牦牛源短小芽胞杆菌TS1的分离鉴定及其生物学特性研究

[目的]本试验旨在研究一株牦牛源短小芽孢杆菌(命名:TS1)的分离鉴定、抗逆性、对常用抗菌药物的耐药性以及对常见致病菌的抑菌活性,初步探索其作为益生菌添加剂在畜牧养殖中应用的可行性。[方法]对健康牦牛新鲜粪便进行100℃水浴处理10 min以筛选具有抗逆性的芽胞杆菌,进行形态学、生理生化特征及16S rRNA序列分析鉴定,通过测量生长曲线、耐酸、耐胆盐试验、药敏试验及抑菌试验等方法对其生物学特性进行研究,通过全基因测序分析其可能产生抗菌物质的类型。[结果]TS1为短小芽胞杆菌且具有耐酸、耐胆盐生长特性;TS1对于12种常见的抗菌药物敏感,且对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌具有抑菌作用。测序分析显示该菌株可编码与Amylocyclicin同源性达48.90%的一种新型抗菌肽,进而发挥其抗菌活性。[结论]短小芽胞杆菌TS1有一定的抗逆性和潜在的益生能力及广谱抗菌效果,并且在畜禽肠道微生物系统中对抗生素耐药性传递的风险较低,适合作为益生菌添加剂类抗生素替代产品。

喜滴克对肝癌相关基因及AFP表达的调节

[目的]观察细胞分化剂喜滴克对肝癌相关基因及血清AFP水平的调节。[方法]人移植性高转移肝癌裸鼠模型LCI D20,随机分为对照组(C组) ,喜滴克低剂量组(L组) ,喜滴克中剂量组(M组) ,喜滴克高剂量组(H组)和喜滴克高剂量 +5 Fu组(H +CT组)。接种后第11天给药 ,连续20天 ,计算抑瘤率 ,测定血清AFP水平和观察腹腔转移。应用RT PCR方法 ,研究基因的表达。应用Western印迹检测整合素β1和E 钙粘素的表达 ,观测高转移人肝癌细胞株MHCC97对纤维连接蛋白的粘附抑制作用。[结果]不同剂量组的喜滴克均呈现一定的抑瘤作用。喜滴克治疗组血清AFP水平比对照组有明显下降 ;对原癌基因c myc、N ras、c jun、c fos及mmp 9基因的表达有明显的下调作用(P<0.01)。喜滴克亦能下调整合素β1蛋白表达和增加E 钙粘素的表达 ;有抑制高转移人肝癌细胞株MHCC97对纤维连接蛋白粘附的能力。[结论]喜滴克对肝癌相关基因及AFP表达的调节可能是其抑制肿瘤生长和转移的分子基础。

黄曲霉毒素的酶联免疫测定法及其在肝癌流行病学研究中的应用评价

作者对黄曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)B_1和M_1(AFB_1和AFM_1)的酶联免疫测定法(ELISA),AFB_1摄入量和尿中AFM_1排出量与原发性肝癌死亡率间的关系;AFB_1-辣根过氧化物酶(AFB_1-HRP)的合成及其应用于AFB_1和AFM_1的ELISA检测进行了研究。指出ELISA对样品中AFM_1、AFB_1测定最佳范围分别为0.5～10、0.5～21ng/ml。 与薄层层析法(TLC)相比,ELISA有检出率高、重复性好及专一的特点。用C_(18) Seppak处理样品不仅有效且简便快速。用ELISA检查了220份食品和230份尿液样本,证明了AFT的摄入和排泄间有很好的正相关。提示在流行病调查中,尿中AFM_1可作为人群AFB_1摄入的指标。

原发性肝癌病人血清的中性糖脂肿瘤标记—去唾液酸GM_2

从微量血清中分离纯化的中性糖脂(N-GSL),应用薄层扫描定量法测定的结果表明:原发性肝癌(PHC)病人血清的N-GSL总量(以CMH相应量表示)为44nmol/ml血清,为正常人血清含量的1.51倍。高效薄层层析(HPTLC)分析表明,PHC血清的N-GSL图谱与正常人血清图谱相似,主要成分为CMH、CDH、CTH、Glob和PG。不同的是,PHC血清HPTLC图谱中在CTH和Glob之间出现了一条新的条带,层析证实为去唾液酸的GM_2(As-GM_2),其含量为0.71±0.13nmol/ml血清。As-GM_2在PHC血清中的出现可能提示其为肝癌相关的血清糖脂标记。

