自噬流的诱导与检测综合性实验的设计与实践

将国际前沿理论和技术拆解和提炼及时补充到实验教学中,是提高实验教学水平和人才培养质量的重要途径之一。该研究以科研成果为基础设计了“自噬流的诱导和检测”综合性实验,包含细胞传代培养、细胞转染、自噬诱导与观察3个部分,形成系统性、综合性和探究性的模块化实验教学内容,通过细胞培养、转染技术在细胞中表达双荧光标记自噬体标志蛋白,经饥饿诱导细胞,在荧光显微镜下观察自噬体和自噬流变化。在本科生实验教学中的实践结果表明,该实验有助于培养学生科研思维和创新意识、提升学生分析问题和解决问题的能力。

昆虫细胞程序性死亡的研究进展

在昆虫发育和抵抗病原微生物的入侵过程中,细胞凋亡与自噬性死亡现象十分常见。昆虫细胞凋亡的研究已经取得了许多的成果,但是有关细胞自噬程序性死亡的研究还正在深入。昆虫细胞凋亡的信号通路至少有3条:一条类似于线虫细胞的凋亡信号通路,另一条类似于哺乳动物细胞的凋亡信号通路,还有一条不依赖于胱天蛋白酶的凋亡信号通路。在昆虫的多种组织细胞中,细胞凋亡与自噬程序性死亡在信号通路上存在互串(crosstalking),可以相互促进、抑制或替代。了解昆虫细胞程序性死亡对防治害虫具有一定的意义。

昆虫差异蛋白质组:进展和展望

黑腹果蝇Drosophilamelanogaster、家蚕Bombyxmori、意大利蜜蜂Apismellifera和冈比亚按蚊Anophelesgambiae等昆虫的基因组测序已经基本完成,蛋白质组学技术将是阐明这些基因组功能的重要工具。本文综述了应用差异蛋白质组学技术在昆虫诱导性免疫、抗性机制和分子病理研究方面取得的一些成果:(1)细菌、真菌、脂多糖或机械损伤诱导的昆虫血淋巴或血细胞来源细胞系的蛋白质表达的改变;(2)Bt抗性昆虫中肠刷状缘膜和抗锥虫采采蝇Glossinamorsitans唾液腺多种蛋白质表达的改变;(3)化学农药处理和姬蜂Chelonusinanitus携带的多分DNA病毒引起的昆虫蛋白质组的变化。最后讨论了昆虫差异蛋白质组学研究的瓶颈与对策。

昆虫中肠Bt杀虫晶体蛋白毒素受体氨肽酶N的研究进展

鳞翅目昆虫中肠上皮细胞刷状缘膜 (BBM)上的Bt杀虫晶体蛋白毒素受体氨肽酶N(APN)的结构和位点密度的改变是昆虫对Bt毒素的主要抗性机制之一 ,该文简要综述了APN受体的研究进展。每种昆虫中肠上皮细胞中有数种APNs,彼此间同源性较高 ,其中部分APNs为Cry1A家族毒素的功能性受体。不同种类昆虫的APNs受体 ,甚至同一种昆虫的不同类型APNs,其所结合的毒素种类可能不同。APNs决定该昆虫对Cry1A类毒素的敏感程度差异。有些抗性昆虫的APNs基因编码区发生了多个点突变。

粉纹夜蛾细胞中Bt Cry1Ac选择抗性的研究及离体品系与毒素结合的比较

采用BtCry1Ac活性毒素对粉纹夜蛾BTI Tn 5B1细胞进行 5 6代筛选后获得了抗性比为 1 2 80倍的抗性细胞。ELISA检测表明抗性细胞总蛋白和膜蛋白结合的Cry1Ac数量都少于敏感细胞。配体结合Western杂交实验显示 :抗性细胞和敏感细胞的膜蛋白与总蛋白都有 5条电泳迁移率相同的毒素结合多肽带 ,其分子量分别为 2 0 7,1 5 8 5 ,1 1 8 8,72 ,3 8 5kD ;抗性细胞的 1 1 8 8和 72kD的阳性带比敏感细胞的略弱 。

