猪lncRNA LOC102157897表达、定位及其对PEDV复制的调控作用

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的高度传染性疾病,前期基于组学测序筛选出1个关键lncRNA(LOC102157897),有关其表达定位以及对PEDV复制的调控作用目前尚不清楚。首先在组织和细胞水平上测定PEDV感染前后LOC102157897的表达水平;其次利用lncLocator软件预测和核质分离试验分析其细胞定位情况,并验证其表达水平与PEDV复制的关系;最后利用转录组测序筛选其下游靶基因及信号通路。结果表明:PEDV感染可极显著提高猪空肠组织和IPEC-J2细胞中LOC102157897的表达水平;LOC102157897主要定位于细胞核中,这可能与其生物学功能有关;成功构建了LOC102157897干扰细胞系,且干扰后IPEC-J2细胞中PEDV复制水平呈极显著下降。表达水平下调有利于提高宿主细胞对PEDV感染的抵抗能力。转录组测序分析显示,LOC102157897干扰前后存在151个差异表达基因,主要参与病毒蛋白互作、趋化因子信号、白细胞受体互作、白细胞介素17信号等免疫通路,并根据功能注释和差异程度,筛选出2个组蛋白基因H2AC18和H3C14。综上,这一研究确定了1个PEDV抗性相关lncRNA分子LOC102157897,并初步探究了其功能和下游调控机制,为揭示lncRNA在PEDV感染宿主过程中的重要作用以及为今后制定PEDV的抗病育种工作策略和筛选分子标记物奠定基础。

苏山猪和巴克夏猪全基因组ROH检测和选择信号分析

旨在明确苏山猪群体和巴克夏猪群体的遗传变异位点和多态信息,本研究首先对43个苏山猪样本和21个巴克夏猪样本进行DNA提取,然后利用“中芯一号”50K SNP芯片对DNA的SNP位点进行检测;使用Plink软件对SNP位点进行主成分分析;使用DetectRUNS软件包对样本进行全基因组ROH检测;选用3种方法(ROH、CLR和iHS)对选择信号进行分析。本研究总共鉴定到苏山猪42282个SNPs位点和巴克夏猪27718个SNPs位点。其中,苏山猪和巴克夏猪均被划分为3个家系。本研究在苏山猪中共检测到2071个ROH片段,F_(ROH)平均值为0.096。巴克夏猪中共检测到1853个ROH片段,F_(ROH)平均值为0.199。在苏山猪和巴克夏猪群体中分别检测到4个和40个高频ROH区域,分别注释到8个和103个基因,通过富集分析鉴定了50个显著的候选基因。另外,通过ROH、CLR和iHS共3种选择信号分析方法,对苏山猪和巴克夏猪的选择信号区域进行了鉴定,发现有42个基因可能受到选择。本研究初步揭示了苏山猪和巴克夏猪的基因组SNP图谱,并通过高频ROH分析和选择信号检测鉴定到一些可能影响猪的生长发育、肉质、营养和一般抗病力的基因,为苏山猪和巴克夏猪的选育利用提供了理论基础。

基于CRISPR/Cas9技术构建猪KLF4基因敲除细胞系及其对细胞活性的影响分析

【目的】试验旨在利用CRISPR/Cas9技术构建Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)基因敲除的猪小肠上皮细胞,并探究KLF4基因敲除对于细胞活性和细胞周期的影响。【方法】在猪KLF4基因转录本第1外显子区域设计3条sgRNAs(sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3),经退火形成的双链DNA与线性化pGK1.1载体连接,产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞进行鉴定,并将重组载体转染至猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)。PCR扩增敲除位点附近序列,并通过测序判断sgRNA敲除效率;利用CruiserTMEnzyme酶切鉴定阳性细胞克隆,通过TA克隆测序鉴定敲除序列;利用Western blotting检测基因敲除细胞中KLF4蛋白表达情况。利用CCK-8和流式细胞术检测KLF4基因敲除后细胞活性和细胞周期的变化。【结果】重组载体测序结果显示,sgRNAs与pGK1.1成功连接。分析敲除效率发现,3个sgRNAs均可对靶序列进行敲除,其中sgRNA3有较高的敲除效率。PCR产物经CruiserTMEnzyme酶切筛选出2个阳性单克隆细胞。TA克隆测序分析发现,KLF4基因2个等位基因序列分别缺失116和137 bp。Western blotting结果表明,KLF4基因敲除细胞中未见KLF4蛋白表达。细胞活性及细胞周期分析显示,敲除KLF4基因极显著抑制了细胞活性(P<0.01),并导致G0/S细胞周期阻滞。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了KLF4基因敲除的IPEC-J2细胞,且KLF4基因敲除可抑制细胞活性,并引起G0/S细胞周期阻滞。KLF4基因敲除细胞可为进一步探究KLF4基因功能及分子机制提供材料。

