动物性别控制研究的进展

１前言１．１自然性别比例的理论基础在自然条件下，哺乳动物性别的百分数比例基本保持５０：５０。对这一合理的性别比例也许至少可以从两个方面去理解。首先，从精子发生理论看，精子在生精管产生过程中，携带Ｘ染色体和Ｙ染色体的精子数目是相等的，这是精子细胞在减数...

创新驱动 整合发展——广西奶水牛产业技术体系创新团队建设历程回顾

为增强农业科技自主创新能力，保障我区粮食安全、农产品质量安全和农业可持续发展，广西于2010年3月启动了国家现代农业产业技术体系广西创新团队建设项目。水稻、甘蔗、桑蚕、奶水牛等四个产业被首批纳入该项目进行产业技术体系创新团队建设。广西奶水牛产业技术体系创新团队建设项目启动四年多来，在农业厅、财政厅和区水产畜牧兽医局及上级有关部门的正确领导下，经团队全体成员的积极努力，分工协作，整合资源，围绕产业发展需求，

猪胎儿肾脏成纤维细胞体外培养体系的建立

本研究旨在建立猪胎儿肾脏成纤维细胞体外培养体系,并探讨其作为猪体细胞克隆供体的可能性。使用组织块培养法从体长为10cm以上的猪胎儿分离得到猪胎儿肾脏成纤维细胞,绘制了生长曲线,鉴定了细胞类型并且进行了细胞周期同期化效果的研究。结果表明:该培养体系可以支持猪胎儿肾脏成纤维细胞的体外生长,单个细胞均为梭形细胞,抗波形蛋白免疫荧光染色显示为阳性,而抗角形蛋白免疫荧光染色为阴性,分离到的细胞为胎儿肾脏成纤维细胞。使用血清饥饿法和接触抑制法诱导细胞进入G0/G1期,并且分别比较两者同期化效率,结果显示:血清饥饿2d和4d的同期化效率差异不显著,但都比8d组的高(88.97%和87.69%比82.45%,P<0.05);接触抑制4d、6d组间同期化效率差异不显著,但都比0d组的高(85.56%和85.89%比81.82%,P<0.05)。本研究在国内首次分离得到猪胎儿肾脏成纤维细胞,已经在体外传代培养到32代,其同期化效果好,可以作为体细胞克隆供体。

使用流式细胞仪分离精子进行仔猪性别控制的研究

本研究旨在探索流式细胞仪分离精子在猪性别控制中的应用。使用流式细胞仪分离猪XY精子,而后通过母猪输卵管授精生产"预知"性别的仔猪,并使用吖啶橙染色法检测粗分离对精子核酸含量的影响。结果,成功利用分离获得的猪X和Y精子对母猪进行输卵管授精,母猪怀孕率、产仔率均为100%;输Y精子母猪产仔雄性率100%(♂6/6),对照母猪产仔雄性率57.14%(♂8/14);3头输X精子母猪产母仔率91.67%(♀11/12),对照母猪产雌性仔猪40%(♀2/5);使用性别分离精子不影响母猪的怀孕率、产仔率,但窝产仔数较低;吖啶橙染色法检测结果表明,流式细胞仪粗分离对猪精子核酸含量没有显著影响(P>0.05)。本研究结果提示,使用流式细胞仪分离精子授精可以有效改变仔猪的性别比例。本研究结果为猪分离精子性别控制技术的推广应用奠定了基础。