Ezrin在肝癌中的表达及其与肿瘤黏附、侵袭和门静脉癌栓的关系

目的 探讨细胞骨架连接蛋白 (ezrin)在肝癌组织和细胞系中的表达及其与肿瘤黏附、侵袭和门静脉癌栓的关系。方法 4 1例肝细胞肝癌及其癌旁肝组织标本按肿瘤大小、有无播散灶及远处转移、包膜、门静脉癌栓等分为高侵袭和低侵袭 2组并与同期 9例良性肝病肝组织作比较 ,分别采用RT PCR和免疫组化技术检测ezrin表达。另选MHCC97L、MHCC97H和LM 33株肝癌细胞系并检测ezrin表达 ;同时运用脂质体转染反义寡核苷酸抑制MHCC97H细胞ezrin表达 ,比较转染前后细胞黏附、侵袭能力的改变。结果 高侵袭肝癌ezrin表达显著高于低侵袭肝癌 (P <0 .0 5 ) ,癌栓组织ezrin表达强度更高 (P <0 .0 5 )。MHCC97L、MHCC97H和LM33株细胞系均表达ezrin ,其强度随侵袭性增加依次增强。脂质体转染反义寡核苷酸能显著抑制MHCC97H的ezrin表达以及黏附、侵袭能力。结论 Ezrin在肝癌、门静脉癌栓和MHCC97L、MHCC97H、LM3细胞系中均表达 ,其表达强度随侵袭性增强而增加 ;Ezrin可能主要通过影响肿瘤黏附、侵袭能力 ,从而在肿瘤侵袭及门静脉癌栓形成中起重要作用。

肝细胞癌病人血浆循环DNA定量分析及其临床意义

目的 定量检测肝细胞癌 (HCC)病人血浆循环DNA并探讨其临床价值。方法 收集 79例肝功能正常的HCC病人术前血浆样本以及 2 0例健康志愿者、2 0例代偿期肝硬化病人和 2 0例活动性乙型肝炎病人的血浆样本 ,抽提血浆循环DNA。将血浆循环DNA与荧光染料SYBRgreenⅠ按比例稀释并充分混匀后通过紫外与可见光成像分析系统定量。结果 HCC、肝硬化和肝炎病人血浆循环DNA浓度分别为 (47.1± 4 3.7)ng/mL、(30 .0± 1 3.3)ng/mL和 (6 5 .3± 71 .6 )ng/mL ,均明显高于健康人群血浆循环DNA浓度 (1 7.6± 9.5 )ng/mL ,差异在统计学上有显著性 (P =0 .0 0 0 ;P =0 .0 0 2 ;P =0 .0 0 1 ) ,而HCC和肝硬化病人以及病毒性肝炎病人两组之间的血浆循环DNA浓度无明显差异 (P =0 .1 91 ;P =0 .6 85 )。伴肝内播散灶或脉管癌栓的 4 1例HCC病人的血浆循环DNA浓度 (5 4 .3± 4 1 .6 )ng/mL明显高于不伴肝内播散灶或脉管癌栓的 38例病人 (39.3± 4 5 .0 )ng/mL(P=0 .0 0 2 )。血浆循环DNA浓度与HCC病人肿瘤大小、TNM分期、2年无瘤生存率、1年和 2年总体生存率密切相关 (P =0 .0 0 8;P =0 .0 4 0 ;P =0 .0 1 0 ;P =0 .0 1 6 ;P =0 .0 0 1 ) ,而与肿瘤数目、肿瘤包膜、肿瘤分化、血清AFP浓度及 1年无瘤生存率无明显关系。多因素分?

