核心素养背景下的数学解题教学策略

随着时代的发展和教育理念的更新,数学教育目标不再仅限于简单的知识传授.如今,数学教学更加强调学生核心素养的培养,这种素养包含了解决问题的能力、创新思维的培养以及合作精神的培养.传统的数学教学方式已经无法满足新时代学生的需求,因此,本文从多个维度探讨如何在数学解题教学中培养学生的综合素养.

NP9基因的克隆及对细胞周期素D1转录活性的影响

背景与目的:NP9基因是我们在鼻咽癌中克隆到的一个新的表达下调的基因(GenBank登录号:BF718797),为了进一步研究该基因的功能,我们构建了人NP9基因编码区序列的真核表达质粒,并研究其表达对细胞周期素D1(cyclinD1)的影响。方法:通过核苷酸同源序列比较(BlastN)得到NP9EST的同源cDNA,RT-PCR扩增其编码区序列并构建真核表达重组质粒pRc/CMV2-NP9,脂质体转染后G418筛选出稳定、高效转录NP9基因的细胞克隆;再通过脂质体转染cyclinD1promoterLuc和NF-κB-Luc质粒到稳定表达NP9基因的细胞克隆,测定荧光素酶的活性以确定NP9基因对cyclinD1和NF-κB转录活性的影响;同时亚克隆NP9基因编码序列到载体pEGFP-C1中,脂质体转染细胞以确定NP9蛋白在细胞中的定位。结果:融合的绿色荧光蛋白出现于细胞核。G418抗性克隆中,RT-PCR扩增证实部分克隆表达NP9基因,且强弱不同。表达NP9基因的细胞克隆在瞬间转染cyclinD1promoterLuc和NF-κB-Luc48h后,荧光素酶的活性较其对照组分别下降46%和63%。结论:NP9蛋白在细胞核内表达;NP9基因通过抑制核转录因子NF-κB的转录活性下调cyclinD1的表达。

NP9对鼻咽癌细胞系CNE1基因表达谱的影响

目的:确定NP9表达对鼻咽癌CNE1细胞基因表达谱的影响。方法:稳定表达NP9基因和稳定转染空载体的CNE1细胞分别作为基因芯片分析的实验组和对照组,用高通量的基因芯片筛选实验组细胞的差异表达基因,荧光定量逆转录PCR验证部分基因表达差异。结果:所分析的14500个基因中,266个检测出有表达差异,其中82个基因呈现表达上调(RA>1),184个基因显示表达下调(RA<1)。显著上调和下调的基因分别为34个(RA>1.5)和75个(RA<1.5)。结论:NP9基因的表达导致了CNE1细胞中与细胞周期调控、细胞增殖和分化、细胞信号转导、细胞黏附相关基因表达的改变,为NP9的功能及分子机制研究提供了新的线索。

荧光素酶标记的肺癌细胞系的建立及动物模型验证

目的建立一株稳定表达萤火虫荧光素酶的人肺癌细胞系并通过裸鼠成瘤模型进行验证。方法酶切并连接萤火虫荧光素酶基因到真核表达载体pRc/CMV2上构建pRc/CMV2-luc重组质粒,脂质体2000转染到肺癌细胞株A549,经G418筛选得到抗性克隆,荧光素酶活性检测筛选出荧光素酶活性最高的稳定细胞克隆。小动物活体影像系统检测确定稳定细胞克隆生物发光能力和细胞数量的关系,建立裸鼠皮下成瘤模型并分析移植瘤的发光强度和肿瘤生长的相关性。结果重组质粒pRc/CMV2-luc转染A549细胞后,经G418筛选的抗性克隆传代至40代时,确定3株荧光素酶活性较高的阳性克隆,最高的9号克隆,1×105个细胞的RLU值为9.44×105。小动物活体影像系统检测发现阳性克隆的发光强度与细胞数量呈正相关(R2=0.99);9号克隆皮下接种裸鼠形成接种瘤,其发光强度与肿瘤的生长正相关。结论成功构建了稳定表达萤火虫荧光素酶的A549细胞系,该细胞系可在小鼠活体水平动态监测其发生、发展。