斑节对虾组织的原代培养

选用Ｌ－１５，添加１０％～２０％ＦＢＳ，渗透压用ＮａＣｌ等调节，ｐＨ７．０，在２８℃下，原代培养斑节对虾的多种组织，发现淋巴器官，造血器官和血淋巴的组织细胞在较宽范围的培养基渗透压条件下能贴壁生长形成细胞单层．每升培养基添补７．５０ｇＮａＣｌ，０．３２ｇＫＣｌ，１．０２ｇＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ，０．４９ｇＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ，２．００ｇＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ和０．３０ｇ葡萄糖调节渗透压时。

浓核病毒研究概述

浓核病毒属于细小病毒科浓核病毒亚科,病毒颗粒为二十面体,无包膜,直径在18～30nm左右,基因组为单链DNA,末端具有发卡结构,大小为4～6kb,只感染无脊椎动物细胞。本文介绍了浓核病毒基因组的表达策略、宿主域及其决定因子、昆虫对浓核病毒的抗性机制,以及浓核病毒在卫生和农业领域潜在的应用价值。此外,也概括了浓核病毒对无脊椎动物养殖业潜在的威胁。

改良的L-15培养基对鳞翅目昆虫细胞生长和芹菜夜蛾核型多角体病毒增殖的影响

4种鳞翅目昆虫细胞系SL-ZSU-1、TnH5、Sf9和Ha．AM1都不能在L-15＋5％FBS或L-15＋350mg／L脯氨酸＋5％FBS（L-15-P，pH6．5）的培养基中生长，但是都可以在L-15＋3g／L水解乳蛋白＋3g／L酵母提取物＋1g／L葡萄糖＋5％FBS（L-15-LYG）、L．15＋350mg／L脯氨酸＋1g／L葡萄糖＋5％FBS（L-15-PG）、L-15＋1g／L葡萄糖＋5％FBSa（L-15-G，pH6．5）的培养基中生长。细胞从TNM-FH＋5％FBS（pH6．5）培养基中转入上述培养基后，适应期的长短相差较大。转入L-15-LYG中的细胞没有明显的适应期；转入L-15-PG中的细胞需1个月左右才能正常传代；转入L-15-G中的细胞需45～60d才能正常传代。L-15-LYG替代TNM-FH对4种昆虫细胞的形态、大小、最大生长密度和群体培增时间没有显著影响，对芹菜夜蛾核型多角体病毒AfaMNPV胞外病毒粒子的滴度没有明显的变化，但多角体的产量显著下降。

抗苏云金杆菌毒素Cry1Ac粉纹夜蛾细胞系的特性研究

为了从离体细胞水平探讨昆虫对苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的部分抗性机制,本文采用活化的Cry1Ac 毒素对粉纹夜蛾BTI-TN-581-4细胞连续筛选86代,获得了高水平抗性细胞,研究了其某些特性。它对Cry1c 产生了低水平的交互抗性,对低渗溶液的耐受性显著增强,双向电泳图谱表明抗性细胞膜蛋白组分发生了明显的变化。膜蛋白组分的变化可能导致了筛选细胞的耐低渗透压和抗Cry1C。

苏云金芽孢杆菌Cry1A毒素抗性相关受体类钙粘蛋白的研究进展

综述了Cry1A毒素的受体类钙粘蛋白的结构 ,受体与毒素的结合特性 ,受体基因在离体细胞中的表达和表达产物介导Cry1A毒素裂解细胞的功能 ,以及受体基因的突变与抗性的关系 。

对虾白斑症病毒的初步研究

对虾白斑症病毒可通过人工投喂感染克氏螯虾 ,病程发展迅速 ,死亡率高 .该病毒既可见在胞核中复制 ,也常见于胞质中装配 .通过差速离心 ,蔗糖垫层离心或密度梯度离心后 ,再将分离物中细胞源核酸消化掉 ,可提取出较纯的病毒 DNA.

