骨源性ALK3在骨关节炎中的作用与调控机制

目的关节力学稳态破坏导致软骨及软骨下骨(subchondral bone)病理重塑,促使骨关节炎(OA)发生。但现有OA研究主要局限于软骨,忽视了软骨下骨的病理作用,如OA的过度骨吸收、软骨下板退化等。目前BMP2的临床副作用尚未根本解决,这提示该通路的核心节点——膜受体ALK3还存在某些未知的病理机制尚未阐明。因此,本研究旨在探究软骨下骨源ALK3对OA骨学病变的作用及机制。方法构建ALK3成骨特异敲除鼠(3.2kb-Col1a1-Cre ER;ALK3F/F),利用强制跑步建立OA模型;分析OA组织病理学特征及应力变化,重点关注软骨下骨病变;体外建立成骨-破骨细胞共培养的高应力加载体系,分析成骨细胞的旁分泌情况及其对破骨细胞分化的影响;高通量测序筛选ALK3下游力学敏感分子信号。结果相比OA小鼠,成骨谱系特异敲除ALK3的小鼠OA症状减轻,其软骨下骨的骨量增加,高应力下降,破骨细胞减少。细胞实验进一步表明,敲除ALK3的成骨细胞不利于破骨细胞分化,其成骨细胞Hippo/YAP信号上调,RANKL/Opg旁分泌下降。结论抑制小鼠成骨源ALK3减轻软骨下骨的过度骨吸收,改善了高应力病理微环境,从而缓解了OA症状;其机制可能为ALK3缺失导致成骨细胞对高应力刺激不敏感,通过上调Hippo/YAP减少RANKL/Opg旁分泌,从而抑制破骨细胞分化。本研究从骨学视角为OA防治策略提供了新思路。

微图案化表面对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及机制

目的探讨两种形状微图案化表面对大鼠骨髓间充质干细胞(r BMSCs)成骨分化的影响及机制。方法利用q RT-PCR技术检测三角形和圆形微图案化表面上r BMSCs成骨基因Runx-2、Opn、Alp、Col-1、Ocn和成脂基因Pparγ、C/ebpα、AP2的表达情况,利用免疫荧光和q RT-PCR技术检测三角形微图案化表面上Piezo1、F-actin、Myosin和YAP的表达情况。结果三角形微图案化表面上r BMSCs的成骨基因Runx-2、Opn、Alp、Col-1、Ocn的表达均升高,且边长为15μm时表达最强,而成脂基因Pparγ、C/ebpα、AP2表达均降低。在圆形微图案化表面,r BMSCs的成骨和成脂基因表达均下调。此外,在15μm三角形微图案化表面上,r BMSCs的Piezo1、F-actin、Myosin和YAP表达均升高。通过使用Piezo1抑制剂Dooku1处理,观察到这些蛋白的表达均降低,且细胞的成骨能力受到抑制。结论三角形微图案化表面能够显著促进r BMSCs的成骨分化,尤其是在边长为15μm时效果最为显著。该表面通过Piezo1信号通路促进r BMSCs成骨分化,涉及的关键信号分子包括Piezo1、F-actin、Myosin和YAP。

骨质疏松小鼠骨组织基质囊泡对血管钙化的影响研究

目的血管钙化是一种与骨骼生理矿化相似的生物过程,血管平滑肌细胞(SMCs)分化为“钙化”成骨表型,分泌钙化的基质囊泡(MVs)。流行病学证据表明,骨质疏松患者发生血管钙化的风险显著增高。体内骨骼和血管通过骨-血管轴相关联,骨源性细胞可通过分泌生化因子等胞间媒介影响血管健康。本课题组前期发现骨质疏松(OVX)发生后,血液中游离的MVs增加,可能会通过血液循环参与机体内异位矿化。因此,拟探究骨质疏松骨组织MVs对VC的影响。方法通过双侧去卵巢手术构建OVX小鼠模型,茜素红染色检测血管钙盐沉积;超速离心法分离提取正常和骨质疏松小鼠成骨细胞MVs(CT-MVs和OVX-MVs),NTA比较数量变化,蛋白质组学分析比较内容物差异;CT-MVs和OVX-MVs分别与SMCs共培养,q PCR和WB检测SMCs成骨分化标志物;最后,Apo E-/-小鼠尾静脉注射CT-MVs和OVX-MVs,茜素红和Von Kossa染色检测VC。结果(1)OVX小鼠骨质流失增加,伴随血管钙盐沉积加重;(2)OVX-MVs数量增多且高表达BGN等成骨分化相关蛋白;(3)OVX-MVs促进SMCs成骨分化,SMCs标志物α-SMA显著下调,成骨标志物Runx2、ALP显著上调;(4)OVX-MVs促进血管钙化。结论骨质疏松发生后,成骨细胞MVs数量增加且高表达成骨分化相关蛋白,促进SMCs成骨分化,加速血管钙化进程。