日粮不同硒水平对公猪繁殖及精浆营养生化参数的影响

选择年龄、体重、精液质量较一致、正在使用的健康壮年长白公猪5头,采用5×5正交拉丁方试验设计,在不同阶段分别饲喂含硒量为0.05mg·kg-1(处理1)、0.15mg·kg-1(处理2)、0.25mg·kg-1(处理3)、0.35mg·kg-1(处理4)、0.45mg·kg-1(处理5)日粮,研究硒对公猪繁殖参数、精浆生殖激素、精浆营养生化参数的影响。结果表明:(1)处理1公猪精子畸形率显著高于处理4公猪精子的畸形率(P<0.05);(2)处理4公猪精浆促卵泡生成素(FSH)、睾酮(T)的浓度显著高于处理1公猪精浆FSH、T的浓度(P<0.05);(3)处理4公猪精浆的谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活性显著高于处理1公猪精浆的GSHPx活性(P<0.05);(4)采精量、精子密度、精子活率、精液pH值、精浆促黄体生成素(LH)浓度、精浆尿素含量、精浆总蛋白含量,在不同处理条件下均没有显著的差异(P>0.05);(5)精子活率、精子畸形率、精浆FSH浓度、精浆LH浓度、精浆T浓度、精浆尿素的含量、精浆的GSHPx活性与日粮硒含量之间均存在着一定的规律性:即在一定范围内(0.35mg·kg-1),它们的变化随日粮硒含量的增加而增加或降低,超出该范围则降低或升高;(6)综合上述结果,长白公猪日粮硒含量以0.35mg·kg-1较为适当。

饲粮锌、硒和维生素E水平对经产母猪繁殖性能及相关参数的影响

选择年龄、体重、胎次、繁殖性能较一致的二元杂经产母猪 (长白×约克 ) 2 7头 ,采用 L9( 34 )正交表安排试验 ,共 9个试验组 ,每组 3个重复。饲粮锌、硒和维生素 E均设置 3个水平 :锌 4 5、85、12 5 m g/ kg;硒 0 .10、0 .2 5、0 .4 0 mg/ kg;维生素 E15、30、4 5 IU/ kg。研究了饲粮微量养分锌、硒和维生素 E对经产母猪相关参数的影响规律。结果表明 :( 1)饲粮中含锌量 85 mg/ kg、含硒量 0 .4 0 m g/ kg、含维生素 E量 4 5 IU / kg时 ,可以获得最多的窝产仔数 ( P<0 .10 ) ,分别为( 10 .3± 1.0 )头、( 10 .2± 1.2 )头、( 10 .3± 1.0 )头 ;母猪断奶返情时间间隔也最短 ( P<0 .0 5 )。 ( 2 )经产妊娠母猪血清雌激素浓度在妊娠期保持相对高水平 ;孕激素妊娠前期保持相对高水平 ,后期则保持相对低水平 ,是发挥母猪繁殖潜力的保证。 ( 3)经产母猪喂给含锌量 85 mg/ kg、含硒量 0 .4 0 mg/ kg、含维生素 E量 4 5 IU/ kg的饲粮时 ,血清总蛋白含量最高 ( P<0 .10 ) ,血清尿素浓度最低 ( P<0 .10 ) ,提示有更多的蛋白质在母体和胎儿累积。 ( 4 )血清 GSH- Px活力妊娠后期比妊娠前期低 ,提示妊娠后期比妊娠前期母体和胎儿代谢过程产生的过氧化物更多。综合所考察的参数显示 ,经产母猪饲粮中含锌 85 mg/ kg、

脱防冻剂方法对牛体外受精胚胎冷冻后成活率的影响

为了观察脱防冻剂方法对牛体外受精冷冻胚胎在体内、外发育率的影响，应用常规冷冻法在０．７５ｍｏｌ／Ｌ甘油＋０．５ｍｏｌ／Ｌ丙二醇溶液中冷冻受精后７、８ｄ的囊胚，解冻后在０．２５、０．５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖液中二步或在０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖液中三步脱防冻剂的胚胎孵化率（分别为６８．６％、６２．２％、６８．７％）与用ＰＢＳ／ＦＣＳ六步脱防冻剂的差异不显著（７０．４％，Ｐ＞０．０５），但在０．５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖液中三步脱防冻剂后，孵化率显著降低（４７．６％，Ｐ＜０．０１）。用０．２５ｍｏｌ／Ｌ或０．５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖或海藻糖预先使胚胎脱水后冷冻，解冻后可使胚胎直接在ＰＢＳ中一步脱掉防冻剂，胚胎孵化率（４５．０％～４９．５％）与在０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖液中二步脱防冻剂的相似（５１．５％，Ｐ＞０．０５）。移植试验表明，在０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖液中二步脱防冻剂获得的妊娠率与六步脱防冻剂相似，与在ＰＢＳ中一步脱防冻剂的亦无明显差异，但妊娠率均偏低（２１．４％～３７．５％）。

