的无毒突变体CRM197已被成功地用作多糖-蛋白结合疫苗的载体蛋白,以增强多糖的免疫原性。本研究构建p30与CRM197催化结构域(A片段)的融合表达质粒,纯化后的重组蛋白和单独p30分别使用小鼠评价了其免疫原性。结果显示:通过原核表达与亲和层析纯化得到融合蛋白p30-CRM197(A)免疫小鼠后,较单独表达的p30其可以在更短的时间内激发起高水平针对p30的特异性IgG,并且在初次免疫后56 d后还能维持较高水平的淋巴细胞免疫活力。本研究结果表明,CRM197的A片段作为载体蛋白显著增强原核表达p30蛋白的免疫原性,其可作为非洲猪瘟亚单位疫苗的候选分子内佐剂。

犬β防御素CBD122原核表达及其抗病毒活性研究

防御素为抗菌肽家族成员,且具有良好的抗菌抗病毒功能。由于抗生素的大量使用其作用已大大降低,而防御素具有良好的抗病毒应用前景,因此本研究将犬β防御素CBD122利用大肠杆菌表达重组蛋白rCBD122,经纯化后在体外细胞上进行抗重组水泡性口炎病毒(recombinant Vesicular stomatitis virus expressing green fluorescent protein,rVSV-GFP)和犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)活性测定,从而评价重组蛋白抗病毒效果。研究结果显示,37℃诱导5 h,IPTG浓度为0.5 mmol/L时rCBD122表达量较高,且大量表达于菌体破碎后菌液上清液,纯化后表达量为0.22 mg/mL。rCBD122抗rVSV-GFP和CDV感染活性测定结果显示,rCBD122抗VSV-GFP病毒效价为1.17×10^(4)IU/mL;rCBD122抗CDV感染效价为2.34×10^(4)IU/mL。rCBD122可在24 h特异性抑制CDV野毒株SD(14)7在易感细胞上的复制水平(P<0.01),与病毒感染组相比,病毒RNA载量下降16.31倍。因此,本研究应用大肠杆菌表达系统成功表达了重组蛋白rCBD122,且其具有较好的抗病毒活性,为后续防御素作用机制研究以及新型抗病毒治疗药物研发奠定了基础。

四种杯状病毒调控宿主免疫类细胞因子表达的研究进展

杯状病毒科(Caliciviridae)为无囊膜的单股正链RNA病毒,包含许多对人类和动物健康带来严重威胁的病毒成员。由于该病毒科的大部分成员均不能在体外进行有效增殖,导致杯状病毒的研究相对滞后,虽然已取得了一些重要的进展,但还存在诸多问题亟待解决。基于此,本文综述了目前已证实的人诺如病毒(HuNoV)、鼠诺如病毒(MNV)、猫杯状病毒(FCV)和兔出血症病毒(RHDV)四种常见杯状病毒感染机体后干扰素、白介素、肿瘤坏死因子等免疫类细胞因子的表达水平及其作用机制,以了解免疫类细胞因子与杯状病毒感染的关系。为探讨病毒与宿主免疫系统之间的相互作用机制提供新思路。

铁蛋白与犬α干扰素的融合表达及抗病毒活性检测

为获得治疗犬病毒性传染病的特效药物,本研究将铁蛋白与犬α干扰素进行融合表达。首先根据GenBank中公布的犬α干扰素序列(IFN2a)合成模板,通过融合PCR连入铁蛋白编码基因的上游,并将该重组基因克隆至原核表达载体pCold-TF中,获得重组质粒pCold-TF-CaIFN2a-Fe。转化BL21后用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE),蛋白免疫印迹(Western blot)鉴定,获得约89 kDa的可溶性重组目的蛋白。重组蛋白经镍柱纯化后,使用犬肾细胞/水疱疹性口炎病毒(MDCK/VSV)微量细胞病变抑制法检测抗病毒活性,效价确定为8×104 IU/mg,显示出良好的应用前景。