AnxA5在成骨细胞胞外囊泡介导骨形成中的作用及机制研究

目的骨质疏松是一种以骨量减少、骨密度降低为主要特征的疾病,常伴随着骨组织中力学微环境的改变。胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是胞间通讯的重要信使,在骨形成过程中发挥至关重要的作用。本研究拟基于骨质疏松模型探索成骨细胞EVs在骨形成中的作用及其机制。方法通过双侧去卵巢构建骨质疏松小鼠模型,收集正常和骨质疏松成骨细胞释放EVs与骨髓间充质干细胞共培养,通过茜素红染色检测其成骨能力的变化。蛋白质组学检测EVs内容物组分变化。采用MC3T3-E1构建敲降膜联蛋白A5(Annexin A5,Anx A5)的成骨细胞株,通过Western blot检测成骨分化标志物的表达,通过NTA和BCA检测EVs的释放,通过TEM、免疫荧光检测EVs的黏附。通过尾静脉给骨质疏松小鼠注射Anx A5重组蛋白检测骨质量的变化。结果发生骨质疏松后,成骨细胞EVs的促矿化能力显著减弱。内容物组分分析发现,与正常小鼠相比,骨质疏松小鼠成骨细胞EVs中Anx A5表达显著减少。敲除Anx A5后,成骨细胞MC3T3-E1形成矿化结节的数量显著减少;EVs的释放数量减少,EVs的ALP活性减弱,EVs与细胞外基质的黏附数量也明显变少。将Anx A5注射入骨质疏松小鼠后,小鼠的骨密度、骨小梁数量等均显著增加。结论Anx A5通过介导骨矿化过程中胞外囊泡的释放和黏附促进骨形成。

流体剪切力调控血管平滑肌细胞向巨噬样细胞表型转化促胸主动脉夹层形成的机制研究

目的胸主动脉瘤(TAA)与胸主动脉夹层(TAD)是一类严重危害人们身体健康和生命安全的重大疾病。目前,TAA和TAD的发病机制尚不清楚,更不了解TAA向TAD转化的分子机制。前期研究发现,在TAA向TAD演变的进程中,VSMCs发生巨噬样细胞表型转化,且受流体剪切力的调控。本研究旨在探明流体剪切力诱导VSMCs巨噬样细胞表型转化的力学生物分子机制,为解析TAA向TAD演变的机理提供新方向,为TAA和TAD的药物治疗提供新的分子靶标。方法对临床TAA和TAD样本进行单细胞测序及分析;基于医学影像数据模拟计算TAA和TAD病变部位的流体剪切力变化,并通过体外力学加载实验探究出合适的力学加载条件;在此基础上通过体内外力学加载实验流体剪力调控VSMCs表型转化的分子机制。结果数值模拟表明,VSMCs在TAA和TAD的血管组织中受到的流体剪力均值分别为1.0、40 dyn/cm^(2);流体剪切力显著下调PTCH1及上调GLI2的表达水平,该过程伴随VSMCs的巨噬样细胞表型转化;过表达PTCH1和抑制GLI2可显著阻碍流体剪力诱导的VSMCs巨噬样细胞表型转化,延缓TAA向TAD的转化进程。结论流体剪切力通过PTCH1-GLI2信号轴诱导VSMCs巨噬样细胞表型转化,从而促进TAA向TAD的演变。