丹参对肝癌转移复发防治作用的研究

目的：观察丹参对ＳＭＭＣ－７７２１肝癌细胞株（７７２１细胞）侵袭粘附能力和对裸鼠人肝癌切除术后转移复发的影响。方法：以流式细胞仪测量丹参对７７２１细胞表面细胞间粘附分子１（ＩＣＡＭ１）的表达的影响。以细胞侵袭实验观察丹参对ＳＭＭＣ７７２１细胞侵袭运动能力及对已与纤维连接蛋白（ＦＮ）粘附的７７２１细胞脱落的影响。以ＭＴＴ法测量丹参对７７２１细胞与ＦＮ粘附的影响。以细胞粘附实验观察丹参对７７２１－７７２１细胞，７７２１－内皮细胞，７７２１－淋巴细胞之间粘附的影响。以ＬＣＩＤ２０裸鼠人肝癌转移模型为材料，观察丹参对早期和晚期肝癌切除术后转移复发的影响。结果：丹参处理的７７２１细胞ＩＣＡＭ１表达明显低于对照组，丹参可抑制７７２１细胞的侵袭能力，促进已粘附细胞的脱落，可抑制７７２１与７７２１细胞、淋巴细胞、内皮细胞的粘附，并对早期和晚期裸鼠人肝癌切除术后的肝内和远处转移复发有防治作用。结论：丹参可抑制ＳＭＭＣ－７７２１细胞的侵袭粘附能力，防治裸鼠人肝癌切除术后的转移复发。

米非司酮对人蜕膜与绒毛糖脂及雌孕激素受体的影响

本文从糖脂与激素受体等方面观察了米非司酮抗早孕的作用机理。采用Ｌａｄｉｓｃｈ微量分部、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５柱层析及高效薄层定量分析（ＨＰＴＬＣ），发现米非司酮引起蜕膜与绒毛糖酯含量及组分的变化；应用ＤＣＣ法测定蜕膜组织中雌、孕激素受体（ＥＲ、ＰＲ）。结果表明米非司酮使蜕膜组织中ＥＲ上升，ＰＲ下降，干扰了ＥＲ与ＰＲ之间的平衡。以上研究提示来非司酮抗早孕作用是多环节的，蜕膜是其重要的作用部位。

炔诺酮对人子宫蜕膜神经节苷脂组分的影响

应用Ladish分部及微量分析法,对正常早孕期和服用炔诺酮(15mg/天,连用5天)早孕期妇女的子宫蜕膜神经节苷脂(Gg)进行定性和定量分析与比较。结果表明服药组的 Gg 总量(以脂结合唾液酸 LBSA 表示)为71.6±4.5μg/g 蜕膜,为正常对照组的1.35倍(P<0.05)。高效薄层层析(HPTLC)分析其图谱与对照组相同,主要成分为 GM_3、GM_2、GM_1、GD_3、GD_(1a)和 GT_(1a),但含量上有变化。GD_3含量为15.3±1.5μg/g 蜕膜。为正常时的1.91倍(P<0.025),GM_3和 GD_(1a)相对含量降低。服药组的 Gg 的 HPTLC 图谱中尚发现 Rf 值为0.035的条带,其含量为5.8±1.5μg/g 蜕膜,为对照组的4.15倍(P<0.05),其层析行为提示该条带可能为四糖基的神经节苷脂。炔诺酮作用下的蜕膜 Gg 的变化与其抗早孕作用有关。

双向电泳-质谱技术筛选肝癌血清标记物

采用双向电泳-质谱技术筛选肝癌特异的血清蛋白标记物,以利于肝癌的早期诊断和治疗.肝癌、肝炎和正常三组各20例血清先采用超声、高丰度蛋白去除、脱盐预处理以优化双向电泳,图像分析三组血清图谱寻找差异点,基质辅助激光解吸飞行时间质谱对差异点进行鉴定.结果显示,通过样品预处理,血清上样体积平均增加3～4倍,参考胶点数由218个增至332个,白蛋白和免疫球蛋白明显减弱,水平条带明显减少.图谱比较所得37个差异点,经鉴定为7种蛋白.与正常组比较,转铁蛋白、甲状腺素运载蛋白在肝炎和肝癌组低表达,α-1抗胰蛋白酶、凝聚素、铜蓝蛋白、触珠蛋白在肝炎和肝癌组均高表达.α-1抗胰蛋白酶在肝癌组较肝炎组高表达,而热休克蛋白27只在肝癌组表达.上述结果提示,双向电泳-质谱技术可发现肝癌发生发展过程中血清蛋白表达谱质或量的变化,从而为肝癌的早期诊断及治疗奠定基础.