基因Ⅱ型猫杯状病毒XA20-2023株的分离鉴定及基因组序列分析

为了解猫杯状病毒(FCV)的生物学特性及遗传规律,本研究对从陕西西安地区采集的17份疑似FCV感染的口鼻咽样品经PCR检测,并经PCR扩增FCV阳性样品的VP1基因并测序。采用SnapGene软件分析GenBank中国内外23株FCV参考株与所测VP1的氨基酸序列,结果显示,17份拭子样品中有6份呈FCV阳性,阳性率为35.3%。氨基酸序列分析结果显示,所测VP1序列中有一条与GⅡ型FCV VP1氨基酸序列存在3处相同的变异,分别为N^(377)K、A^(539)V、G^(557)S,其余5条VP1氨基酸序列的变异与GI型FCV的VP1一致。表明所测VP1基因序列对应的FCV属于GⅡ型。将该FCV阳性样品接种CRFK细胞进行病毒的分离与传代,并在传代过程中观察细胞的CPE。将传至5代的病毒分别采用PCR与间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,结果显示连续传5代后,每代CRFK细胞均产生稳定且典型的CPE,并能观察到FCV的特异性绿色荧光,表明分离到一株GⅡ型FCV并命名为XA20-2023株。经PCR分段扩增第5代分离病毒的全基因组序列,测序拼接后显示XA20-2023株全长7 687 bp。采用MegAlign软件分析该株病毒与GenBank中10株FCV的全基因组、非结构蛋白、VP1及VP2编码基因序列的同源性。采用MEGA 11软件中的NJ法构建XA20-2023株与GenBank中85株FCV参考株全基因组序列的系统发育树。同源性分析结果显示,XA20-2023株与GenBank中10株FCV全基因组序列的同源性为76.4%~84.2%,与GⅡ型FCV SH株全基因组序列的同源性最高为84.2%,与GI型疫苗株F9、F4及FCV 255株全基因组序列的同源性分别为76.4%、77%及77.1%。非结构蛋白编码基因序列的同源性差异最大的是NS2(74.6%~94.2%),差异最小的是NS6(77.3%~82.9%)。VP1及VP2编码基因序列的同源性分别为73.7%~83.8%及76.0%~87.5%。进化树结果显示XA20-2023株与GⅡ型分离株处于同一分支,与GI型疫苗株F9和F4的遗传距离较远。上述结果进一步表明,XA20-2023株为GⅡ型FCV,与FCV代表株尤其是GI型疫苗株的同源性较低,且其变异程度较高。本研究丰富了西安地区流行的GⅡ型FCV基因库,并为后续揭示国内GⅡ型FCV的流行状况、遗传变异及其所致疫病的防制具有重要意义。

猫传染性腹膜炎病毒N蛋白表达及其多克隆抗体制备

本研究旨在体外原核表达猫传染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus,FIPV)SH2021株核衣壳蛋白(nucleocapsid,N),制备兔源多克隆抗体。根据FIPV SH2021株N基因序列设计引物,构建pCold-I-N重组表达质粒。随后,将重组质粒转化至表达感受态细胞BL21(DE3),在终浓度为1.0 mmol·L^(-1)的IPTG和16℃的诱导条件下进行表达。最后,利用His层析柱进行纯化,纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果表明,纯化获得重组N蛋白大小约为45 ku,制备的N蛋白兔多克隆抗体效价可达1∶512000,该抗体对N蛋白具有良好的反应原性。本研究成功所制备了FIPV N蛋白兔多克隆抗体,该抗体具有良好的反应原性和特异性,为FIPV抗原抗体检测以及研究N蛋白生物学功能研究提供重要工具。

上海市宠物疫病发生特点及防治建议

为了解上海地区宠物疫病发生和流行的特点,本文对来自上海某宠物医院收治的近2000例门诊病例进行了统计和分析。结果表明,在宠物病毒性病例中发病较多的病原有犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)、犬冠状病毒(Canine coronavirus,CCV)、猫冠状病毒(Feline coronavirus,FCoV)和猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV);在宠物寄生虫病例中,主要以球虫、跳蚤、耳螨感染为主;在宠物皮肤病病例中,多以细菌或真菌感染病例居多。根据上述统计结果,我们认为病毒性传染病、传染性皮肤病和体表寄生虫感染是当前对宠物健康危害较大的疫病,我们应以此作为宠物疫病重点防控的方向。