构建微流控血管芯片探索血流动力学调控颅内动脉瘤血管重塑

目的颅内动脉瘤(IA)是颅内血管发生的病理性膨出。本研究拟构建能连续模拟动脉瘤膨出的三维微流控血管芯片,探究IA膨出过程中血流动力学调控血管内皮细胞(VECs)炎症和血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转化,以及IA血管重塑的力学生物学机制。方法设计直径为2 mm,分叉角度为110°的“Y”型微流控通道,通过负压吸引连续控制IA弹性膜膨出。以Gel MA胶为支架,构建了VECs/VSMCs三维共培养体系。利用该芯片模型,采用免疫荧光标记连续观测IA不同膨出阶段的促炎因子(IL-1β、IL-6)、VSMCs表型转化,以及细胞外基质胶原成分的变化,探索IA血管重塑机制。结果IA芯片模型CFD结果证实:扩张瘤体空腔内从早期动脉分叉处高剪切力层流,逐渐发展为低剪切力涡流。VECs/VSMCs细胞共培养体系形成了多层结构的仿生IA血管段。随着膨出程度的增加,内皮炎症显著增强,VSMCs发生由收缩表型向合成表型、随后由合成表型向促炎衰老表型的转化,胶原含量在早期增加后逐渐降低,与IA动物模型观察结果一致。结论成功构建了三维微流控IA血管芯片,能够精确控制IA管壁(弹性膜)的膨出尺度并实现“弹性膜-Gel MA胶-细胞”的同尺度扩张。基于该芯片,初步阐明了血流动力学调控IA血管炎性应答介导VSMCs表型转化,血管基质降解与合成之间的时序规律。

构建ROS和MMPs力学双响应脂质体纳米颗粒靶向诊疗颅内动脉瘤

目的颅内动脉瘤(IA)破裂是蛛网膜下腔出血的主要原因。由于IA发展过程中的隐匿性和复杂性,目前缺乏有效手段用于IA早期诊断和治疗。根据IA特殊的力学微环境,拟设计活性氧/基质金属蛋白酶(ROS/MMPs)双重力学响应的仿生纳米脂质体用于IA早期诊疗。方法通过小鼠IA模型及体外模型,验证低剪切力涡流促进IA血管段内皮细胞和平滑肌细胞ROS和MMP2/9的高表达。通过酰胺化反应将阿司匹林(ASA)和IR-1061结合到MMPs响应性多肽。薄膜法制备可靶向到IA的IR1061-MRP-ASA和ECM修复药物PGG的仿生纳米脂质体,NTA和TEM确定纳米的粒径和分散情况,HPLC测定PGG的释放规律,IF检测细胞对脂质体的内吞情况;ELISA检测仿生脂质体的抗炎治疗效果。通过小鼠IA模型和血管芯片体外模型,验证纳米颗粒的靶向、控释、治疗和成像能力。结果成功构建PGG/IR-ASA@MNPs纳米脂质体,NTA和TEM证实脂质体分布均匀。细胞实验及在体实验证实纳米脂质体无明显毒性。过氧化氢和脂多糖(LPS)刺激血管内皮和平滑肌细胞能显著增强NPs的靶向、响应释放和抗炎能力。体内治疗效果显示,PGG/IR-ASA@MNPs纳米脂质体可显著减少血管内皮炎症,促进了IA血管壁的修复。结论PGG/IR-ASA@MNPs具有良好的靶向和抗炎能力,可有效降低IA破裂风险。