干扰素刺激基因ISG15对猪流行性腹泻病毒复制的作用及机制分析

【目的】探究干扰素刺激基因ISG15在猪流行性腹泻病毒(PEDV)复制中所发挥的作用及机制。【方法】利用实时荧光定量PCR检测ISG15基因组织表达谱及肠道组织差异表达情况,同时以猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)为研究模型,检测PEDV CV777毒株感染细胞不同时间点PEDV M基因mRNA和N蛋白表达量,并从RNA和蛋白水平检测ISG15表达变化;分别构建猪ISG15基因干扰和过表达细胞,通过实时荧光定量PCR、Western blotting及间接免疫荧光试验检测ISG15基因表达对PEDV复制水平的影响;对ISG15基因过表达前后进行转录组测序分析,筛选其下游调控基因及信号通路。【结果】ISG15基因在仔猪肠道组织中特异性高表达,其中空肠和回肠中表达量极显著高于其他组织(P<0.01);PEDV感染组十二指肠、空肠及回肠中ISG15基因表达量显著或极显著高于健康组(P<0.05;P<0.01);M基因mRNA和N蛋白表达量出现上升趋势,与0 h相比,ISG15基因表达水平在24 h出现极显著上调(P<0.01);ISG15基因过表达后PEDV复制出现显著或极显著下降(P<0.05;P<0.01),而ISG15基因干扰后PEDV复制出现极显著上调(P<0.01);转录组测序发现,过表达ISG15基因前后存在1 532个差异表达基因,且其主要富集在自噬、MAPK、内吞等信号通路中。【结论】本研究揭示了PEDV感染过程中ISG15基因的调控功能及作用机制,发现ISG15基因上调可显著抑制PEDV复制,增进了对PEDV与宿主细胞互作分子机制的认识。

中国家鸡和红色原鸡mtDNA控制区遗传多态性及系统进化分析

通过线粒体DNA控制区的结构和多态性来研究中国家鸡和红色原鸡的遗传多态性与系统进化。测定14个中国地方鸡种和红色原鸡2个亚种的256个个体线粒体DNA控制区部分序列约560bp，结果表明，A、C、G、T这4种核苷酸的平均比例分别为25．∞％、37．40％、4．40％和33．20％。共发现44个变异位点，约占分析位点总数的7．86％，没有观测到插入／缺失，颠换和转换之比为0．13；共具有32种单倍型，9种为共享单倍型；16个群体内单倍型多样度从0到0．964，单倍型变异度总体为0．909±0．014，整体的平均核苷酸差异数为7．276，核苷酸多样度为1．851％。群体间核苷酸分歧度（Dxy）在0．747％～3．125％之间变化，核苷酸净遗传距离（Da）为0．015％～2．633％。16个群体表现出较高水平的遗传多态性，群体间表现出显著的遗传分化。群体遗传多态性和亲缘关系分析表明，一些中国家鸡的群体（如固始鸡和仙居鸡）起源于泰国红色原鸡Gallus gallu sgallus亚种，一些中国家鸡的群体（如茶花鸡和藏鸡等）起源于中国红色原鸡Gallus gallus spadiceus亚种，在一些中国地方鸡种还同时具有这2种红色原鸡的遗传贡献；认为中国家鸡起源于泰国或单纯起源于中国的观点都是不全面的。

样本量和性比对微卫星分析中群体遗传多样性指标的影响

以4个中国地方鸡品种遗传多样性的微卫星分析数据为例,分析样本量和性比对微卫星分析中群体遗传多样性指标的影响。结果表明:当样本量超过20后,期望杂合度值趋于稳定,样本量与期望杂合度无显著相关,而与平均等位基因数呈正相关,在微卫星分析中性比对群体遗传多样性指标不表现出显著影响;微卫星位点多态性的高低直接影响到检测所需的样本量,在使用平均等位基因数分析群体遗传多样性时,应该充分考虑样本量对检测结果的影响;期望杂合度受样本量变动的影响较小,可作为度量群体遗传多样性的一个最适参数,而且样本量以20～25较为适宜。

