基因缺失杆状病毒载体的构建及应用

为解决杆状病毒表达系统存在的表达量低和毒种种子批代次窄问题,加快杆状病毒表达系统产业化进程。本研究首次通过Red和Cas9两种重组技术,先后对影响蛋白表达的V-cath、ChiA、P10和重组杆状病毒基因组稳定性的FP25K和DA26基因进行缺失。同时基于对CSFV-E2蛋白的结构和糖基化预测分析,突变影响同源二聚体二硫键形成的糖基化位点。最后通过悬浮转染的方式提高拯救病毒的滴度。结果表明对E2基因突变后,表达的E2蛋白95%以同源二聚体形式存在。通过供体质粒优化和病毒载体基因缺失,E2蛋白的表达水平提高约4倍,可稳定表达蛋白的重组杆状病毒毒株代次从P7代延长至P20代。悬浮转染获得的重组杆状病毒滴度提高约70倍,同时获得足量低代次的毒种,有效缩短从毒种构建到蛋白表达时间,有效解决杆状病毒表达系统表达量低和毒种种子批代次窄的问题,为猪瘟亚单位疫苗研发奠定基础。

三种重组鸡痘病毒联合与单独免疫效力比较

目的:利用针对不同病原的重组鸡痘病毒(rFPV)在鸡群进行间隔性的多次免疫时,后期免疫会受到前期免疫所诱生的载体特异性免疫反应的干扰,并导致其免疫效力下降。将这些rFPVs进行联合免疫或许是解决此问题的一种策略。为验证rFPVs联合免疫的可行性,研究中将三种针对不同病原的rFPVs以联合或单独的方式分别进行免疫,并对它们的免疫效力进行比较。方法:rFPV-12LSH9A、rFPV-12LSH5NA及rFPV-12LSHN为分别表达H9亚型禽流感病毒(AIV)HA基因、H5亚型AIV的HA和NA基因及新城疫病毒(NDV)HN基因的三种rFPVs。将这三种rFPVs分别在SPF鸡和带有针对H9、H5亚型AIV及NDV三种病原母源抗体的商品鸡上进行联合或单独免疫。结果:这三株rFPVs在SPF鸡上进行联合免疫时,所诱生的体液免疫应答受到了一定程度的抑制;个别成员株的排毒及死亡保护也受到了显著的干扰。结论:在进行rFPVs联合免疫时,有必要对各成员株rFPV的免疫效力进行比较分析,以确定其可行性。

两株表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒的构建及其免疫效力

将H9亚型禽流感病毒(AIV)HA基因插入到具有新复制非必需区的通用型质粒载体pP12LS中构建转移载体pP12LSH9A,再分别转染预先感染不同毒力的2种鸡痘病毒(FPV)282E4株和LP株的鸡胚成纤维细胞,经系列蓝斑筛选纯化,获得了2种重组鸡痘病毒(rFPV),分别命名为rFPV282-12LSH9A和rFPVLP-12LSH9A。将这2株rFPV在SPF鸡和带有高水平抗H9亚型AIV母源抗体的商品鸡上分别进行免疫效力试验。结果:rF-PV282-12LSH9A和rFPVLP-12LSH9A在SPF鸡上的排毒保护率均为100%(10/10),在商品鸡上的排毒保护率分别为88%(23/26)和92%(24/26)。结果表明获得了2株在带有抗H9亚型AIV高水平母源抗体的商品鸡上免疫效力较好的rFPV。

