Slit2蛋白对深静脉血栓作用的实验研究

目的探讨Slit2过表达对深静脉血栓形成的影响。方法利用Slit2过表达转基因小鼠进行下腔静脉结扎造模,观察血栓形成的情况,测量出血时间、血栓重量长度比,HE染色观察血栓形成的病理形态,并同时设立C57小鼠对照组。结果成功建立了小鼠下腔静脉血栓模型;在造模48h后Slit2过表达转基因小鼠与C57小鼠相比,裸血栓重量长度比明显减小;出血时间延长;Slit2过表达小鼠形成的血栓中白色血栓所占比例较小,而C57小鼠则白色血栓所占比例较大。结论 Slit2过表达能通过抑制白色血栓形成,从而有效抑制深静脉血栓的形成。

SphK1-S1P信号通路的激活参与糖尿病大鼠肾损伤的研究

目的观察鞘氨醇激酶1-1-磷酸鞘氨醇(SphK1-S1P)信号通路在链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠肾脏中的激活情况。方法观察STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏中SphK1-S1P信号通路的激活情况。分别检测大鼠肾脏功能及病理指标。采用液质联用分析SphK1活性及S1P含量。并采用免疫组织化学、Real-time PCR和Western blot法检测了SphK1的表达。结果 STZ诱导的糖尿病大鼠血糖、肾重体质量比、24h尿蛋白显著升高,糖尿病大鼠肾脏系膜区肥大,细胞外基质扩展。同时,糖尿病大鼠肾脏中SphK1-S1P信号通路被激活,表现为SphK1表达和活性增加,以及S1P生成增加。结论糖尿病大鼠肾脏中存在SphK1-S1P信号通路的激活,可能参与了糖尿病大鼠肾损伤过程。

SGT基因在小鼠深静脉血栓形成中的作用

目的探讨SGT(small glutamine-rich tetratricopeptide repeat-containing protein)在深静脉血栓(deep vein thrombosis,DVT)形成中的作用。方法分别对SGT基因敲除小鼠及野生型对照鼠进行下腔静脉结扎建立DVT模型,观察建模后两种小鼠体内血栓形成情况,测定出血时间、凝血时间、血栓重量及长度。HE染色观察血栓形成的病理形态特点,ELISA法检测血清中可溶性细胞间黏附分子-1(soluble intercellular adhesion molecule-1,sICAM-1)和白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)的表达。结果与野生型对照鼠相比,SGT基因敲除小鼠在建模48 h后,裸血栓重量长度比明显减小,凝血时间和出血时间均显著延长,形成的血栓中纤维蛋白所占比例较小;SGT基因敲除小鼠血清中sICAM-1表达水平显著低于对照鼠,IL-6的表达水平差异无统计学意义。结论 SGT基因敲除能有效抑制DVT的形成,其作用机制可能与血小板功能受影响及细胞间黏附分子表达改变有关。

建立小鼠深静脉血栓模型的实验研究

目的建立小鼠深静脉血栓动物模型。方法采用下腔静脉结扎法制备动物模型,观察血管中血栓形成的病理变化并与假手术组比较。结果模型小鼠下腔静脉内形成稳定的血栓,且符合人体静脉血栓形成的病理特性。病理观察显示模型组静脉可见血栓并充满管腔,且与管壁无粘连,而假手术组静脉中无血栓形成。结论成功建立了小鼠深静脉血栓模型。

ApoE^(-/-);SAP-Tg小鼠模型的构建

目的为研究SAP蛋白在动脉粥样硬化中的作用及机制,拟构建ApoE-/-;SAP-Tg小鼠模型。方法分别选取6~8周龄的雄性ApoE-/-小鼠与血清淀粉样蛋白P转基因(SAP-Tg)6周龄的雌性小鼠杂交,得到的杂交后代以剪尾方式提取基因组DNA,用PCR法检测小鼠的基因型。结果雄性ApoE-/-小鼠与雌性SAP-Tg小鼠杂交得F1代后自交,在F2代获得ApoE-/-;SAP-Tg基因型小鼠,模型构建成功。结论将ApoE-/-小鼠与SAP-Tg小鼠杂交2代后成功建立了ApoE-/-;SAP-Tg小鼠模型,并可通过筛选出的F2代ApoE-/-小鼠和ApoE-/-;SAP-Tg小鼠交配进行繁育筛选工作。