他克莫司/三氧化二砷复合药物洗脱支架的生物安全性评价

目的经皮冠状动脉支架介入治疗是目前治疗冠状动脉硬化性心脏病的主要手段。药物洗脱支架虽可以通过抗增生药物的原位释放有效抑制支架内再狭窄的发生,但其在抑制血管平滑肌细胞过度增生的同时也抑制了血管内皮层的愈合,导致血管内皮功能障碍。他克莫司/三氧化二砷(TAC/ATO)复合药物洗脱支架具有很好的抗内皮细胞炎症反应、抑制平滑肌细胞的过度增生功能,但其生物安全性尚不清楚。方法使用BMS支架(对照组)和TAC/ATO复合药物支架通过兔髂动脉植入兔腹主动脉,ICP-MS测定7、14、30、90、180天的血液、毛发、粪便和支架段血管的砷元素含量;病理切片和HE、Masson染色观察7、14、30、90、180天的心、肝、脾、肺、肾组织的病理变化。结果ICP-MS结果表明,在7、14和30天时间点,复合药物组在血液、毛发、粪便和支架段血管组织的砷含量均明显高于BMS组,但随着时间推移,90、180天的复合药物组的组织砷含量及血药浓度逐渐接近BMS对照组;病理切片实验结果表明,在7、14、30、90和180天时间点支架均未对重要脏器的正常生理结构造成显著影响,也并未引起组织炎症反应。结论本研究证明TAC/ATO复合药物洗脱支架具有较好的生物安全性。

缺血性脑卒中血管芯片的构建及再灌注内皮损伤机制研究

目的缺血再灌注损伤(IRI)是脑血管严重狭窄或堵塞后,血流恢复灌注而引发的继发性损伤。针对脑卒中患者采用的静脉溶栓(IVT)和机械取栓(MT)两种再灌注治疗均会引起脑IRI,然而这两种方法对血管内皮细胞的影响及机制研究却鲜有报道。据此,设计了一种气动控制的缺血性脑卒中血管芯片,用以动态模拟并实时观察缺血再灌注过程,探讨渐进(IVT)和瞬时(MT)再灌注对内皮功能的影响。方法构建缺血性脑卒中血管芯片,采用气动法分别模拟不同再灌注过程,检测内皮细胞内皮间充质转化(End MT)、促炎因子(MCP-1、IL-1β、IL-6)、血管黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)和紧密连接(ZO-1、Occludin)等表达变化,并评估白藜芦醇(REV)和阿司匹林(ASA)两种药物对IRI的治疗效果。结果两种再灌注方式都会导致缺血后更严重的内皮功能障碍,血管内皮细胞发生End MT,促炎因子释放增加、黏附分子表达上调、紧密连接丢失。与渐进再灌注相比,瞬时再灌注的内皮功能损伤更为严重。REV和ASA对促炎因子和黏附分子的表达均有抑制作用。结论与瞬时再灌注(MT)相比,渐进再灌注(IVT)会造成更严重的内皮细胞功能障碍,血管内皮细胞发生End MT,触发更严重的炎症反应,因此MT对内皮功能影响更小。该芯片模型可作为IRI治疗药物的初步验证平台。

流体剪切力通过MIEN1调控内皮血管生成

目的动脉粥样硬化(AS)是心血管疾病主要的病理基础,流体剪切力(FSS)调控AS斑块血管生成和内皮损伤修复,对AS斑块的稳定和破裂起决定性的作用。然而,血管内皮细胞响应不同的FSS模式启动血管生成的力学生物学机制尚未阐明。方法在Matrigel胶上生长的血管内皮细胞(HUVECs)施加层流的剪切力(LSS,15 dyn/cm^(2))和扰动剪切应力(DSS,范围为0.5±4 dyn/cm^(2)),探讨FSS对血管内皮细胞血管生成能力的影响。RNA-seq转录组分析在不同的剪切力作用中的差异表达基因,构建RNAi MIEN1细胞株。通过WB、q PCR、IF测定VEGF家族蛋白、膜蛋白MIEN1的表达、细胞骨架F-actin和MAPK信号通路上关键蛋白表达水平的变化。结果与LSS组相比,DSS组内皮细胞的血管生成能力显著下降;DSS组VEGFB和MIEN1表达下调且骨架发生紊乱。DSS通过膜蛋白MIEN1调控了血管内皮细胞的血管生成能力,依赖于MIEN1-ERK/MAPK信号通路。结论扰动流DSS通过抑制MIEN1-ERK/MAPK信号轴以及骨架重排抑制了HUVECs的血管生成能力。