嵌杯病毒主要衣壳蛋白的研究进展

嵌杯病毒(calicivirus)是无囊膜的单股正链RNA病毒,具有广泛的宿主范围因而严重威胁着人和许多其他脊椎动物的健康。由于该病毒种属流行株多变、极易传播且呈现区域性感染,致使全球范围内因杯状病毒引起的公共卫生疾病频繁暴发,近年来,其感染发病率呈明显增加的趋势。不同属成员虽然感染不同种类的宿主,但其主要衣壳蛋白的结构类似。嵌杯病毒主要衣壳蛋白中含有免疫原性关键区域,能与宿主受体结合并可能介导感染过程,且氨基酸相关的免疫原性及受体结合位点的变异是公认的病毒进化的驱动力。本文就嵌杯病毒主要衣壳蛋白的基因组结构、免疫原性、受体结合情况以及遗传演化规律等方面的研究进展进行综述,以期为后续科学研究以及该病的有效防控提供参考。

猫泛白细胞减少症病毒SH0918株的分离鉴定及遗传进化分析

本文对2015—2022年收集的25份疑似猫瘟样本进行了PCR检测和病原分离,同时还根据测定的VP2基因序列,对本文分离的FPV流行毒株与国内外参考毒株的同源性以及遗传演化进行了分析。检测结果表明,在25份可疑样本中有6份FPV阳性样品。在对其VP2基因进行测序鉴定以后,我们重点对1株在F81细胞中增殖滴度较高的FPV(SH0918株)进行了分离和鉴定,并详细研究了该毒株的生物学特性。研究结果表明,SH0918株可以在F81中良好增殖,并产生特异性致病变效应,其TCID_(50)为10^(-5.11)/0.1mL;IFA的检测结果进一步证明在感染细胞中存在FPV的特异性蛋白表达;电镜检测结果表明,纯化的细胞培养物中存在典型的FPV病毒粒子;血凝试验结果表明,FPV能够凝集猪红细胞,血凝效价为1∶32。测定的FPV SH0918株的全基因组长5124 bp;序列比对分析结果显示,本文分离的毒株与参考毒株之间的核苷酸序列同源性为98.4%~100%;进化树结果表明:本研究中的FPV分离毒株基本属于同一分支,其中SH0918株与国内分离株JN-FPV-96、TZ-FPV-112的亲缘关系较近,但与欧洲分离株以及疫苗株亲缘关系较远。本研究内容一方面丰富了我国FPV的流行病学资料,另一方面对新型猫瘟疫苗的研发也具有一定的参考价值。

兽用mRNA疫苗的研究进展

疫苗接种是动物日常保健中必不可少的。近年来,随着免疫学研究的持续发展和分子生物学技术的不断完善,mRNA疫苗在动物传染性疾病防治方面取得了一定的成果,广受各方关注。为加深对mRNA疫苗的了解,本文将从mRNA疫苗主要类型、结构特征、免疫机制、独特优势及其在兽用领域的研究现状等几个方面,对兽用mRNA疫苗目前的主要研究进展作一系统性综述,以期为后续开展mRNA疫苗相关的研究提供参考资料。

一种无桥高增益单级LED驱动电路及其混合控制策略

中小功率的LED驱动电源中,传统两级LED驱动电源存在体积大、成本高以及传统Boost PFC电路在低压输入时导通损耗大等问题。为此提出一种由无桥二次型Boost PFC电路和DC-DC LLC电路集成的无桥高增益单级LED驱动电路,实现了高电压增益、功率开关器件软开关、一套控制电路和高电路转换效率。针对单级电路在电网输入电压变化引起直流母线电压变动范围大等问题,设计一种适用于所提电路的APWM-PFM混合控制策略,并对混合控制原理和控制过程进行详细分析。最后设计一台200 W的实验样机,在输入电压80~120 Vrms范围内,占空比最大为0.5,最大电压增益为6.7,直流母线电压基于网侧特性和LLC电路特性设计在700 V以内,样机的功率因数值均高于0.990,THD均低于15%。在满载条件下,110 Vrms输入时,样机效率为93.20%,相比于传统无桥PFC,电压增益提高了2.21倍,实现了高电压增益和软开关,有效提升了在低压输入条件下的电路转换效率。仿真和实验结果验证了所提出电路和控制方法的有效性。

