基于适配体-MOF模拟酶比色检测bPAG9

该研究基于金属有机框架Fe-MIL-101和双适配体夹心原理建立了一种比色检测牛妊娠相关糖蛋白9(bPAG9)的新方法。将生物素化适配体1固定在微孔板上作为捕获探针,Fe-MIL-101功能化的适配体2作为信号探针,当测试样品中含有bPAG9时,适配体1和适配体2与bPAG9结合,在固相载体表面形成双适配体夹心结构,随后适配体2偶联的Fe-MIL-101催化无色过氧化物酶底物产生比色输出信号,通过比色信号的变化即可实现对bPAG9的定性和定量分析。结果显示:在优化条件下,bPAG9在缓冲液中的线性检测范围为0.5~50 ng/mL(r=0.996),检出限为0.13 ng/mL。bPAG9在空白血清中的加标回收率为89.4%~104%,相对标准偏差小于10%。将该方法应用于人工受精28 d的奶牛血清检测,妊娠诊断结果显示,该法的诊断敏感性、特异性和准确率分别为92.5%、90.0%和91.5%。所建方法具有无创、简便、经济等特点,在奶牛早孕检测领域具有良好的应用前景。

影响羊供体超数排卵与受体移植受胎率的因素分析

为了研究影响羊供体超数排卵效果及胚胎移植受体受胎率的因素,试验选取萨福克羊和东弗里升羊2个供体品种,受体羊为本地阿勒泰羊,对促卵泡素(FSH)不同批次、长途运输应激因素、不同输精方式、技术员的熟练程度以及受体同期化时间差等5个方面的影响因素开展了相关研究。结果表明:FSH的不同批次对萨福克和东弗里升2种供体羊可用胚率无显著影响(P>0.05);长途运输组供体羊,无论是萨福克羊还是东弗里升羊,胚胎数和受胎率均极显著低于对照组(P<0.01);不同输精方式,子宫角+常规输精的获胚率极显著高于常规输精、子宫角输精(P<0.01),子宫角输精显著高于常规输精(P<0.05);胚胎移植操作熟练组受胎率显著高于对照组(P<0.05);受体羊撤栓时间不同,发情时间相差±12 h,两组受体羊受胎率均无显著差异(P>0.05)。本试验结果可为从事胚胎移植工作的科研工作者和技术员提供借鉴。

高产奶牛产后护理关键节点控制及对受胎率的影响

本试验旨在研究奶牛产后子宫复旧的生理变化规律,制定出一套产后护理技术程序,能够促进产后奶牛子宫复旧,缩短产后复旧时间和产犊间隔,提高高产奶牛的受胎率。本试验共分为4组,分别为奶牛产后监护组与自然恢复组、无抗治疗组与PGF2α治疗组、繁殖障碍监护组与对照组、妊娠检测直肠把握组与B超组。结果表明:(1)奶牛产后监护组的淘汰率显著低于自然恢复组,而妊娠率明显高于自然恢复组,且差异显著(P<0.05);(2)因乳品抗生素残留的存在,试验中采用了无抗组和激素处理组,产后奶牛的两种处理方法均取得较为理想的效果,但是两组之间的差异不显著(P>0.05);(3)将产后奶牛护理程序应用到大群试验中,监护群的受胎率为90.8%,极显著高于对照群(P<0.05)。(4)分别对复旧后的奶牛进行配种,在配种后30d和45d,采用B超法和直肠把握法进行妊娠检测,在30d时,两种妊娠检测方法差异显著(P<0.05),在45d时,两种妊娠检测方法之间没有差异性,都可以达到100%的妊娠检测准确性。综上所述,在本试验条件下,在奶牛产后的关键时间节点进行护理是十分必要的,可以达到早配种、早妊娠、缩短产犊间隔,增加高产奶牛养殖的经济效益和生态效益。

