基于引物快速固化技术的实时荧光聚合酶链式反应检测方法

目的开发一种快速、低成本的引物干燥与固定新技术,以实现载脂蛋白E基因亚型的实时荧光聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)检测方法。方法研究不同粘附着色剂性能、实现引物快速干燥固化,建立一种固化引物模式的实时荧光PCR方法对6种载脂蛋白E基因亚型进行检测,并对新方法的常温储存性能、检测特异性、灵敏度和准确度及与基因测序法的结果一致性实施试验评价。结果固化引物技术仅需高温干燥,固化后的引物可常温储运,稳定性高,不影响PCR扩增。建立的固化引物模式的实时荧光PCR方法检测载脂蛋白E基因准确性高、特异度好,灵敏度为0.63 ng/μL,与传统的液体PCR试剂灵敏度一致。临床样本验证结果表明,本方法与基因测序的符合率为100%。结论本文建立的固化引物实时荧光PCR法可提高多突变位点基因检测操作的便捷性与检测通量选择的灵活性。

实时荧光环介导等温扩增快速分型致泻大肠埃希氏菌方法的建立

致泻大肠埃希氏菌(diarrheagenic Escherichia coli,DEC)是一种重要的食源性致病菌,该研究立足DEC目前流行率高、基层分型困难的现状,建立了快速分型5种DEC的实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。针对DEC的8段特征性毒力基因pic、aggR、lt、st、stx 1、stx2、escV、invE及大肠埃希氏菌属特异性基因uidA设计LAMP引物,优化反应体系,并对方法的分析性能及临床菌株分型效果进行了评价。结果显示,所建立的方法对pic和escV的检出限是1 ng/μL,对aggR、stx 1、invE和uidA的检出限是100 pg/μL,对lt、st和stx 2的检出限是10 pg/μL,该方法灵敏度与特异度均为100%,DEC型别间无交叉反应,对临床菌株的分型与实际结果完全一致。方法快速简便、设备要求低,借助恒温荧光读取设备可在40 min内迅速判定待检菌株是否为DEC及其致病类型,可满足各机构现场快速检测的需求。

莱克多巴胺荧光微球免疫层析检测方法的建立

以荧光微球作为新型标记物,采用EDC法进行偶联,制备莱克多巴胺抗体荧光微球复合物,复合物粒度均一、性质稳定,并以之为探针建立莱克多巴胺荧光微球免疫层析检测方法,检测限为2.5ng/mL,且特异性强、检测范围宽。与胶体金免疫层析方法相比,荧光微球免疫层析方法的灵敏度更高,新型的荧光微球可以提高免疫层析方法的灵敏度。

新型层析快速检测技术及其在食品安全中的应用

分别介绍量子点、荧光微球、上转磷光、纳米磁珠为代表的新型标记物免疫层析,非免疫学层析,替代抗原层析等新型层析快速检测技术,综述其原理、优势及其在食品安全相关领域的应用现状,并对今后层析检测方法的发展趋势进行展望。

脱细胞真皮基质胶原网架转归的研究进展

脱细胞真皮基质是最近几年兴起来的一种天然生物材料,已有在神经外科、耳鼻咽喉、烧伤整形、牙周病学等学科领域的研究报道。笔者着重就其结构与特性、异体移植后的生物学转归及其机制的研究进展作一综述,为临床应用提供理论依据。

苦味酸-天狼星红染色观测脱细胞真皮基质胶原亚型的变化

目的:研究脱细胞真皮基质异体移植后不同时期胶原亚型的变化。方法:移植脱细胞真皮基质于大鼠背部皮肌下,分别于术后1、2、3、4、8、16、24周切取标本,切片常规HE染色,并行苦味酸-天狼星红染色分析Ⅰ/Ⅲ型胶原比例。结果:HE染色,2周,成纤维细胞(FB)增多,新生胶原增加;4周,见不到典型的FB;8周,胶原纤维排列平行。苦味酸-天狼星红染色,偏振光显微镜下见脱细胞真皮基质胶原支架具有明显的层次感。0点、1、2、3、4、8、16、24周Ⅰ/Ⅲ型胶原比例分别为2.88±0.15、2.81±0.27、2.22±0.28、1.96±0.17、1.85±0.23、2.02±0.22、2.43±0.27、2.73±0.25(F=16.84)。2、3、4和8周数值与0点相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:苦味酸-天狼星红染色可观测脱细胞真皮基质胶原亚型动态变化;脱细胞真皮基质胶原亚型不同时期呈现规律性升降。