藏鸡和萧山鸡体尺及屠宰性能的比较分析

对藏鸡和萧山鸡的体尺和屠宰性能进行测定,并对测定的指标进行相关性分析,结果表明:藏鸡12周龄平均体斜长、龙骨长、髋宽、胫长、胫围分别为15.36cm,10.26cm,8.42cm,7.94cm和3.42cm,萧山鸡上述指标分别为17.7cm,11.96cm,10.31cm,8.84cm和3.73cm,藏鸡公鸡的屠宰率、半净膛率、全净膛率、胸肌率和腿肌率分别为88.02%,89.03%,71.00%,12.60%和20.91%,萧山鸡公鸡分别为87.97%,89.12%,73.01%,12.83%和21.00%。藏鸡和萧山鸡常规肉质没有显著差异,萧山鸡的体尺和屠宰性能间均存在中度或高度相关,但在藏鸡中并无这种相关性。

中国红原鸡和泰国红原鸡遗传多样性分析

利用29个微卫星DNA标记对来自中国的红原鸡Gallus gallus spadiceus亚种和来自泰国的红原鸡Gallus gallus gallus亚种进行遗传多样性分析,评估亚种内的遗传变异和亚种间的遗传分化,结果表明:共检测到168个等位基因,每个位点的等位基因数从2到13不等,所有位点平均的期望杂合度和PIC值分别为0.5780和0.53。中国和泰国红原鸡29个微卫星位点平均有效等位基因数分别为3.79和4.79,平均基因杂合度为0.5379和0.6385,两个红原鸡亚种均表现出较高的群体杂合度和丰富的遗传多样性。群体分化系数为19.4%(P<0.01),两个红原鸡亚种间的Reynolds’遗传距离和Nm值分别为0.157和1.040。由此可见,Gallus gallus spadiceus亚种和Gallus gallu sgallus亚种群体具有不同的群体遗传结构,群体之间存在明显的遗传分化,并不能将其认定为是同一亚种,这也为中国家鸡具有独立的起源提供了一定的佐证。

孔雀微卫星引物筛选及其遗传多样性分析

利用29对鸡微卫星标记对孔雀基因组DNA进行种间扩增,发现14对引物能扩增出特异性条带,每对引物扩增的平均等位基因数为1.71,有7对引物具有较丰富的多态性,其中MCW0080和MCW0098最为理想。蓝孔雀和绿孔雀群体间和群体内的遗传分析结果表明,绿孔雀和蓝孔雀两个群体的期望杂合度分别为0.7422和0.6943,群体间的遗传分化系数为0.078,Reynolds’遗传距离和基因流分别为0.0603和3.896,结果显示这两个孔雀群体的杂合度和遗传多样性水平都很低,且有相互混杂的趋势。

19个猪种SLA-DQB基因外显子2多态性分析

本研究旨在系统分析国内外猪种SLA-DQB基因的多态性,以期为进一步研究猪SLA-DQB与疾病抗性的相关性提供理论依据。采用PCR-RFLP方法,野猪、14个中国地方猪种和4个引进猪种SLA-DQB基因第2外显子经限制性内切酶HaeⅢ酶切后,共检测到5个等位基因,9种基因型。其中野猪中仅存在A、B 2种等位基因;家猪群体中出现了野猪群体中所没有的6种基因型和3种等位基因。中国地方猪种与引进猪种相比,RFLP带型较为丰富,五指山猪和淮猪中具有8种基因型,多态性最为丰富。除野猪群体中A等位基因为优势等位基因外,其它所有家猪群体中均以B和C基因为优势等位基因;临高猪中出现其它猪种所没有的D等位基因,表现出独特的特性。本研究结果提示,生态环境和遗传纯度均可能影响SLA-DQB等位基因的多样性,总体上,引进猪种、培育猪种和地方猪种SLA-DQB基因外显子2的基因型分布并不存在明显的差异,但PCR-RFLP带型在具体的品种之间的差别较大。