重组鸡痘病毒首免与灭活疫苗加强免疫对高致病性禽流感免疫效果的影响

用表达H5亚型禽流感病毒(AIV)HA与NA基因的重组鸡痘病毒(rFPV)rFPV-12LSH5NA对10日龄带有H5亚型AIV母源抗体的商品鸡进行了首次免疫,17日龄时再用H5亚型AIV全病毒灭活疫苗加强免疫。免疫鸡分为2个批次,分别在24和31日龄用H5亚型AIV进行致死性攻击。在24日龄攻毒组中,rFPV首免与全病毒灭活疫苗加强免疫组的死亡比例(0/17)显著低于17日龄全病毒灭活疫苗单独免疫组(16/17)。在31日龄攻毒组中,rFPV首免与全病毒灭活疫苗加强免疫组的死亡比例(0/17)显著低于10日龄rFPV单独免疫组(6/17)。结果显示,在鸡群普遍存在针对H5亚型AIV母源抗体的情况下,rFPV首免与全病毒灭活疫苗配合使用能使鸡体快速建立坚强的免疫保护反应,是一种非常有效的免疫策略。

低剂量螺旋CT对肺癌高危人群筛查的价值

目的探讨低剂量双层螺旋CT对肺癌高危人群筛查临床应用的价值。方法通过对56例临床无症状的高龄及肺癌高危人群体检者行肺部低剂量双层螺旋CT扫描,扫描参数为120kV、30mAs,层厚5～7mm,层距2mm,螺距为2。在CT图像上,统计病变的检出例数,观察肺叶、段支气管显示情况。结果显示3mm以上的肺结节17例,纵隔淋巴结肿大12例。结论低剂量双层螺旋CT连续扫描方法适合开展肺癌高危人群筛查。

CT引导下经皮肺穿刺术的临床应用

目的探讨CT引导下经皮肺穿刺术临床应用的价值。方法应用弹簧式切割活检针在螺旋CT引导下对20例肺周围性肿块进行经皮肺穿刺。结果19例肺周围性肿块穿刺活检成功,其中19例取得了明确结果:肺癌16例,结核1例,炎性假瘤2例。气胸发生率为10%,咳血发生率为0%,肺内出血为5%,均未经特殊处理,自行缓解。结论CT引导下经皮肺穿刺术对肺内周围性肿块的良恶性的判断准确性高且安全。

近年来华东地区家鸭中禽流感病毒的亚型分布

【目的】为了研究近年来华东地区家鸭中禽流感病毒的亚型分布情况。【方法】对2002-2006年分离自华东地区家鸭的180株禽流感病毒的HA亚型和其中88株禽流感病毒的NA亚型分别进行了测定。【结果】近年来华东地区家鸭中至少存在9种HA亚型和6种NA亚型组成的H1N1,H3N1,H3N2,H3N8,H4N6,H5N1,H5N2,H6N2,H6N8,H8N4,H9N2,H10N3,H11N2共13种亚型的禽流感病毒。【结论】华东地区家鸭中有多种亚型的禽流感病毒分布,应加强家鸭禽流感的监测和防制工作。

H9N2亚型禽流感病毒传播途径特性的比较及其表面基因序列分析

选择中国大陆最早分离的H9N2亚型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）A／Chicken／Guangdong／SS／94（H9N2）（缩写为SS株）和1998年大流行时期分离的H9N2亚型AIV A／Chicken／Shanghai／F／98（H9N2）（缩写为F株）为研究对象，对其在SPF鸡体内的复制能力和传播途径特性比较后发现，F株在4周龄SPF鸡气管中的复制能力高于SS株，F株可以经气溶腔传播途径传播。SS株不能经气溶腔传播途径传播；利用反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）方法获取F株和SS株的HA和NA基因的cDNA，序列分析得知，F株和SS株的HA和NA基因的同源性分别是96．6％和98．1％；HA基因的裂解位点氨基酸序列都是PARSSR↓GL。但有5个氨基酸的盖异，即166位N（F）→D（SS）、198位A（F）→V（SS）、217位V（F）→I（SS）、335位G（F）→R（SS）、504位L（F）→S（SS）；2株病毒的NA基因在63～65住都存在氨基酸缺失，但在NA基因红细胞吸附位点的氨基酸序列不同，分别是IKKD—SRSG（F）和IKEDLRSG（SS）。F株和SS株的传播特性差异是否与其表面基因序列有关，有待进一步研究。