通过负载miR10a的仿生脂质体靶向重编程巨噬细胞线粒体代谢治疗动脉粥样硬化

目的动脉粥样硬化是一种慢性血管炎症疾病,与斑块内M1/M2巨噬细胞表型失衡密切相关。将促炎性M1巨噬细胞重编程为抗炎性M2表型已成为治疗动脉粥样硬化的一种极具前景的策略。然而,这种方法的有效性受到重编程效率的阻碍。本研究开发了一种仿生脂质体mi R10a/S@H-MNP,通过挽救线粒体功能障碍并诱导M1巨噬细胞转化为M2表型治疗动脉粥样硬化。方法将流体响应性mi R10a封装于ROS响应性脂质体;通过共挤出方式包裹红细胞膜,并通过点击化学方式修饰巨噬细胞靶向分子PEG-HA得到仿生脂质体(mi R10a/S@H-MNP);体外评价mi R10a/S@H-MNP对M1型巨噬细胞线粒体功能的调节和重编程巨噬细胞表型的能力;体内评价mi R10a/S@H-MNP治疗动脉粥样硬化的能力。结果mi R10a/S@H-MNP在高ROS环境释放mi R10a,有效清除线粒体活性氧,增强线粒体生物发生,并激活线粒体氧化磷酸化(OXPHOS),成功重新编程M1巨噬细胞为M2表型。此外,静脉注射mi R10a/S@H-MNP可靶向动脉粥样硬化部位炎性巨噬细胞,重编程斑块巨噬细胞表型并显著抑制动脉粥样硬化斑块进展。结论mi R10a/S@H-MNP可重编程巨噬细胞线粒体代谢,驱动M1巨噬细胞向M2表型转化从而治疗动脉粥样硬化。

ATF4介导基底硬度调控破骨细胞融合的力学生物学机制

目的骨质疏松是一种以骨量减少,骨密度降低为特征的全身性疾病,常伴有细胞外基质硬度的改变。破骨细胞在疾病的发生发展过程中至关重要。与正常骨组织(硬基底)相比,骨质疏松组织(软基底)表现出破骨形成缺陷。大数据筛查表明,软基底组中转录激活因子4(ATF4)的表达减少。本研究旨在探讨ATF4在两种基底硬度下调控破骨细胞融合及其力学生物学机制。方法使用PDMS制备两种硬度的基底,提取小鼠原代BMMs细胞进行ATF4过表达处理和敲低处理后,给予M-CSF和RANKL诱导破骨细胞发生。采用细胞定时监测、TRAP染色、吖啶橙染色检测破骨细胞生成情况。通过WB、Q-PCR和免疫荧光共定位观测ATF4和破骨分化标志物的表达。采用Co-ip明确ATF4的蛋白互作。结果大数据筛查找到ATF4的变化,并在体外实验数据中证实其力学敏感性;ATF4过表达促进硬基底上成熟破骨细胞的形成,表现为融合时间早,形成数量多,破骨形成面积大,侵袭能力强,且相关破骨分化标志物表达增加。ATF4过表达能挽救软基底上破骨形成缺陷,且达到与硬基底对照组破骨形成较一致的水平。ATF4绑定FAK蛋白,调控细胞内微管微丝的重新分布,进而影响破骨细胞的融合。结论ATF4通过FAK响应细胞外基质硬度变化调节破骨细胞骨架重组以促进成熟破骨细胞形成。

层流剪切应力诱导的血管内皮细胞外囊泡通过调控巨噬细胞极化治疗动脉粥样硬化

目的心血管疾病是全球发病率和致死率最高的疾病,动脉粥样硬化是其主要形式之一。内皮细胞响应血液层流剪切应力而分泌的胞外囊泡(EVs)在维持血管稳态中起着至关重要的作用,然而这些EVs调节斑块内免疫微环境以治疗动脉粥样硬化的潜力有待深入研究。方法提取层流剪切应力诱导下HUVECs分泌的胞外囊泡(LSS-EVs),体内外实验探究LSSEVs调控巨噬细胞M2极化进而治疗动脉粥样硬化的能力。并通过mi RNA测序探究LSS-EVs调控巨噬细胞M2极化的潜在机制。采用点击化学反应,在LSS-EVs表面修饰透明质酸(HA),使其能够特异性结合斑块内的炎症巨噬细胞。结果体外数据显示,LSS-EVs及HA修饰的LSS-EVs(HA@LSS-EVs)于体内外显著上调M2表型相关标志物的表达。机制研究证实,LSS-EVs通过富集的mi R-34c-5p靶向TGF-β-SMAD3信号通路参与巨噬细胞M2极化。HA@LSS-EVs在体内表现出非凡的病灶靶向能力及更长的血液循环时间。体内长期治疗结果显示,连续注射HA@LSS-EVs显著降低主动脉脂质沉积、斑块面积及胶原含量,减缓动脉粥样硬化的病理进程。结论LSS-EVs通过内含的mi R-34c-5p靶向TGF-β-SMAD3信号通路,对动脉粥样硬化表现出优秀的巨噬细胞M2极化调控作用。HA@LSS-EVs表现出更强的病灶靶向性,并在体内显示出理想的治疗效果。