我国11个地方鸡品种体尺、生态特征多元统计分析

利用主成分和聚类分析对我国11个地方鸡品种(白耳鸡、藏鸡、大骨鸡、河南斗鸡、固始鸡、狼山鸡、鹿苑鸡、丝羽乌骨鸡、仙居鸡、萧山鸡、北京油鸡)的体尺、体重和生态特征资料进行多元统计分析。结果表明:主成分分析选取前3个特征值作为3个主成分(占总信息量的88.659%),并根据各品种的前3个主成分值计算相似系数,进行聚类分析,11个地方鸡品种可划分为高海拔型和低海拔型两类,这说明生态因子亦是品种分类中一个重要因素。

猪TLR4基因在F18大肠杆菌抗性型和敏感型资源群体间的差异表达分析

本研究旨在检测TLR4基因mRNA在猪各个组织的分布以及在F18大肠杆菌抗性型和敏感型群体间差异表达水平,为探讨该基因在免疫识别和F18大肠杆菌抗性中发挥的作用提供理论依据。本试验运用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术进行定量测定。首先,各取8头35日龄F18大肠杆菌抗性型和敏感型苏太仔猪组织样,包括心脏、肝脏、脾脏等11个组织,提取总RNA,以GAPDH基因为内参基因,进行实时荧光定量PCR。对TLR4基因mR-NA进行均一化处理,利用荧光阈值(Ct值)计算TLR4基因mRNA在各个组织以及F18大肠杆菌抗性型和敏感型群体间表达量。结果显示,TLR4 mRNA在猪各种组织中广泛表达,在肺、淋巴结、肾脏和脾脏等免疫器官中表达量较高,F18大肠杆菌敏感型的TLR4基因表达量普遍高于抗性型个体的表达量,在各个组织中(除胃外)TLR4表达量差异倍数从1.083到2.980不等;在肺、淋巴结、肾脏和胸腺组织中,F18大肠杆菌敏感型的TLR4基因表达量显著高于抗性型个体的表达量(P<0.05)。本研究结果表明,TLR4基因通过天然免疫识别机制对猪F18大肠杆菌病等革兰氏阴性疾病有一定的影响,TLR4基因表达量的下调与F18大肠杆菌的抗性具有一定程度的关系。

安徽两个地方鸡品种遗传多样性的微卫星DNA分析

利用29个微卫星DNA标记对两个安徽地方鸡品种进行遗传多样性分析,评估品种内的遗传变异和品种间的遗传分化。在29个微卫星位点共检测到210个等位基因,每个位点的等位基因数从2到21不等,所有位点平均的期望杂合度和PIC值分别为0.6214和0.59。淮南麻黄鸡和皖南三黄鸡29个微卫星位点平均有效等位基因数分别为5.55和6.38,平均基因杂合度为0.6194和0.6442,群体分化系数为4.8%,两个鸡品种间的Reyn-olds遗传距离和Nm分别为0.0513和4.7500。两个安徽地方鸡品种均表现出较高的群体杂合度和丰富的遗传多样性。

苏太猪SLA-DQB基因外显子2多态性及其与繁殖性能的关联分析

采用PCR-RFLP法对苏太猪SLA-DQB基因外显子2的PCR产物进行分析,结果显示,SLA-DQB基因外显子2经RsaⅠ酶切后,共分出4种基因型;经HaeⅢ酶切,共分出3种基因型。χ2适合性检验结果表明,苏太猪SLA-DQB基因外显子2在RsaⅠ和HaeⅢ酶切位点都已经达到了Hardy-Weinberg平衡状态。在RsaⅠ和HaeⅢ酶切后分出的4种组合带型中,组合带型为BBEE的种母猪第3胎总产仔数、产活仔数、初生窝重、断奶仔猪数和断奶窝重均显著高于组合带型为AADD的个体(P<0.05),也高于组合带型为ABDE和ACDE的个体,但是差异不显著(P>0.05)。