一种BCM Boost PFC电路的VCFF控制策略

临界导通模式Boost功率因素校正(PFC)电路通常采用恒定导通时间(COT)控制策略,导致开关频率的变化与输入电压、输出功率以及电感有关,轻载下过高的开关频率将影响电路的转换效率,故提出一种谷底计数频率反走(VCFF)控制策略。通过检测MOS管两端电压谷底计数,使电路轻载时工作在断续模式,从而降低开关频率以提升轻载效率。实验结果表明,相比于COT控制策略,所提控制策略能够有效提高轻载效率。输入电压为220 Vrms下,10%~50%负载时效率在0.96以上。

干扰素刺激基因15抗病毒感染的分子机制

干扰素刺激基因15(ISG15)是由病原微生物或干扰素诱导产生的一种大小为15 kDa的泛素样蛋白。在干扰素诱导的数百个干扰素刺激基因中,ISG15是诱导最强烈、最快的ISG蛋白之一。研究表明,ISG15对多种病毒具有抗病毒作用。此外,ISG15在调节宿主损伤、DNA修复,调节信号通路及抗原递呈中也发挥着重要的作用。文章介绍了ISG15的概况,并阐述了近年来ISG15在抗病毒、免疫调节和调节宿主信号通路过程中的作用。

3株猫细小病毒的分离鉴定及其遗传进化分析

为了解猫细小病毒(FPV)在国内的流行状况及其遗传变异和演化方向,本研究对采集的30份疑似感染FPV的肛拭子进行检测,利用常规方法从中分离并鉴定出3株FPV。然后扩增出3株FPV的VP2基因,利用DNAstar等软件将获得的VP2基因与国内外报道的流行株和疫苗株的VP2基因序列进行比对和遗传进化分析。研究结果显示,本文分离的3株FPV均能在猫肾细胞中良好增殖,并产生典型致细胞病变(CPE),在电子显微镜下呈现典型的细小病毒形态特征。序列比对结果显示,此3株FPV的VP2序列与国内外参考毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.6%~99.8%和98.5%~99.8%;与疫苗株的VP2基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.1%~99.4%和99.1%~99.5%;进化树分析结果显示,本研究分离的FPV与国内流行株及疫苗株均具有较近的遗传距离,并处于同一拓朴群,但是SH612株和ZZ6293株与疫苗株的距离稍微远些,处于不同的拓朴亚群。本文研究结果丰富了中国FPV的流行病学资料,为进一步研发FPV疫苗提供了参考资料。

试论大数据技术下的企业财务信息化建设

伴随着大数据技术的不断进步与发展,企业财务信息化建设进程也在不断加快。在现代化企业发展规模不断扩大的同时,企业数据类型也变得越来越多,变化速度也在明显加快,而这也导致财务信息处理难度较高。因此,基于大数据技术构建财务信息系统,能够对各项数据进行采集、整理与分析,有利于深层次挖掘企业内部的高价值信息?确保企业管理人员在经营决策制订过程中不会受错误信息干扰,为企业良性发展提供充分保障。但从目前实际情况来看,大数据技术下的企业财务信息化建设依然面临着一系列挑战和问题,需要企业采取科学合理的措施优化财务信息化建设。 对此,文章分析大数据技术下的企业财务信息化建设优势与具体问题,提出科学有效的财务信息化建设策略。

