山羊精子结合和内化外源DNA的特征及影响因素

外源DNA与精子相互作用后的定位及内化率是精子载体法制备转基因动物的关键环节。实验以标记的DNA片段为示踪材料，就精子与外源DNA相互作用的基本特征及影响因素进行了研究。结果表明：山羊精子可自发性结合外源DNA，外源DNA最初结合于顶体后区质膜外表面，随后部分内化进入细胞内。精子对外源DNA的结合和内化能力随供体的不同而差异明显，在实验所检查的35只公羊中，结合率（DNaseⅠ消化前）波动于4．6％～62．4％，内化率（DNaseⅠ消化后）波动于2．1％～53．8％，个体间差异显著（P〈0．01）。对于同一供体的精子而言，阻止DNA结合的最主要因素是精浆，与射出的原精液相比，洗涤后精子的结合率和内化率分别提高了3倍和5倍；其次精子获能也将导致结合率和内化率降低（P〈0．01）。死精子不能完成外源DNA的内化过程，但反复冻融导致质膜破裂的死精子具有更高的结合率，而且阳性率与动物个体无关。上述结果提示，筛选合适的精子供体，采用优化的转染处理方法是提高精子载体方法效率的前提和保证。

来源于线虫Caenorhabditis briggssae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因的合成及其功能分析

ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3PUFAs)是一类被广泛研究和关注的脂肪酸,对人类及其他哺乳动物的正常发育和保持良好的健康状况极其重要,并且对于人类的多种疾病的预防和治疗亦有着明显的作用。在人和哺乳动物体内,ω-3PUFAs的含量与ω-6PUFAs(其代谢方式和功能与前者不同,通常其作用也相反)相比很低。而对于人体,无论ω-3PUFAs的过低还是ω-6PUFAs的过高都会带来极为不利的影响。所以人们一直在努力寻求提高人体中ω-3PUFAs含量的途径或者大量生产ω-3PUFAs的方法。本研究经过密码子优化后,用化学合成的方法获得了C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1,并构建了哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1-sFat1-EGFP,通过脂质体转染了CHO细胞系并对其进行抗性筛选获得稳定转染细胞株。对稳定转染sFat-1细胞株的RT-PCR分析及脂肪酸组成的GC-MS分析表明,sFat1基因完全能够在CHO细胞中表达和发挥其ω-3去饱和酶的作用,即促使ω-6系列不饱和脂肪酸转变为相应的ω-3系列不饱和脂肪酸(从十八碳到二十二碳)。ω-6不饱和脂肪酸总量从48.97%下降到35.29%,而ω-3不饱和脂肪酸总量则相应地从7.86%上升到24.02%。ω-6多不饱和脂肪酸和ω-3多不饱和脂肪酸的比值从正常细胞中的6.23下降到转染细胞中的1.47。这说明C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1的合成是成功的,试验所获得的结果为今后的进一步的研究或应用其大量生产ω-3PUFAs奠定了基础。

应用PCR-酶切连接法合成全长sFat1基因

人工合成基因在生命科学研究中有着重要的意义,因此基因合成是一项常用技术。长片段基因的合成比较困难,常常因为合成中碱基序列的错配、突变等原因而导致失败。研究者们所熟知的几种现行的方法仍然难以解决该问题。本研究在作者自身的工作经验中建立了一种新的基因合成方法,即PCR-酶切连接法。应用该方法成功地将化学合成的27个寡聚核苷酸片段(每个片段长60～68bp)拼接组装起来,获得了完整的总长为1226bp的基因sFat-1。整个过程仅采用3轮PCR(共7个反应)、2轮的酶切连接(3个反应),而且未曾出现任何偏离预期基因序列的差错。该方法步骤较少,技术简单,出错极少,是合成长基因序列很好的选择。

人尿激酶原突变体的构建及其特性的研究

由于人尿激酶原(pro_UK)存在凝血酶和纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI_1)的作用位点,在生产和治疗过程中容易失去活性。采用PCR介导的定点突变技术对pro_UK基因进行了突变,构建了3种人pro_UK突变体,分别将蛋白序列中的凝血酶作用位点Arg156突变成His156,构建成pro_UKM1;将PAI_1的作用位点Arg178、Arg179、Arg181突变为Lys178、Lys179、His181构建成pro_UKM2;同时将凝血酶和PAI_1的作用位点突变构建成pro_UKM3。分别在CHO细胞中获得稳定表达。并对3种突变体进行了SDS_PAGE纤维蛋白自显影和Westernblot分析,证明3种细胞表达的pro_UKM与天然尿激酶原带型一致,绝大多数为单链。体外溶栓试验表明,pro_UKM1对凝血酶有抵抗性,pro_UKM2对PAI有抵抗性,pro_Ukm3能有效抵抗凝血酶和PAI的活性抑制特别是pro_UKM3具有开发成新型溶血栓药物的潜力。