热休克蛋白27在转移潜能不同人肝癌细胞系中的表达及机制研究

利用不同转移潜能肝癌细胞系探讨热休克蛋白27(HSP27)参与肝癌细胞转移潜能形成的可能分子机制.细胞免疫荧光技术、RT-PCR和免疫印迹技术显示,HSP27在转移潜能不同的肝癌细胞Hep3B、MHCC97L和MHCC97H中定位于细胞浆,亦可见于细胞核,HSP27 mRNA和蛋白质的表达水平与肝癌细胞转移潜能呈正相关.高转移潜能肝癌细胞系MHCC97H的HSP27 RNA干扰试验结果显示,HSP27 RNA干扰后MHCC97H的侵袭(MHCC97H组:21.36±2.92;对照RNAi组:19.88±2.23;RNAi组:11.40±2.05)、运动能力(MHCC97H组:26.35±3.29;对照RNAi组:24.43±3.17;RNAi组:10.92±2.27)明显减弱,细胞凋亡显著增加(MHCC97H组:15.12%;对照RNAi组:17.56%;RNAi组:27.64%).同时进行信号转导基因芯片检测发现,HSP27干扰后核因子κB(NF-κB)通路抑制,并且免疫印迹显示细胞核内活化的NF-κBp65减少,细胞内磷酸化IκBα降低.另外,免疫共沉淀检测发现,在肝癌细胞内HSP27可与IKKβ、IκBα共沉淀,且在HSP27RNA干扰后IKKβ与IKKα结合能力下降.这些结果提示,HSP27可能通过参与细胞内NF-κB通路的激活,影响细胞凋亡和细胞运动,在肝癌细胞侵袭转移过程中发挥作用.

Galectin-3表达抑制对子宫内膜上皮细胞生长周期和黏附性的影响

目的 探讨半乳凝素-3（Galectin-3）在人类子宫内膜容受性形成中的作用.方法 采用人子宫内膜上皮细胞株RL95-2进行体外培养,应用RNA干扰技术（siRNA）抑制Galectin-3表达,RT-PCR法和western blot测定Galectin-3 mRNA和蛋白表达水平.体外观察细胞黏附率的变化,并用流式细胞术观察Galectin-3表达抑制对细胞生长和整联蛋白β1表达的影响.结果 Galectin-3 siRNA转染效率达到70%～90%.siRNA转染后Galectin-3 mRNA和蛋白表达水平可下调70%～90%.Galectin-3表达抑制后RL95-2细胞G1期上升,S期下降;整联蛋白β1表达降低;对细胞外纤维黏连蛋白（Fibronectin,FN）黏附性显著降低.结论 Galectin-3可以影响子宫内膜上皮细胞的增殖、黏附,对黏附性的影响可能与调节整联蛋白的表达有关.Galectin-3可能通过调节细胞增殖、黏附等过程参与子宫内膜容受性的形成.

肝细胞生长因子(HGF)诱导肝癌Huh7细胞发生上皮间质转化(EMT)后细胞膜表面糖蛋白糖谱的变化

目的应用凝集素芯片技术寻找肝癌细胞表面转移相关的特征性糖谱。方法应用肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)诱导建立肝癌上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)细胞模型。通过凝集素芯片比较诱导前后细胞膜的糖谱改变,采用凝集素印迹和荧光细胞凝集素免疫组化方法验证芯片结果。结果诱导后细胞对凝集素ACL、BPL、JAC、MPL、PHA-E、SBA和SNA的亲和作用减弱,而对凝集素AAL、ConA、DBA、GSLⅡ、ECL、HAL、LCA、LTL、NML、NPL、PHA-L、PTLⅡ和WFL的亲和作用增强。提示诱导后肝癌细胞表面出现了黏蛋白T/Tn抗原、平分型N-乙酰葡萄糖胺、α2,6唾液酸和末端α或β连接的N-乙酰半乳糖胺结构减少;而末端和核心岩藻糖、高甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺β1,6分支和复杂型寡糖分支结构增多。结论肝癌细胞发生EMT过程中细胞膜表面糖链结构改变,提示糖链结构与肝癌的转移密切相关,为有效控制肝癌转移、改善预后提供了新思路。

