人补体受体1型活性片段SCR15-18在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

目的实现人补体受体1型(complement receptor type 1,CR1)活性片段SCR15-18在毕赤酵母中的分泌表达。方法用PCR从原核表达质粒pET32a-sCR1-SCR15-18上扩增CR1-SCR15-18的编码基因,并克隆到毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9,构建重组质粒pPIC9-CR1-SCR15-18,鉴定后测序;重组质粒电转化整合到毕赤酵母GS115基因组中,菌落PCR技术筛选阳性转化株;经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白的表达;Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化目的蛋白,并用体外抑制补体溶血反应实验测定目的蛋白的生物活性。结果成功构建重组表达质粒pPIC9-CR1-SCR15-18;SDS-PAGE和Western blot证实目的基因在毕赤酵母中成功分泌表达;表达产物经镍柱快速纯化后,能够明显抑制补体的体外溶血。结论在毕赤酵母中成功实现了CR1-SCR15-18蛋白的分泌表达,该蛋白具有较高的抑制补体溶血的生物活性。

补体在肠缺血再灌注损伤中的作用及机制

肠缺血再灌注后补体经典途径、MBL途径和旁路途径有不同程度的活化,补体活化产物C3a、C4a、C5a和攻膜复合物(MAC)能引起组织炎症损伤,其机制有MAC介导的直接效应,有C3a、C5a和亚溶解数量的MAC刺激白细胞和血管内皮细胞产生一系列炎症介质,导致肠黏膜损伤,甚至累及远端器官功能障碍的间接效应。目前,已有多种补体抑制剂用于对肠缺血再灌注损伤的保护研究。

sCR1-SCR15-18蛋白减轻补体介导的大鼠脑缺血/再灌注损伤

目的:探讨补体在大鼠大脑缺血/再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤中的作用及重组人可溶性补体受体Ⅰ型SCR15-18蛋白(sCR1-SCR15-18)的保护作用。方法:75只雄性SD大鼠,随机分为假手术组、I/R组和sCR1-SCR15-18保护组。采用线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞模型(middle cerebral artery occlusion MCAO),缺血2h,再灌注24h后,进行神经功能学评分,测定脑梗死体积、大脑皮质髓过氧化物酶(myeloperoxi-dase,MPO)活性,观察大脑皮质区补体C3b沉积和病理改变。结果:缺血/再灌注24h后,sCR1-SCR15-18保护组神经功能学评分,脑梗死体积及脑皮质MPO活性明显低于I/R组(P<0.05);sCR1-SCR15-18保护组缺血脑组织补体C3b沉积明显减少,病理损伤减轻。结论:补体在脑I/R损伤中起一定作用,sCR1-SCR15-18蛋白对大鼠I/R损伤脑具有保护作用。

重组工程菌pET32a-CR1-SCR15-18/BL21(DE3)高密度发酵工艺研究

目的建立重组工程菌pET32a-CR1-SCR15-18/BL21(DE3)的高密度发酵工艺。方法以摇瓶发酵结果为基础,扩大至发酵罐发酵,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如发酵培养基、培养温度、pH值、活化时间、诱导时间及分批补加营养物质等条件进行优化。结果采用改良M9-CA培养基、37℃活化4 h后以0.2 mmol/L IPTG诱导表达4 h,以甘油为碳源,在生长期和诱导期分别以40 ml/h和70 ml/h的速率连续流加补料,全程滴加氨水保持培养基pH值保持在7.5,调节转速控制溶解氧在40%左右。最终菌体产量提高至40 g/L以上,CR1-SCR15-18蛋白表达率达28%以上。结论高密度发酵工艺显著提高了工程菌的产量和CR1-SCR15-18蛋白的表达水平。