靶向TRPV1的载药超分子多肽水凝胶用于骨关节炎原位治疗

目的滑膜炎和软骨退变缺损是骨关节炎的主要病理特征。TRPV1激活可通过抑制巨噬细胞炎症和降低软骨细胞铁死亡,作为骨关节炎治疗的靶点。但其激动剂辣椒素(capsaicin,CAP)较差的水溶性和极短的半衰期严重影响了治疗效果。本研究拟开发两亲性超分子多肽载药水凝胶,利用疏水端和金属蛋白酶识别肽段实现CAP负载与缓释,并对亲水端进行GFOGER修饰促进软骨分化,实现骨关节炎的修复。方法(1)通过固相合成法制备C16A3GFOGER多肽序列;(2)通过CD和TEM评价超分子多肽水凝胶的自组装能力;(3)优化辣椒素共组比例,HPLC测定辣椒素负载及释放速率;(4)通过干细胞增殖、巨噬细胞极性转化及软骨分化等检测水凝胶的生物相容性及功能性;(5)大鼠软骨缺损修复评价水凝胶对骨关节炎的治疗效果。结果成功制备了C16A3GFOGER超分子多肽水凝胶,实现了辣椒素在超分子纤维中25%的负载率和缓慢释放,同时促进巨噬细胞促炎向抗炎表型转变以及干细胞软骨分化。体内实验显示关节腔可原位形成稳定的水凝胶,显著延长CAP在关节腔的保留时间,且软骨缺损修复。结论C16A3GFOGER超分子多肽水凝胶解决了辣椒素在临床应用中溶解度低、半衰期短以及疗效欠佳问题,显著减轻滑膜炎症并促进软骨修复,为靶向TRPV1的精准长效治疗提供具临床应用前景的方案。

流体剪切力通过上调内皮炎症诱导ICAM-1和VCAM-1的表达促进肝细胞癌转移

目的血行转移是肝细胞癌致死的主要原因。内皮炎症通过促进肿瘤细胞在血管内皮上的黏附和侵袭促进肿瘤转移,但血液流动所产生的流体剪切力对这一过程的贡献仍有待阐明。方法设计并构建血管模型,利用FLUENT软件进行数值模拟;以血管模型为实验平台观察内皮细胞炎症对Hep G2细胞黏附的影响;通过WB和QPCR和IF检测ICAM-1、VCAM-1、ITGB1、ITGB3的表达水平;通过抑制剂K7174抑制黏附相关因子ICAM-1、VCAM-1后观察血管模型中内皮炎症对肝癌Hep G2细胞黏附的影响。结果成功构建血管模型,流道尺寸为长6 cm、宽2 cm、高0.1 cm。数值模拟结果显示,此模型可以实现对生理条件下血流环境的模拟。在血管模型不同流体剪切力位置,内皮炎症均显著上调肝癌Hep G2细胞的黏附。在4~6 dyn/cm^(2)的高流体剪切力时,Hep G2细胞黏附到炎症内皮比正常情况增加4.8倍;在0~4 dyn/cm^(2)的低流体剪切力时,增加的倍数约为1.5倍。高流体剪切力促进炎症内皮细胞诱导的ICAM-1和VCAM-1的表达,从而增强了细胞间的结合力。K7174抑制ICAM-1和VCAM-1的表达可以显著降低炎症内皮细胞对Hep G2细胞的募集能力。结论流体剪切力通过上调内皮炎症诱导ICAM-1和VCAM-1的表达促进肝细胞癌转移。