小鼠容受性子宫内膜上皮细胞和基质细胞的共培养

建立一种较理想的体外子宫内膜立体共培养方法。方法:利用双室培养系统建立含有上皮细胞和基质细胞共培养的系统,光镜、电镜观察上皮细胞形态学变化;细胞免疫组化鉴定细胞来源。结果:扫描电镜显示,培养的上皮细胞生长汇合,可见到微绒毛细胞及局部有胞饮突的形成。透射电镜观察显示培养的上皮具有极性,表面有微绒毛,细胞间紧密连接及细胞间糖原沉积。结论:此方法可更好地模拟体内状态,是较理想的子宫内膜体外模型。

外源性LIF和IL-1对围着床期小鼠子宫内膜整合素β_3亚基表达的调节

Objective:To study regulation of external leukemia inhibitory factor(LIF) and interlukin 1(IL 1) on the expression of integrin β 3 in the mouse endometrium during peri implantation period and explore the mechanism which LIF participate in embryonic implantation.Methods:The mice were injected peritoneally with LIF,IL 1 or IL 1ra at different administration on day 2～4 of pregnancy.The level of integrin β 3 protein was measured with Westernblot method and mRNA measured with RT PCR.Results:The levels of integrin β 3 protein and mRNA were increased by LIF and IL 1(P<0.05) and which relied on administration.The level of integrin β 3 mRNA was decreased by IL 1ra (P<0.05).Conclusion:LIF and IL 1 of cytokines can improve the expression of integrin β 3 in the peri implantation endometrium of mouse.Both of them may take part in implantation by regulating cell adhesion molecules.

蛇毒防治肝癌转移复发作用的实验研究

目的：观察蛇毒对SMMC－7721肝癌细胞株(7721细胞)侵袭粘附能力和对裸鼠人肝癌切除术后转移复发的影响。方法：以流式细胞仪检测蛇毒对7721细胞表面细胞间粘附分子－1(ICAM－1)的表达的影响；以细胞侵袭实验观察蛇毒对SMMC－7721细胞侵袭运动能力及对已与FN(fibronectin)粘附的7721细胞脱落的影响。以MTT法测量蛇毒对7721细胞与FN粘附的影响；以细胞粘附实验观察蛇毒对7721－7721细胞，7721－内皮细胞，7721－淋巴细胞之间粘附的影响；以LCI－D20裸鼠人肝癌转移模型为材料，观察蛇毒对早期和晚期肝癌切除术后肿瘤转移复发的影响。结果：蛇毒处理的7721细胞ICAM－1(Intercellular adhesion molecule－1)表达明显低于对照组，蛇毒对7721细胞的侵袭能力无明显抑制作用，对已粘附细胞无明显促脱落作用，可抑制7721与7721细胞、内皮细胞的粘附，对7721－淋巴细胞之间的粘附无明显抑制作用、并可防治早期和晚期裸鼠人肝癌切除术后的肝内和远处转移复发。结论：蛇毒可抑制SMMC－7721细胞的粘附能力，防治裸鼠人肝癌切除术后的转移复发。

小鼠孕早期子宫内膜ICAM-1 mRNA的表达及调节

目的 :为探讨细胞间粘附分子 1mRNA(ICAM 1)在孕早期的作用和细胞因子对其表达的影响。方法 :用RT PCR法测定孕 1～ 8d小鼠子宫内膜ICAM 1的表达 ;在小鼠孕 2～ 4d分别腹腔注射细胞因子LIF、IL 1β或IL 1ra ,测定并比较各组孕第 4天子宫内膜ICAM 1mRNA表达水平。结果 :ICAM 1mRNA孕第 1天表达量较低 ,第 2天开始升高 ,第 4天达高峰 (P <0 0 1) ,此后缓慢下降。与对照组相比 ,LIF和IL 1β组ICAM 1mRNA的表达水平升高 (P <0 0 1)。结论 :ICAM 1在着床期表达水平较高 ,可能参与了着床过程中的胚胎粘附。细胞因子LIF和IL 1可能是子宫内膜表达ICAM