饲粮锌、硒和维生素E水平对初产母猪繁殖性能及相关参数的影响

为了研究饲粮微量元素锌、硒和维生素E对初产母猪相关参数的影响规律。本试验选择年龄、体况较一致的二元杂(长白×约克)初产母猪27头,采用L9(34)正交表安排试验,共9个试验组,每组3次重复。饲粮锌、硒和维生素E均设置3个水平,分别为:锌(45 0mg/kg、85 0mg/kg、125mg/kg);硒(0 10mg/kg、0 25mg/kg、0 40mg/kg);维生素E(15IU/kg、30IU/kg、45IU/kg),结果表明:(1)饲粮中含锌量125mg/kg、含硒量0 40mg/kg、含维生素E量45IU/kg时,可以获得最多的窝产活仔数,分别为(9 9±1 1)头,(9 9±1 4)头,(10 0±1 2)头;母猪断奶返情时间间隔也最短,分别为176 1h、174 2h、169 6h。(2)初产妊娠母猪血清雌激素浓度在妊娠期保持相对高水平;孕激素妊娠前期保持相对高水平,后期则保持相对低水平,是发挥母猪繁殖潜力的保证。(3)初产母猪喂给含锌量125mg/kg、含硒量0 40mg/kg、含维生素E量45IU/kg的饲粮时,血清尿素浓度最低,表示有更多的蛋白质在母体和胎儿累积。(4)血清GSH-Px活力妊娠后期比妊娠前期低,表示妊娠后期比妊娠前期母体和胎儿代谢过程产生的过氧化物更多。(5)综合所考察的参数显示,初产母猪饲粮中含锌125mg/kg、含硒0 40mg/kg、含维生素E45IU/kg是适宜的使用量。

广西巴马小型猪克隆胚的构建及胚胎移植

通过胚胎移植验证构建的广西巴马小型猪克隆胚是否可以发育到期。利用刺入式手术胚胎移植法,将0.5～1.5日龄巴马小型猪克隆胚移植到2头巴马小型猪和2头陆川猪的输卵管壶腹部。其中2头巴马小型猪和1头陆川猪返情,另外一头陆川猪于2007年10月13日产下1头克隆雄性巴马小型猪。说明巴马小型猪克隆胚能够在受体猪体内发育到期并产仔。

在成熟过程中添加牛血清和猪卵泡液对猪卵母细胞核成熟及体外受精后早期胚胎发育的影响

研究目的在于探讨在成熟过程中添加牛血清和猪卵泡液对猪卵母细胞核成熟、卵丘细胞扩散及体外受精后早期胚胎发育的影响。卵母细胞·卵丘细胞复合体在含FSH和LH的以下处理组的成熟液中成熟培养 2 3～ 2 4h :(1)对照组-改良TCM - 199+0 .1%PVA ;(2 )试验组 1-改良TCM - 199+10 %新生牛血清 ;(3)试验组 2 -改良TCM - 199+10 %猪卵泡液 ,再移至无FSH和LH的不同处理组的成熟液中成熟培养 2 3～ 34h。试验 1中 ,卵母细胞在 4 6～ 4 8h成熟培养后 ,观察卵丘细胞扩散情况 ,并对卵母细胞进行固定和染色 ,鉴定卵母细胞减数分裂情况 :试验 2中 ,对在不同处理组的成熟液中成熟培养 4 6～ 4 8h的卵母细胞进行体外受精 ,再培养 8d。受精后第 2天检查分裂率、第 6天检查桑椹胚 /囊胚率、第 8天检查囊胚率。 4 6～ 4 8h成熟培养后试验组 1和试验组 2的大部分卵母细胞 -卵丘细胞复合体的卵丘细胞完全扩散 ,而对照组的卵丘细胞只有 5 0 %扩散。试验组 1和试验组 2的卵母细胞核成熟率分别为 39.9% (77/ 193)和 4 4 .3% (93/ 2 10 ) ,与对照组的卵母细胞核成熟率 4 8.1% (99/ 2 0 6 )相比没有显著差异 (P <0 .0 5 )。卵母细胞分裂率试验组 1(5 0 .0± 1.8) %和试验组 2 (49.9± 2 .6 ) %与对照组的卵母细胞分裂率 (49.0±