AFXLMS-CFPSO算法在阀门降噪中的仿真和应用

针对被动降噪法不能有效消除调节阀节流过程中产生的低频噪声的问题,提出了将主动降噪技术应用于阀门降噪的方法,通过在阀门噪声源附近增设次级声源的方式,来控制调节阀节流过程中产生的低频噪声。针对阀门噪声的特点,提出了一种将压缩因子粒子群算法和带修正因子的反正切函数变步长法相结合的滤波新算法(AFXLMS-CFPSO算法)。数值仿真结果表明,AFXLMS-CFPSO算法比传统的FXLMS算法、VSS-LMS算法、A-LMS算法收敛速度更快,稳态误差更小、稳定性和抗噪性更好。为了进一步验证AFXLMS-CFPSO算法的可靠性,在通过有限元声学仿真确定了最佳的次级声源位置后,对调节阀噪声降噪效果进行了实验验证,结果表明增设主动降噪设备后调节阀噪声的加权A声压级普遍降低了15~20 dB,再次验证了AFXLMS-CFPSO算法和主动降噪的可行性。

共表达H5亚型禽流感病毒HA和NA基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

为了构建更为安全有效地抵抗高致病性H5亚型禽流感病毒的基因工程疫苗,将H5亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因定向插入鸡痘病毒转移载体p11S中,H5A和NA基因的启动子分别为PS和PE/L,获得用不同的启动子启动不同的外源基因且两基因盒方向为背向串联的重组转移载体p11SH5ANA。将p11SH5ANA转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中。p11SH5ANA与wt-FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV-11SH5ANA。通过在含X-Gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑,获得纯化的重组病毒。经传代证实该重组病毒具有良好的遗传稳定性。用105PFU的rFPV-11SH5NA免疫无特定病原体(SPF)鸡,能激发机体产生有效的血凝抑制(HI)抗体。初步的动物试验表明,该重组病毒能使经肌肉注射攻毒的SPF鸡抵抗H5亚型AIV的致死性攻击,保护率为100%,显示出一定的应用前景。

鸡痘病毒复制非必需区的选择对重组鸡痘病毒免疫效力的影响

母源抗体的干扰是重组鸡痘病毒(FPV)活载体疫苗至今未能得到大规模推广应用的主要原因,而选择适当的FPV复制非必需区可能是解决这一问题的方法之一。根据已发表的美国致病株FPV的基因组设计两对引物,用PCR方法扩增FPV假定复制非必需区的两个侧翼区FPV1和FPV2 ,利用此假定复制非必需区构建FPV表达载体pP12LS及表达ZJ1株新城疫病毒(NDV)F基因的转移载体pP12LSF。pP12LSF与2 82E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞(CEF) ,经数轮蓝斑筛选得到纯化的重组病毒rFPV_FSC。重组FPV在CEF上连续传2 0代仍具有良好的遗传稳定性。对重组FPV进行免疫效力试验,在SPF鸡上,重组病毒rFPV_FSC和与之仅有复制非必需区差异的rFPV_FSB均能抵抗NDV强毒的攻击,提供10 0 %的保护。但在有母源抗体的商品鸡上,rFPV_FSC与rFPV_FSB的免疫效力却有显著差异,保护率分别为10 0 %和6 1 5 4 % ,rFPV_FSC的免疫效力与NDV常规油苗相当。试验结果表明,母源抗体对重组FPV的免疫效力有一定的影响。

表达新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒的遗传稳定性

本实验为了评价表达新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒(rFPV282E4-SF,rFPVLp-SF)的遗传稳定性,将其在鸡胚成纤维细胞连续培养20代。通过蓝斑来鉴定重组鸡痘病毒纯度,结果所有蚀斑100%变蓝。通过对第0、10和20代F基因扩增并进行序列测定,所有碱基和氨基酸序列均和原始转移载体序列完全一致,没有发生任何改变。随后又通过间接免疫荧光证实rFPV282E4-FS和rFPVLP-FS各个代次F基因的特异表达。所有结果均显示了上述重组鸡痘病毒具有良好的遗传稳定性,满足兽医生物制品的遗传稳定性要求。

