手足口病多价疫苗研究进展

手足口病是5岁以下儿童的常见传染病,由多种肠道病毒感染引起,在中国和亚太其他地区出现过多次大规模流行。全球首支手足口病EV71单价灭活疫苗于2015年底在中国上市,缓解了部分疫情,目前尚无手足口病多价疫苗。本文就手足口病多价疫苗及其动物模型的研究进展做一综述。

浙江省天台县2011-2018年汉坦病毒基因型别和进化变异研究

目的研究2011-2018年肾综合征出血热(HFRS)国家监测点浙江省天台县汉坦病毒(HV)的基因型别和进化变异情况,了解天台县HV分子流行病学特点.方法将天台县2011-2018年HV抗原阳性的鼠肺标本超声后提取核酸,利用HV型特异性引物,应用巢式PCR对部分M片段进行扩增分型和序列测定,将天台县2011-2018年的HV序列与国内外其他已知的HV序列进行比较,以明确该地区的基因型别,分析病毒的进化变异情况.结果HV抗原阳性的67份鼠肺标本经型特异性引物巢式PCR扩增后31份标本为阳性,其中30份为汉滩病毒(HTNV)、1份为汉城病毒(SEOV),31份PCR阳性鼠肺均来自黑线姬鼠.31份巢式PCR阳性产物的部分M片段核苷酸序列有30株分布在HTNV单元群,1株分布在SEOV单元群.HTNV单元群中的天台T2018-130株与天台其余29株及国内外其他株同源性为84.8%~87.9%,差异较大,天台其余29株亲缘关系较近;SEOV发生群中的T2016-31株来自黑线姬鼠的鼠肺标本,与SEOV天台以往分离株ZT71株、ZT10株和浙江温州分离株Z37株在系统发生树上分布于同一或临近分支.结论浙江省天台县HV流行的主要型别HTNV基因表现出明显的地理聚集现象,但也存在着基因差异较大的变异株T2018-130株;同时从病毒基因序列分析证实SEOV T2016-31株存在于黑线姬鼠中,可能意味着在SEOV进化过程中病毒在宿主间发生了“溢出”现象.

浙江省1例携带白喉棒状杆菌病例的病原学特征

目的对浙江省1例携带白喉棒状杆菌病例进行病原学诊断。方法采集患者咽拭子、鼻咽拭子和支气管肺泡灌洗液标本各1份,进行白喉棒状杆菌分离培养、涂片染色鉴定、生化和蛋白鉴定以及样本核酸的白喉棒状杆菌toxA和toxB毒力基因检测。结果从患者的支气管肺泡灌洗液分离到1株白喉棒状杆菌,革兰染色呈阳性,菌体排列呈棒状,粗细不一;奈瑟染色见菌体一端或两端特异性异染颗粒;生化和蛋白鉴定均提示99.0%以上概率属白喉棒状杆菌;患者的采集样本和分离菌株的核酸白喉棒状杆菌toxA和toxB毒力基因检测结果均为阴性。结论本病例携带的白喉棒状杆菌为不带有毒素生物结构基因编码菌,该病例为无毒白喉棒状杆菌带菌者。

天台县汉坦病毒宿主动物调查及病毒分离结果

目的了解2011—2018年浙江省天台县汉坦病毒(HV)宿主动物的种群分布、带毒情况和病毒型别,为防制肾综合征出血热(HFRS)提供依据。方法在天台县HFRS监测点采用夹夜法捕获鼠形动物,对鼠种和鼠龄进行鉴定,分析当地鼠种构成和鼠密度。取鼠肺和鼠血,采用免疫荧光法检测HV抗原和抗体,HV抗原阳性鼠肺用HV S片段特异性引物进行RT-PCR核酸检测,并进行分离病毒和鉴定型别。结果 2011—2018年天台县平均鼠密度为4.44%,野外鼠密度为4.94%,居民区鼠密度为2.23%。捕获鼠形动物10种,野鼠优势鼠种为黑线姬鼠,家鼠优势鼠种为褐家鼠。鼠肺HV抗原阳性67份,阳性率为4.13%,其中1份来自褐家鼠,其他66份均来自黑线姬鼠;鼠血抗体阳性79份,阳性率为4.86%,均来自黑线姬鼠。67份HV抗原阳性鼠肺标本经RT-PCR扩增后,阳性34份,阳性率为50.75%。分离到22株HV,其中汉滩型(HTN) 21株,汉城型(SEO) 1株,均分离自黑线姬鼠。结论天台县存在以黑线姬鼠为主要传染源的HFRS疫源地,主要流行型别为HTN型,同时首次在天台县发现黑线姬鼠携带SEO型病毒。