重组人补体受体1型SCR15-18片段对肠缺血再灌注损伤的保护作用

目的:探讨人补体受体1型功能域SCR15-18(CR1-SCR15-18)对大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用。方法:SD大鼠随机分为假手术组(SO)、缺血再灌注组(I/R)和CR1-SCR15-18保护组(CR1)。结扎肠系膜上动脉30 min,再灌注60 min,建立小肠缺血再灌注模型,再灌注前5 min注射CR1-SCR15-18蛋白(30 mg/kg)。测定肠黏膜血管的通透性、组织髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;HE染色观察小肠病理改变并根据Chiu's方法评分;免疫组织化学法检测补体C3组分的沉积。结果:与SO组相比,I/R组通透性增加,MPO活性和MDA含量显著升高,而SOD活性降低,肠黏膜病理损伤严重且有大量补体C3组分沉积。与I/R组相比,CR1组肠黏膜血管通透性显著降低,MPO活性和MDA含量显著降低,而SOD活性升高,肠黏膜损伤明显减轻,只有少量补体C3组分沉积。结论:CR1-SCR15-18蛋白抑制肠缺血再灌注时补体的活化,减轻肠组织损伤。

某建筑综合体分布式能源系统模拟分析

建立了某建筑综合体分布式能源系统的热力设备模型,分别搭建了"以电定热"与"以热定电"模式下综合体分布式能源系统及传统分供系统的TRNSYS模拟平台。模拟计算了不同模式下的全年能耗,并与传统的分供系统进行了节能、环保方面的对比评价。通过综合比较和分析,该综合体分布式能源系统应优先考虑"以热定电"模式。

关于落实学生硬笔执笔规范教育的研究

硬笔执笔规范教育是继承和弘扬中华民族优秀传统文化的一项基础工程,是学校素质教育的一项重要组成部分,对提高学生文化素质、培养学生审美水平、促进学生身心健康具有直接的促进功能。对学生意志的磨练、情操的陶冶、良好习惯的养成、坚强品格的培养都会产生潜移默化的作用,这是网络、电脑、手机、键盘无法取代的。执笔正确直接影响到运笔的灵活、书写的速度和书写的效果。分析了当前小学生执笔不规范的原因,通过抓写字的习惯和常规,发现并纠正学生不良的执笔姿势,加强学校管理,认真落实每天写字20分钟等途径提出解决对策。

增强定向造血分化信号提高人胚胎干细胞向自然杀伤细胞生成的效率

目的探讨在造血分化阶段增强定向造血(DH)信号对人胚胎干细胞(hESCs)分化形成的自然杀伤(NK)细胞(也称为hESC-NK细胞)生成效率和功能的影响。方法hESC(H1)经离心法形成拟胚体,在诱导造血分化的第0至8天,对照组加入BMP4、VEGF、bFGF、SCF等细胞因子;而增强定向造血(DH)组在对照组的基础上添加WNT激动剂(CHIR99021)和Nodal-activin抑制剂(SB431542);进而采用一致的方法分化形成NK细胞。使用流式细胞术和靶细胞K562共培养等方法分析造血分化效率、NK细胞生成效率、体外效应功能及表面受体等相关分子表达。结果相较于对照组,DH组在造血分化阶段第8天动脉生血内皮细胞(CD34^(+)DLL4^(+))数量显著增加,原始造血相关细胞(CD34^(-)CD43^(+))显著降低(P<0.05)。在NK细胞分化第28天分析发现,DH组NK细胞(CD45^(+)CD56^(+))数量显著增加,效应功能相关分子IFN-γ、Granzyme B、Perforin、CD107a虽微弱上升,但无统计学差异,激活性受体CD16a和CD69明显增加,但NKP46显著降低,抑制性受体NKG2A显著增加,CD96显著降低(P<0.05)。结论在hESC向造血分化过程中增强定向造血信号,在不影响NK细胞体外功能的情况下显著提高NK细胞生成效率和CD16a表达,为提高hESC-NK细胞或iPSC-NK细胞生成效率提供了一种新的思路。