siRNA沉默LBH基因促进人支气管上皮细胞周期进展

目的:利用合成的小分子干扰RNA(siRNA)转染人支气管上皮细胞16HBE,观察LBH(limb-budand heart)基因表达下调对16HBE细胞周期及相关基因表达的影响。方法:脂质体2000转染靶向LBH基因的siRNA到16HBE细胞,荧光定量RT-PCR检测siRNA转染后LBH基因表达,流式细胞术检测LBH基因沉默后16HBE细胞周期的改变,荧光定量RT-PCR及Western blotting检测LBH基因沉默后细胞周期素E1和E2表达水平。结果:50 nmol/L siRNA转染16HBE细胞48 h后,LBH基因的表达水平只有对照组的14%;siRNA转染16HBE细胞48 h,其G1期细胞百分率比对照组减少9.28%,而S期细胞百分比增加14.08%;16HBE细胞在50nmol/L siRNA的转染后,细胞周期素E2的表达水平为对照组的2倍,而细胞周期素E1的表达没有发生明显改变。结论:靶向于LBH基因的siRNA能有效沉默16HBE细胞中LBH基因的表达,LBH基因的表达下调促进了16HBE细胞周期G1/S期的进展;细胞周期素E2的表达上调参与了LBH沉默导致的细胞周期G1/S期的进展。

NP9蛋白的原核表达及纯化

目的构建表达人NP9融合蛋白的重组体并进行融合蛋白的原核表达及NP9蛋白的分离和纯化。方法通过聚合酶链反应(PCR)得到NP9基因的编码区序列,克隆到原核表达载体pGEX-6P-3上构建重组NP9原核表达质粒。转化大肠杆菌后通过SDS-PAGE电泳和Westernblotting鉴定融合蛋白表达。使用GSTFF层析柱分离纯化NP9蛋白。结果得到序列正确的NP9基因及重组原核表达质粒pGEX-6P-3-NP9,SDS-PAGE电泳和Westernblotting证实重组质粒能够在大肠杆菌内受IPTG诱导表达,层析分离得到分子量为大约14kDa单一的NP9蛋白。结论成功构建了表达NP9融合蛋白的原核表达载体,该载体能在细菌内表达出GST-NP9融合蛋白,有效分离得到NP9蛋白。

浅谈建筑工程质量控制的重要性

"百年大计,质量第一"建筑工程质量是建筑工程项目投资效益得以实现的根本保证,建筑工程的质量控制是确保建筑工程质量的重要手段。应贯穿于整个工程项目建设的决策阶段、招投标阶段、施工准备阶段、施工阶段和竣工验收阶段。

人NP9基因蛋白重组腺病毒的制备

目的:制备表达人NP9蛋白的复制缺陷型重组腺病毒。方法:酶切pMD18TNP9质粒获得NP9基因编码区序列并克隆至穿梭载体构建重组pAdTrackCMVNP9载体,线性化后与pAdEasy1共转化BJ5183,通过同源重组得到重组的pADNP9病毒载体。将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒。结果:酶切鉴定得到阳性pADNP9重组腺病毒载体,该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装,转染3d后可以观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达并逐渐增多、增强。结论:成功构建了NP9基因的重组腺病毒载体并制备重组腺病毒颗粒,为进一步研究NP9基因的功能及应用NP9进行基因治疗奠定基础。

pTet-On鼻咽癌SUNE1细胞系的建立

目的:建立受四环素衍生物诱导表达外源基因的SUNE1细胞系,为研究特定基因定量表达在鼻咽癌的发生、转移及药物干预中的作用提供理想的细胞模型。方法:脂质体介导转染pTet-On质粒于鼻咽癌细胞系SUNE1,G418筛选得到稳定克隆,再瞬间转染pTRE-Luc,DOX诱导后检测光素酶(Luciferase)活性得到高水平诱导,低背景表达的SUNE1细胞系。结果:筛选得到的SUNE1细胞系受四环素衍生物诱导后能够低背景、高水平的表达。

P_(53)、c-erb-B_2、Bcl-2蛋白在肺癌中的表达及相互关系

目的 :检测P53、c_erb_B2、Bcl_2在原发性肺癌中的表达 ,探讨其表达的临床意义和相互之间的关系。方法 :采用LSAB法检测 99例原发性肺癌中三种癌蛋白的表达情况 ,并分析三者表达的相关性及与肺癌的临床因素的相关性。结果 :99例原发性肺癌中有 54例P53蛋白呈细胞核阳性表达 (54.5% ) ;非小细胞肺癌中P53的表达在≥ 50岁组明显高于 <50岁组 (P <0 .0 1) ,且与Be1_2的表达相关 (P <0 .0 5) ;c_erb_B2在肺腺癌中的表达显著高于鳞癌 (P <0 .0 0 5)和小细胞癌 (P <0 .0 0 5) ;肺小细胞肺癌中Bcl_2的表达高于肺鳞癌 (P <0 .0 5)和肺腺癌 (P <0 .0 1)。结论 :c_erb_B2、Bcl_2的表达与肺癌的组织学类型有关 ;P53的表达与年龄有关 ,而与性别、淋巴结的转移无关。