简化显微外科技术在面部皮肤小肿物处理中的应用

目的探讨简化显微外科技术在面部皮肤小肿物处理中的应用价值。方法将72例面部皮肤小肿物患者随机分为观察组37例和对照组35例,分别采用简化显微外科技术和常规方式切除缝合;术后第3天起观察切口愈合情况,术后第6、12个月采用温哥华瘢痕量表(VSS)评价瘢痕情况,观察肿物复发情况,评价患者满意度。结果观察组切口甲级愈合率100%,高于对照组的62.86%(P<0.05);观察组切口愈合时间为(5±0.6)d,短于对照组的(8±0.2)d(P<0.05)。观察组术后12个月VSS评分低于术后第6个月,且均低于同时点对照组VSS评分(P均<0.05)。观察组随访12个月均无复发,对照组有3例复发(P<0.05)。观察组患者满意度为100%,高于对照组的74.29%(P<0.05)。结论简化显微外科技术用于处理面部皮肤小肿物疗效好,患者满意度高。

用顺序GISH-FISH技术鉴定小麦-中间偃麦草小片段易位系

利用顺序基因组－重复序列荧光原位杂交技术对１个来自中３不育系和普通小麦恢７５杂种后代稳定株系Ｈ９６２７６－２的染色体组成进行了分析。以中间偃麦草（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）基因组ＤＮＡ为探针的荧光原位杂交结果表明，Ｈ９６２７６－２的体细胞中有４２条染色体，包括２０对小麦染色体和１对小麦－中间偃麦草易位染色体，中间偃麦草染色体的易位片段位于１对小麦染色体的端部。进而用重复序列探针 ｐＳｃ１１９进行第 ２次荧光原位杂交，证明 Ｈ９６２７６－２中的中间偃麦草染色体易位片段位于小麦２Ｂ染色体的短臂上。

集成免疫磁珠富集和免疫层析的黄曲霉毒素M_1快速检测法

以喷涂了检测抗原黄曲霉毒素M1-BSA和驴抗鼠二抗形成检测线和质控线的硝酸纤维膜制备免疫层析试纸条,采用EDC/NHS法制备偶联了抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的免疫磁珠。免疫磁珠与待检样本混合,经捕获、磁分离后,浓缩重悬液直接用免疫层析试纸条检测,首次建立了集浓缩样本与免疫层析于一体的黄曲霉毒素M1快速检测法。该方法用于检测原料乳中黄曲霉毒素M1,检出限为0.1μg/L,低于我国制定的黄曲霉毒素M1限量标准(0.5μg/L),与其它真菌毒素和原料乳中常检违法添加物无交叉反应,分析结果与酶联免疫吸附法(ELISA)结果一致。本方法适合现场快速检测原料乳中黄曲霉毒素M1。

双抗夹心酶联免疫吸附法检测沙门氏菌

沙门氏菌是自然界中普遍存在的一种食源性致病菌,在中国的食物中毒中沙门氏菌引起的病例占第一位。本研究以福尔马林灭活的鼠伤寒沙门氏菌免疫雌性日本大耳兔,制备抗沙门氏菌多克隆抗体。以抗沙门氏菌多克隆抗体作为捕获抗体,以抗沙门氏菌单克隆抗体C1359作为检测抗体,建立快速检测沙门氏菌双抗夹心ELISA方法。结果表明:该方法可以检测A、B、C、D、E等五种典型的沙门氏菌,对沙门氏菌纯培养液的最低检测量为1×104CFU/mL,与其他杂菌不存在交叉反应,具有较好的灵敏性和特异性。