KLF2在不同基底硬度上抑制破骨细胞融合中的作用及机制研究

目的骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织微结构恶化和骨折为特征的慢性疾病,是老年人发病和死亡的主要原因。骨组织的硬度可因衰老和影响矿物质成分结构的疾病如骨质疏松而改变,继而影响机械敏感性骨细胞。破骨细胞作为唯一的骨吸收细胞,在维持骨平衡中发挥着重要作用。本文拟研究KLF2在细胞外基质刚度调节破骨细胞分化和功能的力学生物学机制中发挥的作用。方法通过改变固化剂与液体低聚物碱的质量比来调节PDMS的刚度,采用1∶5和1∶45分别作为stiff和soft组。不同硬度PDMS模拟体内细胞外基质刚度的变化,正常硬度为1∶5,骨质疏松硬度则为1∶45。过表达和敲除不同硬度组BMMs中KLF2表达。通过TRAP染色、实时细胞监测和吖啶橙染色观察破骨细胞的形态、融合性以及活性。WB和IF检测破骨细胞特应性标志物和观察破骨细胞形态。结果在stiff和soft组中均观察到KLF2过表达抑制了破骨细胞的融合,同时KLF2显著抑制了破骨细胞的大小和数量。过表达KLF2抑制了破骨细胞经典标志物蛋白如Nfatc1、Ctsk、Mmp9等。同样地、在stiff和soft组中敲除KLF2的表达后发现破骨细胞融合增强。结论KLF2在stiff和soft组中均可抑制破骨细胞的融合和功能。

基质应力松弛对3D图案化类肿瘤组织形成的影响

目的3D类肿瘤组织模型对于体外肿瘤研究具有重要意义。然而现有的类肿瘤组织模型多为球状体,不能对体内肿瘤组织复杂形貌进行精准模拟。因此,本研究将通过具有应力松弛特性的3D微空腔调控特定几何形貌的类肿瘤组织形成,揭示基质应力松弛对图案化类肿瘤组织形成的影响,实现3D图案化类肿瘤组织的体外高通量、标准化制备。方法通过软刻蚀技术结合双凝胶原位拼接策略,构建具有特定几何形貌的海藻酸钠(Alg)水凝胶基微空腔;通过Alg分子量,调节应力松弛速度;进而改变细胞基质间与细胞-细胞间相互作用力,实现类肿瘤组织对微空腔形貌的精准复刻。结果成功构建了形貌、大小可控的Alg水凝胶基微空腔,实现微空腔在横向50~500μm和纵向50~80μm的精准调控;200和75 k Da的Alg实现了应力松弛时间(τ1/2)从1710 s到392 s的变化;应力松弛快的微空腔促进整合素蛋白激活,使细胞-基质作用力远大于钙黏蛋白介导的细胞-细胞作用力,大量细胞黏附至腔壁与底部,阻碍3D图案化微组织形成,反之较慢松弛特性的微空腔促进其形成。结论Alg水凝胶基微空腔的应力松弛特性会影响类肿瘤组织的几何形貌,只有分子量为200 k Da的Alg构建的应力松弛慢的微空腔可用于高通量、标准化、图案化的类肿瘤组织构建。

工程化基质囊泡促进骨质疏松性骨再生的机制研究

目的探究工程化基质囊泡促进骨质疏松病理微环境下骨再生的作用。方法通过基因工程方法构建并收集负载膜联蛋白A6(Anx A6)的工程化基质囊泡(Anx A6-MVs),通过TEM、NTA、Western blot对其进行表征。然后,在体外通过碱性磷酸酶(ALP)/茜素红染色评估Anx A6-MVs对成骨细胞的成骨/矿化作用。采用水凝胶负载Anx A6-MVs注射于骨质疏松小鼠骨缺损处观察骨再生效果。最后,通过Micro-CT、Goldner染色等方法评价Anx A6-MVs促进骨质疏松微环境下骨再生的能力。结果Anx A6-MVs呈典型的双层膜状结构,粒径约为110 nm,表达CD63、Alix和TSG101等标志物。Anx A6-MVs可显著提升成骨细胞的ALP、RUNX2、Col-1、p-FAK、FAK、Vinculin、Paxillin和β-catenin的表达。ALP/茜素红染色显示,Anx A6-MVs促进了成骨细胞的成骨/矿化作用。动物实验结果显示,Anx A6-MVs显著提高OVX小鼠再生骨组织的BMD指数和骨体积分数。Masson染色和激光散斑成像结果显示,Anx A6-MVs能提高再生骨组织的血管生成。Goldner染色显示,Anx A6-MVs能提高局部新生骨量。结论Anx A6-MVs促进了成骨细胞的黏附、归巢、成骨分化趋势和增殖,增加再生骨组织的血管化,促进骨质疏松情况下的骨再生。