伯氏疏螺旋体外膜蛋白OspC和鞭毛蛋白FlaB多克隆抗体的制备和免疫原性研究

目的对伯氏疏螺旋体(又称莱姆病螺旋体,Borrelia burgdorferi)外膜蛋白OspC和鞭毛蛋白FlaB原核表达后,制备多克隆抗体并进一步进行免疫原性检测。方法以伯氏疏螺旋体BgNMJW1基因组DNA为模板,PCR扩增出外膜蛋白OspC和鞭毛蛋白FlaB的基因片段,克隆入表达载体pGEX-6p-1,转入表达菌株Rosetta,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生融合蛋白,并经谷胱甘肽转移酶柱蛋白纯化或割胶纯化。纯化后的蛋白用于免疫新西兰大白兔得到多克隆抗血清。结果经聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,经过诱导的携带目的基因载体,与对照相比,有明显的目的蛋白表达,大小分别约为49×103和63×103,诱导结果表明,在细菌培养至吸光度(A)值为0.4时,加入1 mmol/L的IPTG,在25℃下,诱导10 h,此时产生的蛋白表达量较大。将融合表达产生的蛋白纯化后免疫新西兰大白兔得到多克隆抗血清,应用抗血清对B.garinii和B.burgdorferi 2种基因型的伯氏疏螺旋体代表菌株(BgNMJW1和BbB31A3)的OspC和FlaB进行蛋白免疫印迹检测,可得到清晰检测条带。结论OspC和FlaB的联合应用可对莱姆病的诊断起到有效作用。

CV-A16对长爪沙鼠肌肉细胞的杀伤机理研究

目的研究柯萨奇病毒A组16型(CV-A16)对沙鼠原代肌肉细胞的杀伤机理,为阐明CV-A16的致病机理及沙鼠模型的进一步应用提供依据。方法采用胰蛋白酶/胶原酶双酶法构建沙鼠原代肌肉细胞模型,用不同感染剂量CV-A16感染细胞24h,采用CCK-8法检测细胞存活率,Hoechst 33258染色法检测细胞染色质变化,Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡比例,蛋白免疫印迹法检测Caspases家族蛋白、NF-κB通路相关蛋白及JNK激酶表达。结果感染复数(MOI)=0.50和1.00组细胞存活率分别为88.95%和64.05%,与阴性对照组(100.00%)比较,差异均有统计学意义(P<0.05),细胞存活率与MOI呈负相关(rs=-0.857,P=0.014);MOI=0.01、0.10和1.00组细胞凋亡比例分别为7.2%、21.8%和50.7%,细胞凋亡比例与MOI呈正相关(rs=1.000,P<0.001)。CV-A16感染后,Caspase-3和Caspase-8蛋白均被剪切激活,NF-κB通路相关蛋白IκBα、p65和p-p65表达均减少,JNK蛋白磷酸化水平增加。结论 CV-A16可能通过抑制NF-κB通路和激活JNK激酶诱导沙鼠原代肌肉细胞凋亡。

肠道病毒71型诱导沙鼠肌肉细胞凋亡及其机理研究

目的研究肠道病毒71型(EV71)杀伤沙鼠原代肌肉细胞的作用机理,为EV71的感染机制研究提供依据。方法采用胰酶/胶原酶消化法分离培养沙鼠原代肌肉细胞,滴加EV71感染细胞,采用CCK-8法检测感染细胞存活率,Hoechst 33258染色法检测感染细胞核变化,Annexin V/PI双染法检测感染细胞的细胞膜变化,蛋白免疫印迹试验检测感染细胞的PARP-1、Caspase-3、Bcl-2家族蛋白等凋亡因子和NF-κB通路相关蛋白表达量的变化。结果构建体外沙鼠原代肌肉细胞模型,使其感染EV71后,肌肉细胞出现皱缩、变圆、漂浮等形态学变化,且感染复数(MOI)越大,病变程度越明显,细胞存活率越低(rs=-0.964,P=0.005);细胞内染色质发生浓缩,细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻,伴随凋亡小体出现,细胞凋亡与MOI呈正相关(rs=1.000,P<0.001);凋亡标志蛋白PARP-1与凋亡执行蛋白Caspase-3被剪切激活;抑凋亡蛋白Bcl-xl与Bcl-2的表达量随着MOI的增大而减少;p65蛋白表达水平降低,磷酸化水平升高,NF-κB通路被激活。结论 EV71病毒可以诱导沙鼠原代肌肉细胞发生凋亡。