两种不同妊娠诊断方法在多胎萨福克肉羊上的应用

B型超声诊断作为羊妊娠诊断技术之一,广泛应用在羊输精后的30~45 d,妊娠诊断准确率能够达到生产应用的要求。本试验采用兽用直肠超声B超仪,对100只经子宫角内窥镜输精的肉羊进行妊娠检查,同时随机抽取40只经B超妊娠检查怀孕羊血液采用早孕诊断试剂进行妊娠检查,比较两种不同妊娠检查方法的效果。结果表明:子宫角内窥镜输精的肉羊30 d兽用直肠超声B超仪的准确率为100%,早孕诊断试剂妊娠检查准确率为93.05%。由以上数据可知,配种后30~45 d,使用B超进行早期妊娠诊断能够取得较高的准确率。早孕检测试剂盒作为新的妊娠诊断方法,虽然在准确性方面略低于B超妊娠诊断法,但该法以简便、节约劳力、速度快等优势也不失为一种羊的早期妊娠诊断的补充方法之一。

羊妊娠相关糖蛋白5的制备及生物信息学分析

旨在异源表达羊妊娠相关糖蛋白5(ovPAG5),并对其蛋白结构及功能进行预测分析,为ovPAG5抗体制备和羊早孕诊断技术的研发提供技术支撑。利用生物信息学方法对ovPAG5基因的编码序列进行密码子偏好性分析,根据宿主细胞HEK293的密码子偏好性对ovPAG5基因进行优化,全基因合成后构建重组表达载体pcDNA3.1(-)-ovPAG5,转染至HEK293细胞中诱导表达重组蛋白并纯化,进一步利用生物信息学软件对ovPAG5蛋白的结构及功能进行预测。结果显示,ovPAG5基因有效密码子数(NEC)和密码子适应指数(CAI)分别为51.91和0.78,表明该基因密码子选择偏性较弱。优化后ovPAG5基因密码子适用指数(CAI)由0.78提高到0.96,GC总含量由48%提高到57%,并成功合成优化的ovPAG5基因,大小与预期结果相符。重组质粒测序结果显示,其核苷酸序列与优化后基因完全一致,氨基酸未发生突变。表达的重组蛋白ovPAG5经SDS-PAGE和Western Blot鉴定分析,其相对分子质量约52 kDa。生物信息学预测分析结果显示,ovPAG5蛋白具有2个糖基化修饰位点、12个B细胞抗原表位以及31个氨基酸残基组成的信号肽。其二级结构由无规则卷曲(40.81%)、延伸链(31.74%)、α-螺旋(22.17%)和β转角(5.29%)组成。本研究为今后ovPAG5抗体的制备和羊早孕检测技术的研发奠定了基础。

进口萨福克冷冻胚胎移植及受体同期发情技术研究

为了丰富我国绵羊遗传资源,开展绵羊品种繁育和新品系培育工作,从澳大利亚引进纯种萨福克胚胎331枚。并对进口冷冻胚胎的质量、受体处理、技术员操作等因素对胚胎移植妊娠率的影响进行了应用研究。随机将受体羊分为4组,在相同的环境、饲养和管理条件下,采用舍饲加放牧的饲养模式开展相应的应用研究。结果表明,4组胚胎中A级胚胎占45%~47%,B级胚胎占35%~36%,C级胚胎占17%~19%;4组受体羊同期发情移植率分别为88.10%,82.83%,88.42%和83.49%;移植受胎率分别为58.10%,73.17%,48.81%和41.76%,平均受胎率为55.46%。从以上实验数据可以看出,在相同的饲养环境、胚胎质量、受体状态的条件下,技术人员的操作水平对受胎率产生极大的影响,差异极显著。本文对羊胚胎移植中的技术环节和水平进行试验和针对性的讨论,以期对该技术的生产应用提供参考。

双钢板内固定治疗SchatzkerⅤ、Ⅵ型胫骨平台骨折

目的探讨双钢板内固定治疗SchatzkerⅤ、Ⅵ型胫骨平台骨折的临床效果。方法对58例SchatzkerⅤ、Ⅵ型胫骨平台骨折患者行前外侧联合后内侧入路双钢板内固定治疗,根据术后关节功能评价手术治疗效果。结果 58例均获随访,时间6～32个月,患者均获骨性愈合。按照Merchant膝关节功能评价标准:优36例,良16例,可5例,差1例,优良率为89.7%。结论双钢板内固定可使SchatzkerⅤ、Ⅵ型胫骨平台骨折得到坚强固定,术后可行早期关节功能锻炼,临床疗效满意。