无血清培养基生产重组人红细胞生成素的纯化

用无血清培养基在生物反应器中培养CHO EPOC2细胞株 ,培养上清中重组人红细胞生成素表达水平达 1 0～ 2 1mg/L .培养上清经过三步纯化后纯度可达到 98%以上 ,比活性约为 1 5×1 0 5U/mg.纯化第一步使用反相柱层析 ,可将样品体积浓缩约 30倍 .取其收集液进行DEAE 离子交换柱层析 ,最后进行分子筛层析 ,全过程回收率为 4 0 %左右 .SDS PAGE表明 ,所制备终产品分子质量为 35～ 4 0ku ,等电聚焦方法测其等电点在 3 75～ 4 1 5之间 ,均属文献报道范围 ;ELISA和蛋白质印迹实验结果证明其具有天然红细胞生成素抗原性 ;采用溴化氰裂解方法做肽谱电泳 ,结果与理论推测相符 .该纯化路线简单、迅速、高效 ,重复性好 。

基于GPRS无线传感网的大气CO_2浓度采集系统研究与设计

针对实现大气中二氧化碳浓度的及时快速采集,设计了基于GPRS无线传感网的大气二氧化碳浓度采集系统,系统分为数据采集终端、GPRS无线传输网络和数据中心3部分。数据采集部分主要由单片机、高精度二氧化碳传感器、GPS模块、GPRS模块和液晶显示模块组成,负责采集二氧化碳浓度和采集点地理定位信息;无线传输网络部分由GPRS模块接入到GPRS网络,再登陆到Internet网络与检测中心服务器建立TCP网络连接,负责将采集到的数据传输给数据中心;数据中心主要是接受GPRS网路传输过来的数据,并将数据进行处理、显示和录入数据库。采集系统能摆脱数据采集时地理位置和天气条件上的局限性,使检测工作变得更及时方便准确。

用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素

家蚕核多角体病毒(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus.BmNPV)和家蚕细胞已成功地用来大量生产具有生物活性的重组蛋白。但是BmNPV的通用载体的类型较少。因此,本实验构建了BmNPV新型载体pBm92,该载体将多角体蛋白基因的起始密码ATG改变为ATT,然后在多角体蛋白基因的+12位外连接有5个外源基因的克隆位点。将HuIFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的+12位后,构建了pBmIFN+12;同时构建HuIFN-β克隆在-3位后的转移栽体pBmIFN-3。将两种转移载体DNA分别与BmNPV基因组DNA共转染Bm-N细胞。利用重组病毒不产生多角体蛋白的特征,筛选重组病毒。用HuIFN-β基因探针与重组病毒DNA进行杂交鉴定。重组病毒BmIFN+12感染Bm-N细胞,其上清IFN活性最高时可达2.0×10~6IU/ml,将BmIFN+12注射5龄家蚕虫体,表达水平为50×10~7IU/ml,是HuIFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的-3位后获得的重组病毒的表达量的2～4倍。家蚕体生产的rHulFN-β为糖基化蛋白具有天然HuIFN-β的抗原性。

染色质免疫沉淀法筛选转录因子Nanog调控的目的基因

目的:利用染色质免疫沉淀法筛选转录因子Nanog调控的目的基因。方法:用甲醛固定胚胎干细胞,利用超声将其染色质随机断裂成0.5～1.0kb的染色质片段,通过免疫沉淀富集与Nanog结合的DNA片段,回复交联后分离纯化DNA片段,最终用凝胶迁移阻滞实验验证Nanog与DNA片段的结合。结果:我们发现fzr为Nanog调控的目的基因,并通过电泳迁移率变动分析证明了二者的结合。结论:Fzr在细胞周期调控中发挥重要作用,这为阐明Nanog的作用机理奠定基础。

用三步法纯化重组人促红细胞生成素

在生物反应器中培养中国仓鼠卵巢细胞—促红细胞生成素(CHO-EPO)C2细胞株,培养上清液中重组人促红细胞生成素(rHuEPO)表达水平达2000～3000U/ml。培养上清经过三步纯化:第一步为反相柱色谱,可将样品浓缩约96.7％,其收集液经充分透析后进行第二步的DEAE-离子交换色谱,最后进行分子筛色谱,总回收率为30％以上,经纯化的rHuEPO比活性为1.5×10~8U/g蛋白,SDSPAGE一条带,扫描测试纯度达98％以上。

用三步法纯化重组人促红细胞生成素

用生物反应器培养中国仓鼠卵巢细胞促红细胞生成素（ＣＨＯＥＰＯ）Ｃ２细胞株，培养上清液中重组人促红细胞生成素（ｒＨｕＥＰＯ）表达水平达２×１０６～３×１０６Ｕ／Ｌ。培养上清液经过三步纯化：第一步为反相色谱，可将样品体积浓缩约９６．７％，其收集液经充分透析后进行第二步的ＤＥＡＥ离子交换色谱，最后进行分子筛色谱，总回收率为３０％以上。经纯化的ｒＨｕＥＰＯ比活性为１．５×１０８Ｕ／ｇ蛋白，ＳＤＳＰＡＧＥ为一条带，扫描测试纯度达９８％以上。

