LAMP-CRISPR/Cas12a技术在重症肺炎病原体检测中的应用

目的分析环介导恒温扩增技术(LAMP)联合CRISPR/Cas12a技术在的重症肺炎病原学检测中的应用效果。方法选取2019年1月至2023年6月青岛市胶州中心医院收治的147例重症肺炎患者作为研究对象,取患者支气管肺泡灌洗液或气管内抽吸物标本进行临床病原学检测、血清学检测及LAMP-CRISPR/Cas12a检测,观察3种方法检测结果,比较LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法与临床病原诊断结果、血清学检查结果一致性。结果147例患者共获得呼吸道标本147份,其中103份为泡灌洗液标本,44份为呼吸道深部痰液。临床病原学检测病原体标本100例,阳性率为68.03%。临床病原学检测结果具体为单一病原体感染85例,混合感染15例;未检测出病原体47例。147例患者中检测免疫球蛋白M抗体,共检出78例,阳性率为53.06%,其中细菌0例,非典型病原体32例,单一病毒感染32例,混合感染例14例,未检测出病原体69例。LAMP-CRISPR/Cas12a检测技术可快速检测重症肺炎病原体。LAMP-CRISPR/Cas12a检测中共检测出病原体标本117例,阳性率为79.59%,其中单纯细菌感染22例,非典型病原体26例,单纯病毒感染51例,混合感染18例,未检测出病原体30例。3种检测方法中,LAMP-CRISPR/Cas12a检测的阳性率最高,血清学检测的结果最低。且LAMP-CRISPR/Cas12a检测的阳性率(79.59%)高于临床病原学检测(68.03%)、血清学检测(53.06%),差异均有统计学意义(χ^(2)=5.085、23.164,P=0.024、<0.001)。在重症肺炎病原体检测中,LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法与临床病原诊断结果、血清学检查结果一致性均较高(Kappa均>0.75,P<0.05)。结论LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法在重症肺炎病原学诊断中的阳性率较高,尤其适用于细菌性重症肺炎与病毒性重症肺炎检测。

血清白细胞介素-35、乳酸脱氢酶在骨髓增生异常综合征120例中的临床意义

目的分析血清白细胞介素(IL)-35、乳酸脱氢酶(LDH)在骨髓增生异常综合征(MDS)中的临床意义,为探究MDS的潜在靶点提供参考依据。方法选取青岛市胶州中心医院2019年5月至2020年5月收治的128例MDS病人作为研究对象,所有病人均根据指南在医院接受个体化治疗,于治疗6个月疗程时评估病人治疗效果,分为治疗失败组(n=28)和治疗有效组(n=92)。于治疗前检测研究相关指标[白细胞(WBC)、血小板(PLT)、中性粒细胞绝对计数(ANC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)、IL-35、LDH]并统计病人临床资料,分析血清IL-35、LDH与MDS病人治疗效果的关系,并检验IL-35、LDH联合预测MDS病人治疗失败的最佳阈值。结果128例MDS病人随访期间共剔除8例,120例MDS病人,治疗6个疗程时,治疗失败占23.33%(28/120),治疗有效组占76.67%(92/120);治疗失败组WHO分型预后积分系统(WPSS)评分、修订的国际预后积分系统(IRSS-R)均高于治疗有效组,较高危病人占比多于治疗有效组(P<0.05);治疗失败组全血ANC,血浆Hb、PLT低于治疗有效组,血清IL-35、LDH表达量高于治疗有效组(P<0.05)。经logistics回归分析显示,MDS病人治疗失败与全血ANC,血浆Hb、PLT低表达,血清IL-35、LDH高表达有关(P<0.05)。绘制ROC曲线图发现,血清IL-35、LDH单独及联合预测MDS病人治疗失败风险截断值分别为129.70 ng/L、324.28 U/L。限制性立方样条分析显示,血清IL-35、LDH与MDS病人治疗失败风险呈线性剂量反应关系。结论血清IL-35、LDH水平与MDS病人治疗失败风险呈线性剂量反应关系,检测血清IL-35、LDH有助于预测MDS病人治疗失败风险。