对B.t毒素敏感与抗性的昆虫细胞的差异蛋白质肽质指纹分析

采用2-DE技术分析了粉纹夜蛾TnH5对B.tCrglAC毒素敏感和抗性2种细胞总蛋白质,建立了TnH5细胞双向电泳图谱,获得了一些差异蛋白质.对部分差异蛋白质点采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)测定了其胶内酶解后的肽质指纹图谱(PMF),查询数据库,结果表明,部分差异斑点分别与胞质外周蛋白、脂多糖生物合成蛋白、一种脱氢酶和类免疫球蛋白等类似.

克氏原螯虾精巢与输精管组织细胞原代培养方法初探

将剪碎的克氏原螯虾(Procambarus clarkii)精巢与输精管组织块分别接种于含20%FBS、双抗以及添加了适量无机盐等的M199-MK、MEM、S20、Grace’s和L-15培养基中,25℃恒温静置培养。结果表明,在Grace’s培养基中,只有少量组织块贴壁。在其余培养基中,大多数组织块能在1～2周内逐渐贴壁,L-15和S20培养基培养效果最好。组织块贴壁后,一些成纤维细胞和上皮样细胞逐渐从组织块迁移出来。传代后组织块可继续贴壁并重新迁移出一些成纤维细胞与少量上皮样细胞。添加部分草鱼细胞系PSF或斜纹夜蛾细胞系Sl驯化的培养基进行培养,驯化培养基:新鲜培养基=1:5(v/v),结果表明,Sl驯化培养基能促进细胞的迁移。组织块一般可离体培养2～4个月,但是都未能形成细胞单层。胰蛋白酶消化后分散的虾细胞不能贴壁。

Bt Cry1Ac抗性粉纹夜蛾离体细胞与敏感细胞mRNA的差异显示

为了研究昆虫对Bt的抗性机制 ,以苏云金芽孢杆菌Cry1Ac活性毒素对粉纹夜蛾离体细胞连续筛选 80代 ,获得了高抗性细胞。采用DDRT PCR技术比较了该抗性细胞与非选择敏感细胞mRNA的差异 ,经反向RNA斑点印迹杂交确证了 5个片段为两种细胞的显著差异表达序列标签(ESTs)。序列分析结果表明 ,敏感细胞特有的三种ESTs都位于cDNA的非编码区 ,两种ESTs(GenBank注册号 :S1 ,CF32 2 4 1 5 ;S3,CF32 2 4 1 7)与数据库中EST没有显著同源性 ,另一种S2(GenBank注册号 :CF32 2 4 1 6)与已登录的某些昆虫的ESTs具有一定的同源性。从抗性细胞特有的R1 (GenBank注册号 :CF32 2 4 1 3)推导出的氨基酸序列与磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶有 60 %～63%的同源性 ,从抗性细胞特有的R2 (GenBank注册号 :CF32 2 4 1 4)推导出的氨基酸序列与黏蛋白类有约 30 %的同源性。这些差异表达基因可能与抗性的形成相关。

一些化学物质对苏云金芽孢杆菌Cry1Ac毒素与昆虫离体细胞相互作用的影响

为探讨苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis(Bt)杀虫晶体蛋白与昆虫细胞的相互作用,以BtCry1Ac毒素和对该毒素敏感的粉纹夜蛾Trichoplusiani离体细胞BTITN5B14为材料,研究了一些化学物质对Cry1Ac毒素与昆虫离体细胞相互作用的影响。结果表明:N-糖基化抑制剂衣霉素、蛋白质合成抑制剂放线菌酮、胞吞作用抑制剂莫能菌素和胰蛋白酶预处理,都能不同程度地提高BTITN5B14细胞对Cry1Ac毒素的敏感性,其中胰蛋白酶预处理的作用最明显;而N-乙酰半乳糖胺不能抑制Cry1Ac毒素对这种离体细胞的毒力。