凝集素半乳糖结合蛋白3在人子宫内膜的表达

目的探讨凝集素半乳糖结合蛋白3(galectin-3)在子宫内膜的表达与子宫内膜容受性的形成和胚泡着床的关系。方法用RT-PCR和蛋白印迹法(Western blot)检测galectin-3mRNA和蛋白在增生晚期和分泌中期子宫内膜的表达。用免疫组化方法检测galectin-3蛋白在子宫内膜的定位和表达。结果galectin-3mRNA和蛋白在分泌中期子宫内膜的表达高于增生晚期,galectin-3蛋白定位于上皮细胞和间质细胞。结论结果提示galectin-3在分泌中期子宫内膜的高表达可能与子宫内膜容受性的形成和胚泡着床的过程有关。

抗肿瘤转移多聚β肽聚乙二醇化的研究

目的:研究抗肿瘤转移多聚β肽的聚乙二醇(PEG)化的方法及其作用。方法:采用甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEGALD5000)修饰多聚β肽;采用电泳和成像分析系统检测修饰率。以粘附实验检测生物活性。结果:(1)二聚β肽(β2)的修饰率为66.7%,三聚β肽(β3)为52.7%。(2)最佳反应条件为:pH值为5,多聚β肽和mPEGALD5000的摩尔之比为1∶10,反应温度为4℃,反应时间为24h。(3)修饰后产物在4℃下可稳定放置50d。(4)修饰后产物水溶解度增加。(5)β2,β2-PEG,β3和β3-PEG对SMMC-7721和HCCLM6细胞与纤连蛋白(FN)粘附均具有显著的抑制作用(P<0.01),而且PEG修饰后作用显著增强(P<0.05或P<0.01)。结论:采用mPEGALD5000能有效地将多聚β肽PEG化。多聚β肽和PEG修饰物对肿瘤细胞与FN的粘附具有特异的抑制作用,且PEG修饰后作用增强。

CK8寡糖链结构及翻译水平改变与人肝癌细胞转移相关性研究

糖组学方法筛查人肝癌细胞转移过程中发挥重要作用的核心岩藻糖基化蛋白质分子,解析比较筛出的差异蛋白——细胞角蛋白8(CK8)翻译及糖基化修饰改变与人肝癌细胞转移潜能的关系.应用双向电泳(2-DE)、凝集素亲和印迹、凝集素亲和沉淀联合质谱分析技术,筛查并验证与肝癌转移相关的核心岩藻糖基化蛋白;应用细胞免疫荧光和蛋白质免疫印迹检测CK8的蛋白质表达情况;应用免疫沉淀结合多种凝集素亲和印迹,推测其与肝癌转移相关的寡糖链结构改变.研究发现,3种不同转移潜能人肝癌细胞Hep3B、MHCC97-L和MHCC97-H的扁豆凝集素(LCA)亲和印迹表达谱中,分子质量55～60ku、等电点4～6区域处有核心岩藻糖基化蛋白呈差异表达,质谱鉴定为CK8.LCA亲和沉淀及蛋白质印迹进一步验证CK8异常核心岩藻糖基化与肝癌转移相关;研究发现,CK8分布于细胞浆内,在MHCC97-L和MHCC97-H细胞中蛋白质表达水平较Hep3B高,在MHCC97-H中与LCA和蓖麻凝集素(RCA-1)的亲和力较Hep3B强.以上结果提示,2-DE和凝集素印迹技术联合MALDI-TOF-MS/MS分析可用于筛查疾病过程相关的异常糖基化蛋白质分子,CK8蛋白水平、核心岩藻糖基化及β-1,4末端半乳糖基化的增加均与肝癌细胞转移潜能相关.