免疫磁珠法富集沙门氏菌的优化及应用

采用活泼酯法将磁珠和抗体偶联,制备沙门氏菌免疫磁珠,系统地优化了偶联条件和免疫磁珠捕获工艺。结果表明,最佳偶联条件:每毫克磁珠抗体偶联量为50μg,免疫磁珠的添加量为0.4mg,菌液浓度为102～106CFU/mL时,捕获效率为65%～82%;免疫磁珠捕获工艺:目的菌最佳孵育时间为45min,最佳磁分离时间为3min,磁场强度为0.8T,磁珠粒径为180nm;对鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、鸭沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的捕获效率分别为61.4%、45.8%、48.2%、78.5%、64.1%,对鸡蛋清、蛋黄、牛奶和纯培养基中沙门氏菌捕获效率分别为44.3%、43.2%、65.2%和72.5%。免疫磁分离富集技术具有分离速度快、操作简单、捕获效率高、可重复性好等特点,可在食品样品预处理中广泛应用。

基于免疫磁分离的荧光微球免疫层析法检测猪霍乱沙门氏菌

建立了基于免疫磁分离的荧光微球免疫层析法,检测猪霍乱沙门氏菌。待检样品经免疫磁分离富集和热洗脱处理后,用荧光微球免疫层析试纸条进行检测。每毫克纳米磁珠标记30μg抗体制备的免疫磁珠,对浓度为10~2~10~6CFU/mL的猪霍乱沙门氏菌的捕获率均大于90%,特异性好;在pH=6时,以300μg/mg猪霍乱沙门氏菌单抗11D8-D4标记荧光微球,制备免疫荧光微球;以2.0 mg/mL猪霍乱沙门氏菌单抗5F11-B11喷涂检测线(T线),以1.0 mg/mL驴抗鼠IgG喷涂质控线(C线),制备免疫层析试纸条。采用建立的基于免疫磁分离的荧光微球免疫层析方法检测猪霍乱沙门氏菌,在PBS缓冲液中检出限为1.5×10~5CFU/mL,牛奶中检出限为7.6×10~5CFU/mL,与直接采用荧光微球免疫层析方法检测相比,检出限分别降低了10倍和200倍。本方法可有效富集牛奶中的沙门氏菌,避免了基质干扰,灵敏度大大提高,具有较好的应用前景。

ITI Straumann种植体修复牙列缺损疗效观察

目的观察ITI Straumann种植体修复牙列缺损的疗效。方法采用ITI Straumann种植系统治疗牙列缺损患者80例,共植入136枚ITI Straumann种植体。比较种植体周围参数和牙槽嵴高度参数变化,采用生命图表分析法计算种植体累积存留率和累积成功率。结果129牙未见明显骨丧失。上部修复体均未见明显折裂、崩瓷、松脱。患者对舒适度及咀嚼效率评价良好。愈合期种植成功率为100%,5 a累积存留率97.06%,累积成功率94.85%。结论ITI Straumann种植系统治疗牙列缺损效果满意。

胶体金免疫层析法检测酱油中黄曲霉毒素B_1

采用胶体金免疫层析法检测酱油中的黄曲霉毒素B1。加标的酱油样品经提取后,以胶体金免疫层析法对其进行黄曲霉毒素B1测定,并与酶联免疫吸附法进行比较。结果表明,当酱油中黄曲霉毒素含量超过国家限量标准(5μg/kg),胶体金免疫层析法检测结果为阳性,说明该方法能够满足酱油样品中黄曲霉毒素B1监控的要求。

以Triton X-100和脱氧胆酸钠为萃取剂制备兔脱细胞神经基质:有最佳时间吗?