不同品种绵羊发情周期LEPRb mRNA表达分析

为了探讨LEPR在绵羊季节性发情中的表达特点,以季节性发情的中国美利奴和常年发情的多浪羊为研究对象,利用实时荧光定量PCR技术检测繁殖季节不同发情阶段LEPRb m RNA在下丘脑、卵巢和子宫组织中的表达变化。结果显示,在发情间期、前期和发情期中国美利奴卵巢和子宫组织LEPRb的相对表达水平都低于下丘脑,但在发情后期卵巢和子宫LEPRb的相对表达水平显著高于下丘脑。不同发情时期,两品种绵羊同一组织的LEPRb的表达变化幅度有所差异,但趋势相似。且中国美利奴各组织LEPRb的表达水平都高于常年发情的多浪羊。LEPRb的表达变化与绵羊发情存在相关关系。

椎间盘退变目的基因研究

椎间盘退变基因治疗旨在经转基因方法维持正常椎间盘细胞种群表型和数量,增强细胞合成蛋白聚糖、Ⅱ型胶原能力,从而延缓和逆转椎间盘退变。许多研究表明目的基因通过载体转染退变椎间盘髓核、纤维环细胞,能恢复细胞的生理功能。椎间盘退变基因治疗涉及目的基因、载体、靶细胞、转染方法和基因表达调控,该文就椎间盘退变基因治疗的目的基因和基因载体研究进展作一简要综述。

同期发情与腹腔镜输精技术在肉羊生产中的应用

以哈萨克母羊为试验动物,在繁殖和非繁殖季节采用“Y型孕酮阴道栓+PMSG”法对790只母羊进行同期发情和腹腔镜输精,结果表明,繁殖季节同期发情率(90%)显著高于非繁殖季节(58.64%),在受胎率方面,繁殖季节的情期受胎率(89.44%)显著高于非繁殖季节(72.54%)。

颈椎单开门椎管扩大成形术椎板开门角度对脊髓型颈椎病疗效的影响

目的:探讨椎板开门角度对颈椎单开门椎管扩大成形术(expansion of open-door laminoplasty)治疗脊髓型颈椎病疗效的影响。方法:选取我院2006年7月至2009年1月采用颈椎后路单开门椎管扩大成形术治疗并获得24个月以上随访的脊髓型颈椎病患者198例,男115例,女83例;年龄29～72岁,平均49±5岁。双节段39例(C3～C5 11例,C4～C6 28例);三个节段(C4～C7)97例,四个节段(C3～C7)62例。患者均有术前颈椎正侧位、双斜位和过度屈伸位X线平片和颈椎CT及MRI检查图片;术前JOA评分4～9分,平均6.3±2.9分。按照术后1周CT片上测量的椎板开门角度以30°为界限分为两组,统计两组手术时间、出血量、术后出现并发症病例、C2-C7 Cobb角度、颈椎前凸指数、颈椎活动度和脊髓后移数值,末次随访时评价患者神经功能情况,计算神经功能改善率。结果:开门角度>30°的患者共76例(A组);开门角度15°～30°的患者共122例(B组)。两组术前JOA评分、C2-C7 Cobb角度、颈椎前凸指数及颈椎活动度无显著性差异(P>0.05)。A组手术时间110±13min,出血量250±80ml;B组手术时间120±30min,出血量230±100ml,两组比较均无显著性差异(P>0.05)。术后A组51例(67.1%)出现轴性症状,8例(10.4%)发生C5神经根麻痹,1例(1.32%)颈椎轻度后凸畸形;B组37例(10.5%)出现轴性症状,3例(2.4%)发生C5神经根麻痹,4例(3.28%)发生关门,A组轴性症状和C5神经根麻痹的发生率高于B组,差异有显著性(P<0.05)。术后1个月脊髓后移值为0～7.95mm,平均2.41±0.46mm。末次随访时两组C2-C7 Cobb角度、颈椎前凸指数及颈椎活动度无显著性差异(P>0.05);JOA评分改善率A、B组分别为(72.1±11.7)%和(69.0±12.3)%,两组间比较无显著性差异(P>0.05)。结论:不同椎板开门角度术后神经功能改善率无显著性差异;将椎板开门角度控制在15°～30°轴性症状及C5神经根麻痹发生率较低,但应防止发生关门。