特异标记生血内皮的诱导性多能干细胞系的构建

目的:拟将造血干细胞生血内皮特异的Neurl3-EGFP荧光报告小鼠来源的胚胎成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞。方法:通过导入3个经典转录因子(Oct4、Sox2和Klf4),利用iCD1无血清培养液高效完成Neurl3-EGFP荧光报告小鼠胚胎成纤维细胞的重编程,并完成各项多能性鉴定。结果:Neurl3-EGFP荧光报告小鼠胚胎成纤维细胞来源的诱导性多能干细胞在细胞形态学与多能性基因的表达方面均与小鼠胚胎干细胞类似。结论:利用Oct4、Sox2和Klf43个转录因子的共感染,将Neurl3-EGFP荧光报告小鼠的胚胎成纤维细胞成功重编程为具有全能性的可特异标记生血内皮的诱导性多能干细胞。

临床医学专业“医学微生物学”实验教学的调查与思考

目的调查并改进“医学微生物学”的实验教学质量和效果。方法在本校2013级临床医学五年制本科学生中展开了问卷调查,就医学微生物学实验课程的教学内容、教学方式、考核体系等方面逐一进行分析。结果77.9%的学生对目前实验课的教学方式感到满意;73.7%的学生认为实验课内容的设置合理,74%的学生在其他临床基础课程中接触过“医学微生物学”实验课的部分内容;60.6%的学生建议实验课与理论课的学时比例保持不变,20.7%的学生认为应该增加实验课的学时;认为实验课对理论知识的理解和操作能力的培养有一定帮助或帮助很大的学生占92.7%;对于实验课的考核方式及实验报告的形式,感到满意的学生分别为45%和38%。结论问卷调查结果有助于我们及时总结教学经验、改进教学方法,促进教学效果的提高。

双功能域小分子补体受体1型衍生物的构建、表达、纯化及生物功能鉴定

目的克隆表达出能够抑制补体活化的双功能域小分子补体受体1型（complement receptor type 1，CR1）衍生物。方法从外周血提取总RNA，进行RT—PCR扩增出功能性片段I（CR1-SCR1—3）；以本室构建的pET-32a—CR1-SCR15—18为模板扩增功能性片段Ⅱ（CRl-SCR15—17）；利用重叠延伸PCR（SOE—PCR）法扩增出包含双功能域的融合基因。将融合基因重组于pET-32a（＋）载体，转化大肠杆菌Rosetta，经酶切及DNA序列测定鉴定后，IPTG诱导表达，SDS—PAGE和Western blot对表达蛋白质进行分析鉴定。蛋白质经Ni柱亲和层析及透析复性后，采用50％补体溶血抑制试验（CH50）进行功能鉴定。结果酶切及DNA序列测定证实成功构建出了pET-32a—CR1-SCR（1-3＋15-17）重组表达载体，IPTG诱导表达后在相对分子质量（Mr）为63×10^3处有一明显的条带，经Western blot鉴定为目的蛋白，Ni柱亲和层析获得纯度约为92％的目的蛋白，功能试验证实，在0～200μg／ml的融合蛋白剂量范围内，随着浓度的增加，补体抑制活性增强。结论成功构建并在大肠杆菌内表达了具有较高生物活性的重组双功能域小分子CR1衍生物，为体内保护实验研究提供实验数据。

某车站综合体天然气冷热电联供系统方案研究

以某车站综合体作为研究对象,预测冷热电负荷,对以热定电、以电定热方式下的天然气冷热电联供系统的设备配置及系统流程进行分析。采用DEST模拟软件模拟车站综合体全年逐时冷热负荷。在估算电负荷时,考虑不同功能房间照明装置、用电设备的电负荷指标以及空调系统设备(空调末端装置、循环泵、冷却塔)的电负荷指标,根据相关用电装置逐时使用率对电负荷进行估算。在以热定电、以电定热方式下,天然气冷热电联供系统的设备配置及系统流程均存在差别。