苏太猪FUT1基因M307位点多态性及其对部分免疫指标的遗传效应分析

本研究旨在分析苏太猪抗F18大肠杆菌病育种基础群FUT1基因M307位点对部分免疫指标的遗传效应,为下一步苏太猪抗病育种工作提供一定的理论依据。采用PCR-RFLP方法对苏太猪抗F18大肠杆菌病育种基础群FUT1基因M307多态性进行分析,并探讨其与部分免疫指标的关系。结果表明,基础群中576个个体FUT1基因M307位点经Hin6Ⅰ酶切后,产生AA、AG和GG3种基因型,基因型频率分别为0.235、0.609和0.156,抗性基因A为优势等位基因,频率为0.540;群体显著偏离了Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.01)。AA基因型个体的血红蛋白(HGB)和白细胞计数(WTBC)显著高于AG和GG型个体(P<0.05),AG和GG型个体间差异不显著(P>0.05);AA基因型个体的异嗜性粒细胞与淋巴细胞比率(H/L值)显著低于AG和GG型个体(P<0.05),AG和GG型个体间差异不显著(P>0.05);AA基因型个体与AG和GG型个体间SRBC抗体滴度差异不显著(P>0.05)。本试验结果初步说明苏太猪F18抗性型群体具有抗逆性强的优良特性,AA基因型不仅对仔猪断奶后水肿病和腹泻病具有抗性,而且具有较高的一般抗病力。

大肠杆菌F18菌株敏感和抵抗基因型仔猪十二指肠基因表达谱差异分析

文章运用Agilent双标记表达谱芯片,基于已建立的苏太猪大肠杆菌F18菌株敏感性和抗性型全同胞配对个体,分析十二指肠组织基因表达谱差异,旨在筛选导致仔猪断奶后腹泻和水肿病发生的大肠杆菌F18菌株受体相关基因,探讨造成大肠杆菌病抗性和敏感性资源家系抗性差异的分子生物学机理。研究结果显示,以Fold change绝对值大于2倍进行筛选,在敏感型(GG基因型)对抗性型(AA基因型)配对组中,差异基因共13个,其中上调6个,下调7个,在以敏感型(AG基因型)对抗性型(AA基因型)配对组中,共筛选出差异基因6个,其中上调4个,下调2个。经GO分析发现差异基因的生物学过程主要涉及免疫应答、胞外区修饰(如糖基化)、细胞黏附、信号转导等。通路发现大肠杆菌F18菌株抵抗性和敏感性差异基因主要涉及糖脂合成代谢以及炎症免疫相关通路,经芯片筛选出的相关基因的功能还需进一步的研究验证。

杜洛克FUT1基因多态性及其与产仔性能的关联分析

采用PCR-RFLP方法对杜洛克FUT1基因多态性进行分析。结果发现:杜洛克FUT1基因开放阅读框307位点经Hin6Ⅰ酶切后,检测到AA、AG和GG3种基因型,AA基因型的频率为0.157,A基因的频率为0.353。分析这3种基因型与杜洛克产仔性能间的关联性。结果表明:抗性纯合子AA基因型的个体1～5胎每个胎次的产仔数均值均高于AG和GG基因型,且第1胎和第4胎的产仔数均值显著高于AG和GG基因型(P<0.05),AA基因型对产仔性能而言是有益基因型。

微卫星标记与仙居鸡体重的相关性

利用29个微卫星标记的多态性分析仙居鸡12周龄体重与微卫星标记的相关性。试验结果表明:位于3号染色体和连锁群E27C36W25W26上的2个微卫星标记MCW222、MCW165与仙居鸡12周龄体重显著相关。

野猪和17个家猪群体SLA-DRB基因外显子2的多态性分析

采用PCR-RFLP方法对野猪和国内外17个家猪品种SLA-DRB基因第2外显子的多态性进行分析,进一步分析SLA-DRB基因与疾病抗性的关系。结果表明:经限制性内切酶RsaⅠ酶切后,共检测到4个等位基因和10种基因型。在野猪中仅存在BB基因型和B等位基因,而在家猪群体中出现了野猪群体中所没有的9种基因型和3个等位基因。五指山猪、临高猪、荣昌猪和藏猪的多态性较为丰富,且具有全部4个等位基因。A等位基因在大多数家猪群体中为优势等位基因,B等位基因在梅山猪、五指山猪、藏猪、荣昌猪中为优势等位基因;BB基因型仅在五指山猪、临高猪、藏猪、荣昌猪和太湖猪群体中分布,地方猪品种中梅山猪BB基因型和B等位基因的频率最高。野猪及17个家猪群体间SLA-DRB基因第2外显子遗传多态性可能是由生态环境差异及自然和人工选择所致,这些遗传差异性可能与抗病力有关。

29个微卫星标记与淮南麻黄鸡体重的相关性分析

利用29个微卫星标记的多态性分析淮南麻黄鸡12周龄体重与微卫星标记的相关。结果表明:位于3号染色体和10号染色体上的2个微卫星标记MCW0222、ADL0122与淮南麻黄鸡12周龄体重显著相关。