大鼠生精细胞分离方法的研究

目的:建立一种简单、有效的哺乳动物睾丸生精细胞分离方法。方法:采用研磨-Percoll法、单一酶-研磨-Percoll法、组合酶法制备成熟期前大鼠睾丸生精细胞,分析比较其细胞总数、分离所需时间和细胞纯度,以及检测细胞培养前后的存活率。结果:组合酶法得到的睾丸生精细胞总数最多、分离所需时间最短;获得的细胞含杂质最少、细胞存活率最高;细胞培养48h后的存活率高,与其他两种分离方法比较有显著性差异(P<0.05)。结论:用组合酶法能在较短时间内获得数量较多的、比较纯化和存活率较高的生精细胞。

稀释液中卵黄浓度对猪精液冷冻保存效果的影响

为探索卵黄在猪精液冷冻中的应用效果,筛选出猪精液冷冻稀释液中卵黄的最佳浓度,分别在猪精液冷冻稀释液中添加不同比例(20%、25%、30%)的卵黄,并以精子活率、活力、路径速率(VAP)、轨迹速率(VCL)、直线运动速率(VSL)等为指标,对猪精液稀释后、平衡后和冷冻后3个阶段的精液质量进行比较分析。结果表明,将猪精液冷冻稀释液中卵黄的添加量提高5～10个百分点,其稀释后、平衡后及解冻后3个阶段精子的5个运动参数与常规添加量相比均无显著差异(P>0.05)。可见,提高猪精液冷冻稀释液中卵黄浓度未能显著改善猪精液冷冻后的质量,综合考虑,猪精液冷冻稀释液中卵黄浓度仍以20%(v/v)为宜。

不同渗透压及山梨醇浓度对猪体外受精卵早期发育的影响

探讨胚胎培养液中不同渗透压及山梨醇浓度对猪体外受精卵早期发育的影响。结果表明，用NaCl调节渗透压时，猪体外受精卵的囊胚率随着渗透压的升高而增加，当渗透压为320-335mOsm时囊胚率最高；而用山梨醇调节渗透压时，以1．8mg／mL山梨醇调节渗透压至270-285mOsm的效果较好；同一渗透压水平下，培养液中添加山梨醇与未添加的处理组间差异不显著。说明本研究条件下，适当提高胚胎培养液渗透压有利于猪体外受精卵的早期发育。

流式细胞仪分离精子法的研究进展

以X精子和Y精子的DNA含量差别为基础的流式细胞仪分离精子技术是有效的哺乳动物性别控制方法。目前,流式细胞仪分离精子的速度与上世纪90年代初期相比已提高了30多倍,以3000个/秒的常规速度分离X精子或Y精子的准确率可达到85%～90%。迄今,用分离精子人工授精已产下了数万头的动物后代,而分离人的精子也开始应用到了避免X染色体连锁遗传疾病的生殖医学工程中。

胰岛素和葡萄糖对水牛体外受精早期胚胎发育的影响

探讨了不同浓度的胰岛素和葡萄糖对水牛体外受精早期胚胎体外发育的影响。结果表明,添加胰岛素浓度为5μg/mL时,水牛早期胚胎的囊胚发育率、囊胚细胞数及冷冻-解冻后胚胎的孵化率都显著高于对照组及其他浓度组(P<0.05);加入葡萄糖的浓度大于6 mm o l/L时显著影响水牛早期胚胎发育到囊胚及孵化囊胚的阶段(P<0.05);联合添加胰岛素和葡萄糖时能显著提高水牛早期胚胎的孵化囊胚率、总囊胚率和囊胚细胞数(P<0.05)。实验证实,浓度为5μg/mL胰岛素能促进水牛体外受精早期胚胎的发育;在TCM-199中单独添加葡萄糖是不必要的,联合添加葡萄糖和胰岛素能促进水牛体外受精早期胚胎的发育。