犬瘟热病毒NT株分离鉴定、全基因测序与分析

为分析我国犬瘟热病毒的流行性特点及阐明该毒株的基因特征与遗传进化情况。本研究用表达SLAM受体的犬源Vero细胞系对犬瘟热病毒分离培养,并从南通、安徽两地收集的疑似犬瘟热病料(肺,脾)中分离出一株犬瘟热病毒,运用RT-PCR、病毒的半数感染量(TCID50)等方法对分离株进行鉴定,从而确定分离株为犬瘟热毒株,命名为CDV-NT-1。利用RT-PCR方法分段扩增此分离株的全基因组cDNA,用DNAStar软件比较CDV-NT-1分离株与GenBank上其他典型CDV毒株的同源性,并用Mega7.0软件进行系统进化分析。结果显示:CDV-NT-1株全基因组序列长度为15544 bp;CDV-NT-1与野毒株的同源性在97.6%~98.5%,而与疫苗株Snyder Hill、Phoca、Onderstepoort的同源性只有92.1%,CDV-NT-1与Asia-I位于同一分支,与疫苗株处于不同的分支,属于Asia-1型。本研究结果为CDV的研究奠定了基础。

侧流免疫层析技术在兽医诊断中的应用

侧流免疫层析使用有色标记物、荧光标记物或其他标记物等作为标记物,用于偶联抗原(抗体),用以检测抗体(抗原)的一种免疫化学反应。传统的侧流免疫层析依赖于肉眼观察,灵敏度较低,只能提供定性或半定量结果。新一代侧流免疫层析技术采用不同类型标记物和应用外部设备,对待检物进行量化,来呈现待检物的含量,从而实现开发具有定量、多组分检测能力的免疫层析测试。论文总结了侧流免疫层析标记物、检测原理以及在兽医诊断中的应用,以期为今后侧流免疫层析技术在兽医临床诊断中的应用和改进提供理论参考。

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株非结构基因的分子克隆及其基因特征的研究

对猪繁殖与呼吸综合征病毒的非结构基因 (ORF1)和非编码区分别进行了克隆和测序 ,并对其基因特征作了分析。结果表明 ,CH_1a株ORF1全长 11882nt,其中ORF1a长 75 12nt、ORF1b长 4374nt。它们与VR2 332株的核苷酸同源性分别为 89%、92 % ;与LV株的核苷酸同源性分别为 5 4%、6 3.3%。ORF1编码两个聚合蛋白 ,其中ORF1a编码的聚合蛋白经裂解后产生 6个成熟的非结构蛋白 (Nsp1α、Nsp1β、Nsp2_5 ) ,以Nsp2的变异性最为显著 ,它与LV株的氨基酸同源性为 41%。ORF1b编码的聚合蛋白经裂解后 ,产生 4个成熟的非结构蛋白 (RdRpCP2_4) ,其中RdRp为病毒的复制酶 ,CP4表现出较大的变异性 ,与LV株的氨基酸同源性为 48%。在ORF1a_ORF1b的衔接区有保守的庚核苷酸滑动序列和拟节结构 ,它们是核糖体移码翻译所必需的结构。在基因组末端存在非编码区 ,其中 5’NCR长 190nt,比LV株 5’NCR短 31nt,其核苷酸同源性为 6 1%。 3’NCR长 15 1nt,比LV株 3’NCR长 37nt,保守性稍高 ,其与VR2 332株和LV株的核苷酸同源性分别为 95 .4%和 78.2 %。在 3’NCR末端有一个poly(A)尾巴 ,长 2 0nt。在Poly(A)尾上游有保守的八核苷酸序列 ,是复制酶识别并结合的区域。

猪圆环病毒II型结构蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位预测

本研究以猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)II型的基因组序列为材料,采用Garnier-Robson方法、Chou-Farplus方法和Karplus-Schulz方法预测了其结构蛋白的二级结构,用Kyte-Doolittle方法对结构蛋白的亲水性进行了分析,用Emini方法预测了结构蛋白的表面可能性,以Jameson-Wolf方法预测了蛋白的抗原指数。然后综合评价了PCV-2型结构蛋白的B细胞抗原表位。结果表明,PCV-2结构蛋白形成α螺旋结构的能力较差,但是该蛋白含有较多的β折叠和转角结构,因而该蛋白具有丰富的二级结构。分析结果还表明结构蛋白具有多处抗原指数较高的区段,其中羧基端含有潜在的B细胞优势抗原表位,因此其在免疫学中的地位也应当引起重视。本研究将为猪圆环病毒的反向疫苗学的研究提供一定的理论依据。