TGF-β_1对体外培养的大鼠心肌细胞肥大和凋亡的影响

目的:探讨转化生长因子β1(TGF-β1)对大鼠心肌细胞肥大和凋亡的影响。方法:建立TGF-β1诱导的体外大鼠心肌细胞肥大模型。透射电镜观察心肌细胞形态。碘化丙啶(PI)染色标记法检测心肌细胞RNA含量。实时荧光定量PCR(Real time PCR)检测心肌细胞胚心基因肌球蛋白重链β亚型(β-MHC)的表达。TdT-FragEL染色检测心肌细胞凋亡。Annexin/7AAD双染法、直接免疫荧光标记法经流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率及心肌细胞中caspase-3水平。结果:TGF-β1刺激24 h后,心肌细胞β-MHC mRNA水平明显高于对照组(P<0.01);PI染色结果TGF-β1组RNA含量明显增高,并呈剂量依赖性(P<0.01)。TdT-FragEL染色观察,TGF-β1可增加心肌细胞凋亡率(P<0.01)。与对照组相比,TGF-β1可明显上调心肌细胞中caspase-3(P<0.01);TGF-β1诱导的心肌细胞凋亡率增加(P<0.01)。透射电镜观察TGF-β1可诱导心肌细胞肥大和凋亡。结论:TGF-β1可同时诱导心肌细胞肥大和凋亡,诱导凋亡可能与caspase-3有关。

mtHSP70/HSV-tk重组沙门菌抗小鼠黑色素瘤的作用

目的研究携带结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)、人单纯疱疹病毒一胸苷激酶(HSV-TK)双基因的重组沙门菌瘤内注射抗小鼠黑色素瘤的抑瘤效应。方法构建重组沙门菌SL7207/PCMV-mtHSP70-IRES-TK,建立小鼠黑色素瘤动物模型,瘤内注射重组沙门菌观察其抑瘤效应、荷瘤鼠的生存期并进行安全性评估。结果瘤内注射重组沙门菌,实验组抑瘤率显著高于对照组,延长荷瘤鼠生存期,重组菌治疗后荷瘤小鼠的生存状态良好,无腹泻,治疗期间体质量无明显改变。结论减毒沙门菌携带的mtHSP70/HSV-TK双基因真核共表达质粒瘤内注射对B16肿瘤细胞具有显著抑制作用。

腺病毒气溶胶的实时荧光定量PCR检测和绿色荧光蛋白活细胞检测

将带有绿色荧光蛋白的复制缺陷型重组腺病毒,作为模拟病毒建立一种检测病毒侵袭力的方法.在钢化玻璃箱中通过TK-3型微生物气溶胶发生器将腺病毒形成气溶胶,用FA-1型多级撞击式空气微生物采样器进行气溶胶采样,对采样样品分别进行实时荧光定量PCR检测和表达了绿色荧光蛋白的PK15活细胞定时检测.实时荧光定量PCR检测可测定病毒在大气中存在的相对基因拷贝数,通过在荧光显微镜下计数带绿色荧光的PK15细胞数可直观检测病毒的感染力及活力.结果表明,重组腺病毒气溶胶主要分布在采样器第五级,腺病毒气溶胶与病毒粒子相比较大.

CTGF反义寡核苷酸对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖、胶原合成的抑制效应

目的 :研究结缔组织生长因子 (CTGF)反义寡核苷酸对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖、胶原合成及CTGF表达的抑制作用。方法 :差速贴壁法分离新生SD大鼠心肌成纤维细胞 (CFs)。反义、正义、错义CTGF寡核苷酸分别经阳离子脂质体介导转染CFs,并与血管紧张素Ⅱ (AngⅡ ) 10 -6mol/L共培养 4 8h ,采用MTT法测CFs生长数目 ,羟脯氨酸法测胶原蛋白含量 ,RT -PCR法及Westernblotting法分别测CTGFmRNA及蛋白水平的表达。结果 :AngⅡ可以在mRNA及蛋白水平明显促进CFsCTGF的表达 (P <0 . 0 1) ,且呈浓度 -时间依赖性。CTGF反义链组的MTT反应A值、胶原蛋白含量、CTGFmRNA及蛋白水平的表达量均明显低于AngⅡ组 (P <0. 0 1) ,而CTGF正义链组和错义链组与AngⅡ组无显著差异 (P >0 .0 5 )。结论 :AngⅡ刺激下产生的CFsCTGFmRNA和蛋白水平的表达上调 ,可能是心肌纤维化传导通路中的关键环节 ,CTGF反义寡核苷酸可以序列特异性地阻断CTGF的介导 ,从而抑制AngⅡ对心肌成纤维细胞增殖、胶原合成及CTGF表达的诱导作用 ,进一步证实CTGF可能是拮抗心肌纤维化的特异性靶位。