饲粮锌对公猪繁殖及精浆营养生化参数的影响

选择年龄、体重、精液质量较一致的约克夏公猪 5头 ,采用 5× 5拉丁方试验设计 ,在不同阶段分别饲喂含锌量为4 5 (处理 1)、6 5 (处理 2 )、85 (处理 3)、10 5 (处理 4 )、12 5mg kg(处理 5 )饲粮 ,研究锌对公猪繁殖参数、精浆生殖激素、精浆营养生化参数的影响。结果表明 :⑴公猪精浆的FSH浓度处理 3显著高于处理 1和处理 5 (P <0 .0 5 )。⑵精浆的GSH-Px活力 ,处理 3、4显著高于处理 1、5 (P <0 .0 5 )。⑶采精量 ,精子密度 ,精子活率 ,精子畸形率 ,精浆LH、T浓度 ,精浆尿素浓度 ,精浆总蛋白含量 ,精液pH值等 ,在不同饲粮锌含量处理条件下没有显著的差异 (P >0 .0 5 )。⑷精子活率 ,精子畸形率 ,精浆FSH、LH、T浓度 ,精浆尿素含量 ,精浆的GSH -Px活力与饲粮锌含量之间均存在着一定的规律性 :即在一定范围内 (85mg kg) ,它们随饲粮锌水平的增加而增加或降低 ,超出该范围则降低或升高。⑸综合上述结果 ,约克夏公猪饲粮锌的含量以 85mg kg较为适当。

不同血清对常温和冷冻保存牛体外受精胚胎的影响

本研究探讨了不同血清对常温和冷冻保存牛体外受精胚胎的影响。常温 (2 0℃ )保存胚胎的试验结果表明 :用添加 1 5 %胎犊血清 (FCS)和 1 5 %阉公牛血清 (SS)保存的胚胎所获得的孵化率无显著差异(80 .5 %和 82 .6% ,P>0 .0 5 ) ,添加这两种血清与添加 0 .4%牛血清白蛋白 (BSA)和不添加血清的比 ,胚胎的孵化率有极显著的差异 (80 .5 % ,82 .6% ,63 .5 %和 61 .7% ,P<0 .0 1 )。冷冻胚胎的试验结果显示 :冷冻液中加有 1 5 % FCS、 1 5 % SS和 0 .4% BSA与不含血清的单纯磷酸缓冲液 (PBS)比 ,解冻后胚胎的孵化率有极显著的差异 (81 .5 % ,76% ,73 %和 60 .5 % ,P<0 .0 1 )。而这 3种血清之间 ,胚胎的孵化率无显著差异 (P>0 .0 5 )。由上述两个试验的结果说明 :廉价而又易采集的阉公牛血清 (SS)

猪精液冷冻保存程序的优化

研究共4个试验:①按入氮温度分为-5、-30、-60、-90、-120℃5个组;②按鲜精液预处理方式分为未预稀释和预稀释2个组;③按解冻温度设37、50、70℃3个组;④按稀释后精子密度分为1.25×108、2.50×108、5.00×108spz/mL 3个组。结果表明:①不同入氮温度下精子冻后活力差异不显著,但随着入氮温度的降低,精子冻后活力呈升高趋势;②预稀释不能显著提高平衡后精子活力,但可以显著或极显著提高精子稀释后活力、冻后活力、VAP、VSL及VCL等运动指标;③3种解冻温度在精子冻后活力、VAP、VSL、VCL等4个冻后运动指标上没有显著差异,但是,随着解冻温度的上升,冻后活力呈上升趋势;④3种稀释后精子密度在猪精子冻后活力、VAP、VSL上没有显著差异,但随着密度的上升,冻后精子活力及VAP呈下降趋势,而且最高密度组精子的VCL显著慢于其它两组。总之,5种入氮温度中,以-120℃组精子的冻后活力最高;预稀释对于新鲜猪精液的冷冻保存很有必要;3种解冻温度中,70℃组精子冻后活力最高;而高密度不利于猪精子的冷冻保存。

猪卵泡液和促性腺激素处理时间对猪卵母细胞体外成熟的影响

研究猪卵泡液(pFF)的浓度和促性腺激素(FSH和LH)处理时间对猪卵泡卵母细胞体外成熟的影响.结果表明,在猪卵丘细胞-卵母细胞复合体体外成熟培养46～48 h中的后23～24 h去除促性腺激素可有利于卵丘细胞的扩散,但对卵细胞的核成熟无显著影响(P>0.05);添加适量(10%)的pFF对猪卵母细胞体外成熟有一定的促进作用,但添加浓度太高则相对抑制卵子核成熟进程.