牛妊娠相关糖蛋白16(bPAG16)基因密码子优化及表达

【目的】对bPAG16基因进行优化和合成,构建proEM-bPAG16重组表达载体,将重组质粒转染至HEK293细胞中,获得bPAG16重组蛋白,为家畜早期妊娠诊断技术的研发提供技术支撑。【方法】通过生物学技术对bPAG16基因密码子进行优化和人工合成,经T4 DNA连接酶将bPAG16基因插入到proEM载体中,构建重组载体proEM-bPAG16,将其转染至HEK293细胞中进行瞬时表达,重组蛋白经Ni-IDA亲和柱纯化后,采用SDSPAGE、Western Blot检测其表达效果。【结果】优化后的bPAG16基因密码子适用指数(CAI)由原来的0.77提高到0.96,GC含量由48%提高到58%。重组载体proEM-bPAG16双酶切后分别获得1179 bp和4369 bp的2条片段,与预期值一致;重组质粒测序结果显示,其核苷酸序列与优化后基因完全一致,氨基酸未发生突变;SDS-PAGE和Western Blot鉴定结果显示,获得重组蛋白bPAG16(rbPAG16)相对分子质量约48 kDa,经Ni-IDA亲和层析纯化后,其纯度达到90%以上。【结论】通过密码子优化策略及重组蛋白技术高效表达了rbPAG16,为奶牛早孕快速检测技术的研发奠定了基础。

牛妊娠相关糖蛋白6基因密码子优化及其在HEK293细胞中的表达

[目的]解决天然牛妊娠相关糖蛋白(bPAG)不易分离纯化的问题,获得高效异源表达且具有良好免疫反应性的bPAG6,为国产bPAG检测产品的研发提供技术支持。[方法]根据宿主细胞对密码子的偏好性,利用MaxCodon^TM在不改变氨基酸序列的前提下,对bPAG6基因密码子进行优化,采用全基因合成技术扩增优化后的bPAG6基因,构建proEM-bPA G6重组载体,并转染至HEK293细胞中进行高效表达;然后通过SDS-PAGE电泳、Western blotting和ELISA检测重组蛋白的表达效果及免疫反应性,并利用在线生物信息学分析软件对重组蛋白的结构及功能进行预测。[结果]优化后bPAG6基因的密码子适用指数(CAI)由0.80提高到0.96,G+C含量由49.4%提高到58.8%,其蛋白编码区(CDS)长度为1137 bp,共编码379个氨基酸残基。将全基因合成技术扩增获得的bPAG6基因插入proEM载体构建proEM-bPA G6重组载体,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定可获得2条与预期结果相符的片段[proEM载体(4369 bp)和bPAG6基因(1176 bp)],测序结果也显示其碱基序列与优化后的bPAG6基因完全一致。proEM-bPA G6重组载体转染HEK293细胞表达获得的重组蛋白bPAG6分子量约46 kD。重组蛋白bPAG6可被抗bPAG6抗体识别,即具有良好的免疫反应性。重组蛋白bPAG6信号肽由N端的前15个氨基酸残基组成;存在5个N-糖基化位点,其N-糖基化修饰主要位于57Asn、73Asn、102Asn、124Asn和181Asn位点处;重组蛋白bPAG6为分泌性蛋白,无跨膜螺旋区,其二级结构由无规则卷曲(42.74%)、延伸链(31.93%)、α-螺旋(19.26%)和β-转角(6.07%)组成。[结论]通过基因优化及真核表达获得的重组蛋白bPAG6具有良好免疫反应性,可作为抗原应用于牛早期妊娠快速诊断产品的研发。

奶牛体外受精相关影响因素分析

[目的]探讨和研究奶牛体外受精(IVF)各技术环节中一些因素,对奶牛IVF整个过程的影响。[方法]研究不同来源的卵母细胞、精液的不同处理方法、不同的培养体系,不同受精时间,受精密度对奶牛IVF的影响。[结果]屠宰场采集的卵母细胞和活体采卵收集的卵母细胞的卵裂率和囊胚发育率差异不显著;对精子分别采用percoll梯度密度离心和上浮法处理,两组的卵裂率囊胚发育率无明显差异,用SOF液和BO液体外培养,两培养体系的卵裂率和囊胚发育率均差异不显著;受精时间为8、10 h及10、12 h的囊胚发育率均差异不显著,但受精8 h的囊胚发育率显著高于受精时间12 h;受精微滴(100μl)中放置成熟的卵母细胞数(20、40个),两组的卵裂率和囊胚发育率均下降,且差异显著。[结论]随受精时间的延长,卵裂率和囊胚发育率逐渐降低,差异不显著,但受精8 h的囊胚发育率显著高于受精12 h;受精微滴(100μl)中放置20个成熟的卵母细胞,可取得较好的体外受精效果。