荧光定量RT-PCR检测H5亚型禽流感病毒方法的建立与验证

根据H5亚型禽流感病毒HA基因上的保守序列,设计合成引物,以H5亚型禽流感病毒HA基因重组质粒为标准品绘制标准曲线,建立了荧光定量逆转录聚合酶链反应检测方法。结果表明,本试验建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.995,灵敏度约为8拷贝/μL,相当于8个AIV颗粒,对新城疫病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好、重复性佳,为H5亚型禽流感病毒检测提供了一种特异、敏感、快速、低成本、高通量、生物安全性好的定量检测方法。对178份临床泄殖腔棉拭子样品的检测,该方法结果与经典病毒分离方法符合率大于90.0%,在禽流感病毒临床样品快速筛检、流行病学监测等方面显示了良好的应用前景。

华东地区家鸭中N2亚型低致病性禽流感病毒神经氨酸酶基因的重排

为研究华东地区家鸭中低致病性禽流感病毒NA基因的遗传进化规律,对2000年-2006年分离的包括H3N2,H5N2,H6N2,H9N2和H11N2的44株禽流感病毒的NA基因进行了遗传进化分析。44株病毒NA基因之间的同源性为82.9%-99.9%,4株H9N2病毒的NA基因同源性为96.9%-99.9%,所有H3N2病毒的NA基因同源性为92.3%-99.9%,H5N2、H6N2和H11N2病毒的同种亚型毒株间的NA基因同源性变化幅度较大,相反,有些不同HA亚型毒株间的NA基因同源性反而很高。进一步分析NA基因推导的氨基酸序列也表现出相似的规律。华东地区家鸭中N2亚型的禽流感病毒正处于不断地进化状态中,不同N2亚型的禽流感病毒之间已存在NA基因的重排。

六株H4N6亚型水禽禽流感病毒分离株NA基因的进化分析

为了丰富禽流感病毒(AIV)神经氨酸酶(NA)的分子流行病学资料,通过对2002～2007年分离自华东地区家鸭的6株稀有H4N6亚型低致病性AIV的NA基因序列进行的分析,发现病毒NA基因全长约1464～1465bp,开放阅读框(ORF)都位于NA基因的19～1431位,长度均为1413bp。6株病毒NA基因之间的同源性为90.8%～99.8%,其中5株病毒NA基因的同源性非常高,达到96.0%～99.8%,但另外1株与其他病毒NA基因的同源性相对较低,介于90.8%～92.2%,进一步分析表明该病毒可能来源于其他地区禽类。对NA基因的推导氨基酸分析表明,ORF编码470个氨基酸,NA没有发生茎部缺失。研究结果表明,水禽内的H4N6亚型禽流感病毒进化相对比较缓慢。

宫颈组织中HPV16E6蛋白的表达

[目的]检测人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16E6蛋白在宫颈组织中的表达情况及其与宫颈病变的关系。[方法]选择宫颈脱落细胞学检查异常者中进行宫颈活组织检查的213例为研究对象,根据病理学诊断分为CCSC(宫颈鳞状细胞癌)组,共13例;CIN(宫颈上皮内瘤变)组,共114例;无病变组,86例。采用免疫印迹(Western blot)方法分别检测宫颈组织中HPV16 E6蛋白的表达。[结果]①宫颈脱落细胞学检查异常者CSCC发病率为6.1%(13/213),CINⅢ发病率为18.3%(39/213),CINⅡ发病率为23.9%(51/213),CINⅠ发病率为11.3%(24/213),无病变者占40.4%(86/213)。②3组宫颈组织中HPV16 E6表达阳性率分别为61.5%(8/13)、37.7%(43/114)、24.4%(21/86),两两比较P均﹤0.05。③相关分析发现HPV16 E6表达阳性率与宫颈病变严重程度呈正相关(r=0.68,P﹤0.05)。[结论]发生病变的宫颈组织中出现HPV16 E6阳性表达,其阳性率随病变级别的升高而增加。