慢病毒和质粒作为shRNA载体沉默人卵巢癌RhoA基因效果的比较

目的研究慢病毒和质粒作为RNA干扰载体在沉默卵巢癌RAS同源基因家族成员A(RhoA)基因表达方面的差异。方法分别将慢病毒及质粒载体携带的针对RhoA基因的siRNA序列感染或转染卵巢癌HO8910细胞,经过嘌呤霉素筛选建立稳定沉默RhoA基因的细胞株。通过荧光显微镜观察、实时荧光定量PCR、Western blot法、血管形成实验、细胞划痕实验研究两种载体随着细胞培养代数的增加在抑制卵巢癌RhoA基因表达及侵袭和转移能力上的差异。结果采用质粒载体及慢病毒载体分别建立人RhoA基因稳定沉默卵巢癌细胞株,通过荧光显微镜观察,质粒组细胞绿色荧光蛋白的表达率随培养代数的增加而下降;第15代、第25代时表达率分别为70%、45%,而慢病毒组细胞绿色荧光蛋白表达率维持在95%以上,实时荧光定量PCR及Western blot法发现质粒组和慢病毒组细胞在第3代时RhoA mRNA及蛋白的表达无明显差异;随培养代数的增加,慢病毒组RhoA mRNA及蛋白持续低表达,而质粒组RhoA mRNA及蛋白的表达逐渐增高;细胞划痕实验及血管形成实验表明慢病毒较质粒作为载体介导siRNA对RhoA基因沉默更能持续稳定地抑制卵巢癌细胞的侵袭、转移(P<0.05)。结论慢病毒较质粒作为载体介导RNA干扰能更好沉默目标基因的表达。

Epstein-Barr病毒A73基因在鼻咽癌组织中的表达及其细胞内定位研究

背景与目的:A73基因是EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)BamHⅠA区右向转录物家族(BamHⅠArightwardtranscripts,BARTs)的主要成员,该家族基因转录表达于多种EB病毒相关细胞和肿瘤。本研究旨在了解A73基因在广东地区鼻咽癌病例中的表达特点,克隆该基因并明确其在上皮细胞中表达的亚细胞区域。方法:收集鼻咽癌组织、鼻咽非癌组织和鼻咽癌外周血淋巴细胞,常规培养SUNE1、B95.8、Raji和BJAB等细胞株,分别提取各样品的DNA和总RNA,以巢式PCR扩增W序列来检测EB病毒的感染,RT-PCR检测A73基因在各组织、细胞株中的表达,克隆测序后定向亚克隆入pEGFP-C2绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein,GFP)表达载体,通过脂质体转染技术将其转入人胚肾上皮(humanembryokidney293,HEK293)细胞,RT-PCR检测A73mRNA的表达,并通过激光共聚焦显微镜观察融合蛋白表达的亚细胞区域。结果:除BJAB细胞株外,所有标本中均检测到EB病毒W序列;A73mRNA在鼻咽癌组织中的表达率为79.63%(43/54),在鼻咽非癌组织中则仅为4%(1/25),两者差异有显著性(P<0.001);鼻咽癌外周血淋巴细胞中未检测到A73表达,SUNE1细胞中A73的表达高于B95.8和Raji细胞。所构建的A73重组质粒可稳定表达于HEK293细胞,其编码蛋白的表达以胞浆为主。