低等白蚁肠道共生微生物的多样性及其功能

低等白蚁肠道里存在着复杂的微生物区系,包括真核微生物鞭毛虫和原核生物,细菌及古细菌。低等白蚁的后肠以特别膨大的囊形胃及其氢氧浓度的明显梯度分布和丰富的微生物区系为特征,是白蚁进行木质纤维素消化的主要器官。后肠内的鞭毛虫能将纤维素水解并发酵为乙酸,二氧化碳和氢,为白蚁提供营养和能源。系统发育研究表明,低等白蚁肠道共生细菌的主要类群为白蚁菌群1、螺旋体、拟杆菌,低G+C mol%含量的革兰氏阳性菌和紫细菌等。而古细菌主要为甲烷短杆菌属的产甲烷菌。共生原核生物与二氧化碳的还原和氮的循环等代谢有关。但肠道共生微生物的具体功能和作用机制还有待进一步的揭示。

美洲黑杨(中嘉8号)离体叶片再生研究

用中嘉8号杨[Populus deltoids(I-63×I-69)]试管苗叶片作外植体,在添加不同生长素和细胞分裂素浓度配比的1/2(N)MS培养基上,筛选出叶片直接分化不定芽的最适培养基1/2(N)MS+0.2 mg/L BA+0.02 mg/LNAA+25 g/L蔗糖+7 g/L琼脂,不定芽分化率为85%。同时发现,一定浓度的KT对生根具有促进作用,最适生根培养基为MS+0.08 mg/L KT+0.02 mg/L NAA+25 g/L蔗糖+8 g/L琼脂,生根率为82.2%。

甲醛致酵母菌与大肠杆菌DNA-蛋白质交联作用的比较

为了探讨甲醛致真核生物与原核生物DNA-蛋白质交联(DNA-protein crosslinks,DPC)的作用,以毕赤酵母(Pichia pastoris)和大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α为材料,采用KCl-SDS沉淀法检测液态甲醛染毒后酵母菌与大肠杆菌中DPC含量。结果表明,低浓度(25μmol/L)甲醛不能引起酵母菌和大肠杆菌的DPC(P>0.05),而较高浓度(125和625μmol/L)甲醛可引起酵母菌和大肠杆菌明显的DPC(P<0.05);另外,酵母菌的DPC系数是大肠杆菌的DPC系数的10倍左右。这表明甲醛致真核细胞和原核细胞的DPC作用具有剂量效应关系,而且真核细胞的DPC系数比原核细胞的DPC系数更高。

鳞翅目昆虫细胞抗菌肽的诱导、筛选及抗菌活性的研究

选取3种离体培养的鳞翅目昆虫细胞系,采用热灭活的大肠杆菌诱导的方法,诱导其产生抗菌肽,并进行抗菌活性检测、诱导动力学研究及Tricine SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析.结果筛选到1株诱导抗菌活性较高的昆虫细胞系———粉纹夜蛾BTI-Tn-5B1细胞系,并发现该粉纹夜蛾5B1细胞在诱导后16 h产生了1个分子量大约为8 000的抗菌肽,抗菌活性检测表明其对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coliK12D31)、德氏卑沙门氏菌(Salmonella derby)均有不同程度的抑制作用,其中特别是对革兰氏阴性菌———大肠杆菌K12D31和德氏卑沙门氏菌有较强的抑菌活性.

Bt Cry1Ac毒素筛选的粉纹夜蛾离体抗性细胞与敏感细胞蛋白质组的差异分析

采用双向电泳技术和肽质量指纹图谱技术分析了BtCry1Ac毒素筛选的粉纹夜蛾Trichoplusiani抗性BTI_Tn_5B1_4细胞与同源敏感细胞的蛋白质组的差异。用MelanieViewerⅡ软件在抗性细胞的双向电泳图谱上检测到的平均蛋白质点数为 70 7± 2 5个 (n =3) ,在敏感细胞的双向电泳图谱上检测到的平均蛋白质点数为 6 37± 19个 (n =3) ,其中分辨率高、重复性良好的显著差异点有 10余个。对其中的一个敏感细胞特有的显著差异斑点进行了肽质量指纹图谱分析 ,经数据库查询表明该蛋白质与胞质外周蛋白具有同源性。