SphK1信号通路对高糖诱导的系膜细胞FN表达的影响

目的研究阻断鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,SphK1)通路对高糖诱导的大鼠系膜细胞(glomerular mesangial cells,GMC)中纤维连接蛋白(fibronectin,FN)表达的抑制作用。方法采用RealtimePCR检测SphK mRNA水平;Western blot检测FN的蛋白表达。结果 SphK1抑制剂二甲基鞘氨醇(N,N-Dimethylsphingosine,DMS)显著降低高糖诱导的FN表达;转染SphK1 siRNA可有效消除高糖诱导的FN上调效应。结论 SphK1通路在高糖诱导的肾小球系膜细胞FN表达过程中发挥着重要的调节作用。

检测细胞中1-磷酸鞘氨醇含量的LC-MS/MS分析方法的建立

目的建立并确证可以检测1-磷酸鞘氨醇(S1P)快速、灵敏、特异的LC-MS/MS定量分析方法。方法采用C17-S1P作为内参,甲醇一步法进行蛋白沉淀,随后进行正相电喷雾离子化LC-MS/MS分析。流动相为甲醇-0.1%甲酸水(95∶5,v/v),流速0.2mL/min,每个样品的分析时间为4min。细胞经TNF-α处理后S1P含量显著增加;而经DMS处理后S1P含量显著下降。结果 S1P的标准曲线线性范围为0.1～10ng/mL。相关系数r2均大于0.989。结论该方法可以快速,灵敏,特异性地同时检测生物样品中S1P的含量。

虎杖苷抑制肝星状细胞活化研究

目的:研究虎杖苷的抗肝纤维化药理作用。方法:采用转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激人肝星状细胞株(LX-2)诱导肝纤维化细胞模型,采用虎杖苷(20μM)进行干预。Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果:虎杖苷能显著抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞α-SMA的表达。结论:虎杖苷具有显著改善肝纤维化的作用,有望成为新型的抗肝纤维化药物。

检测生物样品中SphK1活性的LC-MS/MS分析方法的建立

目的建立并确证一种快速、灵敏、高效的测定生物样品中SphK1活性的液质联用(LC-MS/MS)分析方法。方法采用C17-Sph作为底物,通过测定产物C17-S1P的生成量来评价SphK1的活性进行体外酶促反应。终止反应后,生物样品经液-液萃取,真空干燥,复溶,进行LC-MS/MS分析。通过测定产物C17-S1P的生成量来评价SphK1的活性。结果 C17-S1P标准曲线的线性范围为10～1 000 ng mL-1,相关系数r2>0.998,最低检测限(LLOQ)为10 ng mL-1。HEK293细胞转染了野生型SphK(SphKWT)后,SphK1活性显著增加。相反HEK293细胞转染了突变型SphK(SphKG82D)后,SphK1活性接近正常水平。结论该方法能够灵敏快速地测量SphK1活性,为研究SphK1信号通路及其相应靶标药物提供了有效的分析手段。

SphK1突变抑制高糖培养的系膜细胞纤维连接蛋白过度表达的研究

目的研究鞘氨醇激酶-1(SphK1)突变是否抑制了高糖培养的系膜细胞中纤维连接蛋白(FN)的过度表达。方法采用Western blot检测FN的表达。结果系膜细胞转染了SphK1突变质粒后可消除高糖诱导的FN上调效应。结论本研究结果证明了SphK1在高糖诱导的系膜细胞FN表达过程中发挥着重要的调节作用。