尾加压素Ⅱ促兔肺动脉平滑肌细胞增殖及机理探讨

目的探讨尾加压素Ⅱ(urotensinⅡ,U-Ⅱ)对兔肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的作用及机理。方法采用植块法培养家兔PASMCs,以MTT测定和[3H]-胸腺嘧啶核苷([3H]-TdR)掺入法观察U-Ⅱ对PASMCs增殖的影响,加入不同浓度的几种细胞内信号转导阻断剂,观察对U-Ⅱ效应的影响。结果U-Ⅱ(10-9mol/L-10-7mol/L)浓度依赖地促进PASMCs的A值增加及[3H]-TdR掺入,以10-7mol/LU-Ⅱ的作用最明显,A值和[3H]-TdR掺入量分别较对照组高429%和685%(P<005)。10-10mol/LU-Ⅱ对PASMCs增殖无作用。尼卡地平、W7、H7、PD98059在一定浓度范围内(10-7mol/L-10-5mol/L)均可以浓度依赖地抑制U-Ⅱ诱导的PASMCs的A值增加及[3H]-TdR掺入增加。在浓度为10-5mol/L时,其抑制作用最明显,A值的抑制率分别为423%、196%、232%和105%(P<005),[3H]-TdR掺入量的抑制率分别为466%、98%、217%和147%(P<005)。结论U-Ⅱ具有较强的促PASMCs增殖的作用,其诱导PASMCs增殖是通过Ca2+、CaM、PKC、MAPK来介导的。

4种不同生境的蟹类金属硫蛋白cDNA的克隆与比较

利用Carcinusmaenas金属硫蛋白氨基酸序列资料 ,用全简并引物从鳃组织总RNA中扩增并克隆了首个甲壳类金属硫蛋白cDNA片段序列 ,3’ RACE获得了其编码区全长cDNA .之后 ,用部分简并的引物扩增并克隆了其它 3种国内常见蟹类的金属硫蛋白cDNA编码区全长序列 .序列分析结果表明 ,几种蟹的金属硫蛋白cDNA序列存在差异 ,推知的氨基酸序列也不完全相同 ,比较不同蟹的cDNA和氨基酸序列数据不能证明不同生态环境对金属硫蛋白的分子进化起重要作用 .图 4表 1参

女孩性早熟患者中检出一种新的雌激素受体基因突变(英文)

对收集的16例未见血液雌激素水平升高的临床女孩性早熟患者的外周血样本,利用PCR-SSCP方法筛查了雌激素受体基因编码区的可能突变。结果在1例患者发现:其雌激素受体基因8号外显子编码精氨酸的548位密码子,1个C→T转换导致精氨酸残基被半胱氨酸所替代;这一突变使DNA序列中产生1个BtsⅠ酶切位点,通过PCR-RFLP实验证明此患者为Arg548/Cys548杂合体。为证明该突变在性早熟发生中的作用,构建了一个雌激素受体反应元件报道质粒pGL3-promoter-ERE;成功将野生型ESR1基因定点突变,并克隆于PCR3.1真核表达质粒。报道质粒和表达质粒共转染CMF-7细胞,Cys548突变能够增加萤火虫荧光素酶的产生。结果证明该突变雌激素受体在体外具有高活性特征,因而推测在体内也可能具有相应的过高活性,从而导致女孩的性早熟。

PPARs激动剂上调内皮细胞表达eNOS并增加NO生成

目的:观察PPARα激动剂非诺贝特及PPARγ激动剂赛格列酮对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)抑制NO生成的作用。方法:体外培养HUVECs,用1×10-7-1×10-4mol/L赛格列酮和10-5、10-4mol/L非诺贝特预处理HUVECs 24 h,再与10-6mol/L AngⅡ共同孵育12 h,通过RT-PCR和Western blotting分别检测eNOS mRNA和蛋白表达水平;通过Griees反应测定NO2-/NO3-浓度。结果:与对照组相比,10-7mol/L AngⅡ刺激HUVEC 12 h下调eNOS mRNA(0.38±0.19vs0.13±0.18,P<0.01)和蛋白(35.90±3.18vs6.95±2.19,P<0.01)表达,减少NO生成(50.21μmol/Lvs21.33μmol/L,P<0.01)。用10-7、10-6、10-51、0-4mol/L赛格列酮预处理24 h,上调eNOS mRNA表达(分别为0.36±0.03、0.36±0.14、0.37±0.16、0.43±0.06,与AngⅡ组比较,均P<0.01)和蛋白表达(分别为11.60±3.31、11.78±5.45、13.93±2.46、22.93±3.17,与AngⅡ组相比,均P<0.01),增加细胞培养液NO2-/NO3-浓度。非诺贝特也上调eNOS mRNA和蛋白表达,增加细胞培养液NO2-/NO3-浓度(P<0.01)。结论:AngⅡ减少eNOS表达,从而减少NO生成。赛格列酮和非诺贝特预处理24 h,可拮抗AngⅡ对HUVECs eNOS mRNA和蛋白表达的抑制作用,增加NO的释放。