猪血清白蛋白基因的克隆及其5′端调控序列功能分析

目的:克隆猪血清白蛋白全基因并对其5′端调控序列的转录功能进行分析。方法:以GenBank公布的猪血清白蛋白基因启动子序列和cDNA序列为依据,设计并合成D123/D61和D81/D84两对引物,同时从猪肝中提取猪基因组DNA,并以此为模板PCR扩增猪血清白蛋白部分基因片段作为噬菌斑原位杂交探针,对猪λ噬菌体文库进行筛选。经过4轮杂交和PCR交替筛选,从噬菌体文库中共获得4个基因片段,并对这4个片段进行测序、拼接。以绿色荧光蛋白作为报告基因,对猪血清白蛋白启动子在HepG2细胞中的表达进行研究。结果:共获得包括调控区在内的猪血清白蛋白全基因序列约35kb(GenBank登录号:AY663543)。将其与人的血清白蛋白基因相比对,发现基因的同源性为53.8%,其中编码区同源性为82.3%。荧光显微镜下可见EGFP在HepG2细胞中的表达。结论:获得猪血清白蛋白全基因。猪血清白蛋白基因启动子在HepG2有转录起始功能。此项工作一方面为利用基因打靶从猪体内制备生产人血清白蛋白的研究奠定了良好基础,另一方面为利用白蛋白启动子研究外源基因在肝组织的特异性表达及进行基因治疗提供了资料。

用于生产rHuEPO的无血清培养基的研究

观察和筛选了适合工程细胞（Ｃ２细胞）生产重组人促红细胞生成素（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，ｒＨｕＥＰＯ）的无血清生产培养基（ＳＦＭ－ｐ）的添加成分。在ＤＭＥＭ∶Ｆ１２（１∶１）培养基中添加了Ｓｅ、乙醇胺、多种维生素、蛋白胨、胰岛素、转铁蛋白和一些细胞因子，构成了这种ＳＦＭ－ｐ。ＳＦＭ－ｐ不含牛血清白蛋白而能维持细胞生长和ｒＨｕＥＰＯ生产。在滚动瓶使用ＳＦＭ－ｐ，细胞的生长和ｒＨｕＥＰＯ的生产都与使用１％ＦＢＳ的培养基无明显区别；在填充床反应器上，用５％ＦＢＳ培养基培养Ｃ２细胞９ｄ后改换ＳＦＭ－ｐ，ＳＦＭ－ｐ能维持Ｃ２细胞在稳定生产状态下达２０ｄ。ｒＨｕＥＰＯ的产率达７１．０ｍｇ／（Ｌ·ｄ）。培养上清的ｒＨｕＥＰＯ最高含量达２８．４μｇ／ｍｌ，葡萄糖耗量达２１ｇ／（Ｌ·ｄ），细胞密度超过３．０×１０７细胞／ｍｌ。

人β－干扰素在杆状病毒载体与Sf细胞体系中的表达

采用苜蓿尺蠖核多角休病毒（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ，ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ中多角体蛋白基因启动子及其前后序列作为转移载体，将人β－干扰素（ＨｕＩＦＮ－β基因插入转移载体ｐＵＡｃ－５，构建成ｐＡｃ－ＩＦＮ－β载体。该质粒ＤＮＡ与野生型ＡｃＮＰＶＤＮＡ经ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ共转染秋粘虫（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）传代细胞（Ｓｆ９细胞），利用重组病毒不产生多角体蛋白的特征，进行病毒空斑筛选。用核酸杂交方法鉴定出携带ＨｕＩＦＮ－β基因的主组病毒。用重组病毒感染Ｓｆ９细胞，可表达ｒＨｕＩＦＮ－β。在１．０×１０￣６细胞／ｍｌ感染上清中测定ｒＨｕＩＦＮ－β最高活性为３．０×１０￣６ＩＵ／ｍｌ，抗天然ＨｕＩＦＮ－β抗体能完全中和ｒＨｕＩＦＮ－β的抗病毒活性。

TRIM基因家族一个新成员的克隆及功能研究

目的:克隆小鼠早期胚胎发育相关的新基因uTRIM,研究其胞内亚定位及功能。方法:通过数字差异显示搜索到可能和小鼠早期胚胎发育相关的新基因uTRIM,用RT-PCR方法从体外培养的小鼠囊胚中分离得到其全长cDNA;将其克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1中,在HEK293细胞内表达后确定uTRIM分子的亚细胞定位。用RNAi对其在胚胎发育早期的功能进行初步的研究。结果与结论:uTRIM基因只在胚胎发育早期和成体睾丸组织中表达,亚细胞定位显示该蛋白位于细胞质中。RNAi结果显示抑制uTRIM表达使小鼠受精卵体外发育速度加快,提示uTRIM参与早期胚胎发育的负调控。