背景：与其他脱细胞神经基质制备方法相比，化学萃取的去细胞同种异系（体）神经组织内细胞成分可以较完全地清除，进一步减少了发生免疫排斥反应的可能性，并能较好地保留神经支架的完整性，但制备过程中的相关问题有许多尚需讨论。目的：应用Triton X-100和脱氧胆酸钠化学萃取剂处理新西兰大白兔的面神经，提出脱细胞神经基质制备的所需试剂及最佳时间。设计、时间及地点：随机分组，对比观察细胞学实验，于2009-02/06在滨州医学院附属医院口腔科学实验室完成。材料：3月龄新西兰大白兔15 只，体质量2.5~3.0 kg。Triton X-100、脱氧胆酸钠由美国Sigma 公司提供。方法：取兔双侧面神经，在手术显微镜下去除神经表面的脂肪组织和神经外膜，将其分为每段10 mm长，共66条。将66条神经随机分成11 组，每组6条。除正常对照组外，其余10 组均放入培养皿中，先用蒸馏水室温下浸浴12 h ，以使细胞和髓鞘在低渗液体中膨胀，使部分细胞被胀破;然后将其中5组置于3% Triton X-100 12，24，36，48，60 h，室温下振荡，另外5组用3%Triton X-100和4%脱氧胆酸钠先后作用12 h（为1个周期），室温下反复振荡1~5个周期。主要观察指标：常规苏木精-伊红染色，光镜下观察去细胞程度及纤维管道结构的完整性。结果：单独应用Triton X-100处理神经即使作用60 h，仍不能将神经中的所有细胞成分去除，且许旺细胞基底膜有较大破坏；Triton X-100配合脱氧胆酸钠处理处理2个周期，可有效地去除神经中的细胞成分及神经纤维髓鞘和轴突，保留完整的许旺细胞基底膜，周边可见神经外膜和束膜。结论：大白兔面神经经 Triton X-100和脱氧胆酸钠室温处理2个周期，并不停地振荡，可完全去除神经组织中的所有细胞成分，保留完整的许旺细胞基底膜，得到脱细胞的神经基质。

上转换免疫层析方法检测牛奶中大肠杆菌O157H7

免疫层析方法是最常见的快速检测方法之一,然而灵敏度低和基质耐受能力差限制了其在食源性致病菌检测中的应用。在本研究中,我们制备了上转换纳米材料(Upconversion Nanoparticles,UCNPs),并将其应用于免疫层析平台。由于UCNPs的反斯托克激发特性,所建立的方法能有效解决灵敏度差及机制耐受能力差的问题。通过系统性优化,所建立的免疫层析方法可在4.6×104 CFU·mL^-1~1×107 CFU·mL^-1浓度范围内实现定量检测,检测限为2.8×104 CFU·mL^-1。该方法在实际牛奶样本检测中表现出优良的抗基质干扰能力,其批内回收率为82.7%~105.4%,变异系数为5.8%~13.3%;批间回收率为79.4%~102.5%,变异系数为6.7%~7.5%。方法灵敏度较高,抗基质干扰能力强,不仅能用于大肠杆菌O157:H7的检测,也可被推广应用于其它食源性致病菌检测。

超冷光美白技术治疗变色牙49例临床观察

目的观察超冷光美白技术治疗变色牙的临床效果。方法将98例变色牙患者随机分为实验组和对照组,各49例。实验组采用超冷光美白技术美白变色牙,对照组采用夜间漂白技术美白变色牙。结果实验组治疗有效率、患者满意度和半年有效率明显高于对照组(P<0.05)。结论超冷光美白技术治疗变色牙疗效优于夜间漂白技术。

2015-2017年江西省市售食品中产单核细胞李斯特菌污染情况调查及分子分型研究

目的了解2015-2017年江西省市售食品中产单核细胞李斯特菌的污染及分子分型情况。方法采集全省选定的24个市县的超市、百货商场等市场流通环节销售的12类食品(包括肉类、豆制品、速冻米面制品等)样品,采用国家食品污染和有害因素风险监测工作手册方法检测和鉴定产单核细胞李斯特菌。对三年来收集的阳性菌株采用脉冲场凝胶电泳方法(PFGE)进行分子分型。结果三年共采集4816份样品,产单核细胞李斯特菌总检出率为1.43%,2015年污染率较高为2.21%。12类食品中肉与肉制品的检出率较高,2015年为3.58%,2016年为1.57%,2017年2.12%。不同地区采集的样品阳性检出率比较差异有统计学意义(χ2=45.44,P=0.004),各大类食品间的检出率比较差异有统计学意义(χ2=33.98,P<0.001),而不同流通环节抽取的样品比较差异无统计学意义(χ2=7.84,P=0.55)。部分菌株PFGE结果显示型别较多,仅有三株菌PFGE型别为100%一致。结论江西省市售食品中产单核细胞李斯特菌的污染情况稳中向好,但仍有一定的安全隐患,相关监管部门应加强重视,预防食源性疾病的发生。