3株表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒的免疫效力比较

作者旨在探讨鸡痘病毒ORF073或ORF214基因缺失后,在母源抗体存在情况下对重组病毒免疫效力的影响。将构建好的在ORF073或ORF214基因插入H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒(rFPVLP-△73LRH5A、rFPVLP-△214LRH5A)及单表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒(rFPVLP-12LSH5A)分别免疫SPF鸡和商品鸡,检测重组疫苗诱导的免疫效力。结果:3种重组鸡痘病毒在SPF鸡产生较高的HI抗体效价及100%的免疫保护;在HI母源抗体效价为2.45的商品鸡体内基因缺失株重组病毒比rFPVLP-12LSH5A易于清除,抗体上升缓慢而且免疫28 d后HI抗体效价较低,免疫保护率低,分别为16.7%和23.3%;在母源HI抗体效价为0的商品鸡体内基因缺失株重组病毒免疫后产生的抗体效价高,免疫28 d后分别达到3.50和3.17。结果表明在商品鸡体内母源抗体影响下,缺失ORF073或ORF214基因的重组鸡痘病毒的免疫效力降低。

表达鸡马立克氏病病毒糖蛋白B基因重组鸡痘病毒毒种的纯净性检验及冻干疫苗的保存期测定

为了检测高效表达鸡马立克氏病病毒gB基因的重组鸡痘病毒(rFPV-gB/R)的纯净性,对纯化后的0代重组病毒毒种进行了细菌和支原体检验;并对中间试制的冻干疫苗在-20℃保存期进行了测定。结果表明,重组病毒毒种高度纯净,没有污染任何细菌或支原体,符合新制品制造和检验规程申报的要求;中试冻干疫苗在-20℃保存了12个月,病毒含量始终大于109PFU/mL,疫苗保存期可达12个月。

拜特灭毒威对H_5亚型禽流感病毒的杀灭试验

禽流感是由正粘病毒科中的H5亚型禽流感病毒(AIV)引起的一种烈性传染病,一旦爆发会给养禽业带来毁灭性的危害。近年来,由于国内外时有从活禽市场检出H5亚型禽流感病毒或发生禽流感等情况,故加强对禽流感的防制工作极为重要。本试验采用长沙拜特生物科技研究所生产的拜特灭毒威对H5亚型禽流感病毒进行灭毒试验。结果表明,拜特灭毒威在1∶4000至1∶15000或1∶4000至1∶20000的浓度范围内与AIV作用5min或10min,对AIV的杀灭率可达99.9%以上;稀释度在1∶8000以下作用5min或1∶10000以下作用10min,杀灭率均为100%。

胸腔置管引流联合灌注IL-2及顺铂治疗恶性胸腔积液

目的探讨中心静脉导管胸腔闭式引流下联合灌注顺铂和白细胞介素(IL)-2治疗恶性胸腔积液的疗效。方法将病理诊断为恶性胸腔积液的68例患者随机分成2组。治疗组深静脉导管胸腔闭式引流注入顺铂60 mg+IL-2 200万U,1～2次/周,共2～4次;对照组给予普通胸腔穿刺放液后注入顺铂60 mg,1～2次/周,共2～5次,观察疗效和不良反应。结果治疗组有效率83.58%,和对照组有效率53.33%比较,2组有显著性差异(P<0.05)。结论胸腔置管引流术,胸水引流彻底,且速度可控制,同时配合胸腔灌注化疗及IL-2免疫治疗,可提高晚期癌症合并胸水的治疗效果。