应用CRISPR/Cas13b编辑技术治疗TNNT2R141W转基因小鼠的扩张型心肌病

应用CRISPR/Cas13b系统对TNNT2R141W转基因扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)小鼠进行探索性治疗,尝试发现治疗扩张型心肌病的一种新方式,为CRISPR/Cas13b系统在体内应用提供实验基础。随机设计11种Cas13b-TNNT2 gRNA并成功构建表达质粒,把它和人源TNNT2过表达质粒共同转染到293T细胞中,通过实时定量PCR(Q-PCR)检测人源TNNT2 mRNA的表达水平。结果显示,gRNA2引导Cas13b敲低目标基因的效率最高,达到80%(P<0.0001)。把gRNA2表达质粒包装到慢病毒载体中,转导出生后1 d的DCM小鼠原代心肌细胞。Q-PCR检测结果表明,CRISPR/Cas13b系统对人源TNNT2 mRNA敲低效率达到55%(P<0.01)。把PspCas13b和gRNA2的表达载体分别包装到AAV9病毒载体中,再将200μL约1×1012AAV9病毒颗粒通过尾静脉注射到4月龄DCM小鼠体内,待注射小鼠发育至5月龄时。Q-PCR检测结果显示,AAV9+DCM组TNNT2R141W表达水平较未注射组对照明显下降至40%(P<0.01)。对5月龄野生型(WT)、DCM(未注射病毒组)和AAV9+DCM(基因组编辑工具注射组)三组小鼠的心脏形态、心功能、心肌纤维化和心力衰竭等表型的观察结合显示:DCM小鼠的心血管形态异常,而AAV9+DCM小鼠心血管形态趋于正常。对3组小鼠的心脏进行超声心动图,并对心功能指标进行统计发现,DCM组较WT组小鼠的左心室射血分数(left ventricular percent ejection fraction,LV EF%)、左心室短轴缩短率(left ventricular percent fractional shortening,LV FS%)分别下降50.4%(P<0.0001),55.1%(P<0.0001),而AAV9+DCM组较DCM组小鼠的LV EF%、LV FS%分别上升66.5%(P<0.01),77.0%(P<0.01)。通过Q-PCR和天狼星红染色检测3组小鼠的心肌纤维化程度。结果显示,DCM组较WT组小鼠的Col3a1和Postn两种纤维化基因,分别高表达5.2倍(P<0.001)、4.5倍(P<0.01),而AAV9+DCM组较DCM组小鼠两种基因表达分别下降2.0倍(P<0.05)、1.4倍(NS)。天狼星红染色结果显示,纤维化区域明显下降;通过Q-PCR和蛋白质免疫印迹分别检测3组小鼠的心肌心力衰竭基因Nppb mRNA和Nppa蛋白质的表达水平。结果表明,DCM组较WT组小鼠Nppb mRNA表达上升14.2倍(P<0.01),而AAV9+DCM组较DCM组小鼠Nppb mRNA表达明显下降2.8倍(P<0.05),Nppa蛋白表达趋势与Nppb相同。把gRNA 5和含有R141W突变(gRNA 5T),以及正常的TNNT2 mRNA(gRNA 5V)序列分别组合转染到293T细胞中。通过Q-PCR检测两种序列mRNA的表达水平。结果显示,gRNA 5T序列表达效率为30%(P<0.0001),而并未检测到gRNA 5V mRNA的敲低。本研究通过设计靶向TNNT2R141WmRNA的gRNA,特异性敲低TNNT2R141W转基因小鼠体内突变的mRNA,有效改善了转基因小鼠的心功能,为临床进一步探索扩张型心肌病的治疗奠定了实验室基础。