萨福克和湖羊的杂交试验

本试验是利用湖羊的高产羔率和萨福克生长速度快的优势,进行羔羊肉的生产,以获得最佳的经济效益。3月龄,萨湖杂种的平均体重超过细毛羊和湖羊。到4月龄,萨湖杂种进入生长高峰,平均日增重为250.42g/d,分别比细毛羊、湖羊高33.03%、23.66%。

单开门椎板成形术联合椎间孔切开术治疗脊髓型合并神经根型颈椎病疗效分析

目的评价颈后路单开门椎管成形术联合椎间孔切开术在治疗颈椎管狭窄症合并单侧神经根型颈椎病中的作用。方法回顾性研究2006年7月至2009年1月44例颈椎管狭窄症合并单侧神经根压迫症状患者,行颈后路单开门椎管成形术联合椎间孔切开术治疗的23例患者为A组,单纯行颈后路单开门椎管成形术治疗的21例患者为B组。引起椎间孔狭窄的原因:椎间盘突出、钩椎关节骨赘形成、关节突增生。神经根症状主要表现为单侧上肢疼痛、感觉减退、肌力下降和反射减弱。A组手术为颈后路单开门椎管成形术联合椎间孔切开术,关节突内侧缘切除范围均小于等于50%;B组仅行颈后路单开门椎管成形术。结果术后随访20～36个月,平均28个月。采用日本骨科协会评分法计算两组髓性症状术后改善率,差异无统计学意义;根性症状术后临床效果评价:A组优18例,良3例,一般2例;B组优7例,良3例,一般9例,差2例。结论对合并有单侧神经根型的颈椎管狭窄症患者,采用颈后路单开门椎管成形术联合椎间孔切开术可取得良好的手术效果。

Leptin基因多态性与绵羊季节性发情的相关分析

根据leptin基因在GenBank中的已知序列设计两对引物,采用PCR-SSCP技术在常年发情的湖羊和季节性发情的阿勒泰羊群体中进行单核苷酸多态性(SNPs)检测,对筛查到的SNP位点进行基因型与绵羊季节性发情的关联分析。结果表明,与湖羊相比,阿勒泰羊leptin基因第1内含子上有3个连续碱基TTG的插入和C/T碱基突变;第3外显子3上发生G/T碱基突变,编码氨基酸由缬氨酸变成亮氨酸。Leptin外显子2扩增片段上检测到AA、AB、BB三种基因型,BB基因型在阿勒泰羊群体中属于优势基因型;对两个群体进行基因型频率独立性χ2检验,差异极显著(P<0.001),说明BB基因型是影响季节性发情的有利基因型。研究结果提示,绵羊品种中Leptin基因序列的差异性可能是造成绵羊季节性发情的原因之一,可作为常年发情绵羊品种选育的辅助标记。

肉用公羊和多胎母羊杂交后代不同营养水平育肥试验

利用高腿萨福克的生长发育优势和湖羊的多胎性进行杂交组合,对所产后代用不同的育肥标准分四组进行早期断奶育肥。经测定第一组的日增重为253.2g,第二组的日增重为266.3g,第三组的日增重为236.7g,第四组的日增重为237.6g,其中第二组的日增重与其他组差异极显著(P<0.01);各组的体尺变化也不同,生长发育快的组,体尺增加的也快。通过试验筛选出了育肥方法的最佳组,第二组的料肉比最佳,从而为合理进行羔羊舍饲育肥提供依据。

萨福克公羊早期利用的研究

采用萨福克与湖羊杂交的方式,与配湖羊第一次使用萨福克公羔(6月龄),结果受胎率为18%(配38只母羊,产羔6胎);第二次使用萨福克公羔年龄为7月龄,精液品质同6月龄相比较有所提高;第三次试验在萨福克公羔8月龄以后进行,结果显示8月龄后公羔的精液品质有明显提高,精液品质已接近正常,同时给80只湖羊进行人工授精,受胎60只,受胎率80%,精液质量和受胎率都有较大的提高,同6月龄和7月龄相比,受胎羊数及受胎率差异极显著(P<0.01),240天其平均日增重250g。