靶向TFRC的仿生纳米粒用于易损斑块的诊疗一体化评价

目的易损斑块是引起急性冠脉综合症的重要病理基础,它的破裂是导致患者死亡的重要原因。目前,缺乏可用于易损斑块精准识别和治疗的有效手段。本研究拟构建靶向TFRC的仿生纳米粒用于精准识别易损斑块并维持斑块稳定。方法通过单细胞测序分析易损斑块中泡沫细胞高表达的表面受体并通过临床和动物样本验证其表达。合成CTSK响应含有抗炎药物阿司匹林的前药载体PLGA-PEP-ASA并通过FTIR、HNMR表征结构。采用纳米沉淀法制备含有近红外荧光分子IF780和肝受体激动剂的纳米载体。通过共挤出方式构建红细胞膜包被的仿生纳米粒并通过点击化学方式修饰TFRC靶向的AbM@LXR-NP。通过TEM、NTA和WB表征纳米载体的形貌、粒径和表面标志物。通过光声成像评价Ab-M@LXR-NP对易损斑块的靶向能力,通过大体油红染色、免疫组化评价Ab-M@LXR-NP的治疗效果。结果临床和动物标本染色证实易损斑块部位的泡沫细胞高表达FTRC受体;FTIR、HNMR结果证实成功合成PLGA-PEP-ASA;TEM结果显示纳米粒呈均匀的球形,粒径约为124 nm,表面携带红细胞标志物。光声成像结果证实Ab-M@LXR-NP可靶向到易损斑块部位。体内治疗结果显示,Ab-M@LXR-NP可减少斑块坏死核心面积。增加斑块胶原含量,斑块稳定性增加。结论Ab-M@LXR-NP可精准识别易损斑块并增加斑块稳定性。

绿茶多酚EGCG通过调控转录因子JunB抑制血管钙化

目的血管钙化是钙磷等羟基磷灰石晶体在血管壁的异常沉积,增加了心血管疾病的发病率和死亡率。目前,针对血管钙化还缺乏有效的治疗方法。绿茶多酚,表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对心血管系统有积极的保护作用,但补充EGCG是否会抑制血管钙化还鲜有报道。本文探究了EGCG对血管钙化的影响,并阐明其潜在机制。方法使用慢性肾病相关的慢性和维生素D3(Vit D3)诱导的急性小鼠血管钙化模型、高磷高钙诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)和离体小鼠主动脉环钙化模型,在体内和体外水平探究EGCG对血管钙化的抑制作用。结果在体内水平EGCG显著抑制血管钙化小鼠主动脉的钙盐沉积,抑制主动脉VSMCs成骨分化。在体外,EGCG也具有抑制VSMCs和主动脉环钙化的作用。通过RNA-Seq分析及随后钙化小鼠主动脉和成骨样VSMCs样本的分析,发现转录因子Jun B是促进血管钙化的关键分子,EGCG通过失活Jun B发挥抑制血管钙化的作用。过表达Jun B能够逆转EGCG对钙化的抑制作用,而敲降Jun B显著增加EGCG的作用。此外,补充EGCG后MAPK信号通路显著失活,而且MAPK通路的抑制剂显著失活Jun B。此外,MAPK通路的抑制剂减少了过表达Jun B的VSMCs钙化。结论EGCG在体内和体外具有抑制血管钙化的作用,且依赖于MAPK-Jun B信号通路。