实时荧光PCR检验对高危HPV检测的应用效果及准确度评价

讨论高危HPV检测中实施实时荧光PCR检验的临床效能。方法 入选52例疑似高危HPV感染患者主要于2022年1月-2023年4月接受病情诊疗,而后以其为研究对象开展回顾性试验分析。入选患者均接受PCR-反向点杂交法、HC-Ⅱ法、实时荧光PCR法检测HPV感染情况,以组织病理学检查结果作为诊断金标准,在此基础上判断以上三种检测方法诊断效能。结果 52例疑似高危HPV感染患者组织病理学检查结果显示:50例HPV感染阳性,占比为96.15%;2例HPV感染阴性,占比为3.85%。50例HPV感染阳性患者中宫颈上皮内瘤变Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级各占15例(30%)、13例(26%)、8例(16%),慢性宫颈炎共有13例(26%)。52例疑似高危HPV感染患者PCR-反向点杂交法下诊断敏感性、特异性、准确性依次为69.44%、50%、64%;52例疑似高危HPV感染患者HC-Ⅱ法下有72.22%诊断敏感性、有57.14%的诊断特异性、有68%的诊断准确性;52例疑似高危HPV感染患者实时荧光PCR法下诊断敏感性、特异性、准确性依次为97.22%、92.86%、96%性。PCR-反向点杂交法与HC-Ⅱ法诊断效能指标相互对比无统计学意义,P>0.05;对比PCR-反向点杂交法与HC-Ⅱ法,实时荧光PCR法诊断高危HPV感染效能指标明显较高,P<0.05。结论 高危HPV检测中实施PCR-反向点杂交法、HC-Ⅱ法、实时荧光PCR法下,以实时荧光PCR法诊断敏感性、特异性及准确性最高,可在临床中推广使用该检验方法。

开展外科患者手术前后心理护理的重要价值体会

通过本人在临床护理工作中,及早、准确地发现患者的心理问题,及时进行心理疏导,积极开展手术前后的心理护理,从而使患者能够树立信心,积极配合手术,最终能够尽早康复出院。体会如下。

CRISPR/Cas9与心血管疾病

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9(CRISPR-associated proteins)作为一种新型基因组编辑技术,为解释疾病的发生机制和治疗疾病提供了新方法。来自Ⅱ型原核CRISPR系统的CRISPR/Cas9能够通过单链向导RNA(single guide RNA, sgRNA)将Cas9核酸酶靶定到特定的基因组序列发挥作用。已经被成功用来进行基因编辑构建疾病模型,以进行相关领域的功能研究和疾病的治疗。CRISPR/Cas9技术正在迅速的应用于生物医学研究的各个领域,包括心血管领域,它促进了人们对电生理、心肌病、心律失常以及其他心血管疾病的更多了解,已经创建了靶向很多基因的细胞和动物模型,为新一类疗法打开了大门。本综述介绍了CRISPR/Cas9的作用原理、优点和局限性,以及在心血管疾病中的应用进展。

血脂动态变化对环磷酰胺联合糖皮质激素治疗特发性膜性肾病效果的影响

目的观察血脂动态变化对环磷酰胺联合糖皮质激素治疗特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)效果的影响。方法采用前瞻性队列研究,纳入医院2020年1月-2021年9月收治的106例IMN患者(最终有100例患者纳入研究)。全部患者给予环磷酰胺联合糖皮质激素治疗,于治疗前(T_(1))、治疗第1个月(T_(2))、第2个月(T_(3))、第3个月(T_(4))进行血脂检查。评估患者治疗效果,根据治疗效果分为良好组和不良组,比较2组各时间点的血脂变化、一般资料及其他实验室指标,分析IMN患者的血脂动态变化及其对患者治疗效果的影响。结果治疗6个月,100例患者中19例治疗无效,占19.00%;不良组患者血清补体C3、C4水平高于良好组,差异有统计学意义(P<0.05);组间其他资料比较,差异无统计学意义(P>0.05);T_(2)~T_(4)时,2组患者血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平较T_(1)逐渐降低,且组间、时点、2组间指标趋势变化差异有统计学意义(P<0.05);2组低密度脂蛋白、高密度脂蛋白略有波动,但组间、2组间指标趋势变化比较差异无统计学意义(P>0.05);不良组治疗期间血清TC、TG变化水平低于良好组,差异有统计学意义(P<0.05);经点二列相关系数检验,结果显示,IMN患者治疗效果与TC、TG水平变化呈负相关(r<0,P<0.05);经logistic回归分析结果显示,治疗期间TC、TG水平变化会影响IMN患者治疗效果(OR<1,P<0.05)。结论TC、TG动态变化会对IMN患者环磷酰胺联合糖皮质激素治疗效果产生影响,临床应加强IMN患者血脂管理。