羧肽酶A1全酶及其肽段基因的克隆及分泌表达

目的:克隆人羧肽酶A1(CPA1)全酶及其4条肽段基因,构建重组表达载体,并在COS-7细胞中分泌表达.方法:以胰腺总RNA为模板,RT-PCR扩增CPA1全酶基因;再以全酶基因为模板,PCR扩增其4条肽段基因;扩增产物分别克隆于分泌表达载体pFLAG-CMV-1中构建重组载体;然后用脂质体转染COS-7细胞,分泌表达融合FLAG-tag的目的蛋白和肽段;点印迹法检测目的蛋白的表达.结果:获得了CPA1全酶及其4条肽段基因,构建了重组表达载体,测序证实插入序列正确,并在COS-7细胞中成功分泌表达了融合FLAG-tag的目的蛋白和肽段.结论:在COS-7细胞成功分泌表达了融合FLAG-tag的CPA1全酶及其4条肽段,为下一步酶活性测定奠定了基础.

羧肽酶A1全酶及其肽段的分泌表达及活性测定

抗体导向酶一前体药物疗法（antibody—directed enzyme prodrug therapy，ADEPT）自1987年由Bagshawe等提出以来，其研究受到广泛关注。目前，构建抗体一酶融合蛋白及其应用已成为研究热点。我们在用人羧肽酶A1（carboxypeptidase A1，CPA1）系统对前列腺癌ADEPT疗法的研究中发现CPA1分子量大，在临床试验研究操作中存在一定困难。我们拟通过在活性中心两侧扩展片段的方法来提高酶活性，克隆并分泌表达CPA1全酶及其包括活性中心在内的4条肽段，并对其活性进行测定。

肿瘤靶向治疗活性人羧肽酶A1最适片段的分析和克隆

目的:获得肿瘤靶向治疗用活性人羧肽酶A1(hCPA1)的最适片段。方法:计算机分析hCPA1活性相关氨基酸,PCR扩增选择最适基因片段,克隆入PQE-80载体,转化Rosetta gami2(DE3)进行表达,与hCPA1活性中心片段比较酶活性。结果:PCR成功扩增了hCPA1活性中心和hCPA1活性短片段基因,酶切鉴定和测序均证实重组表达载体构建成功,表达的蛋白以SDS-PAGE分析,分别在约25×103和20×103处出现新生蛋白条带,蛋白质印迹法实验证实了新生蛋白为目的蛋白。Hippuryl-L-Phenylalanin(H-L-P)实验显示两者均具有羧肽酶活性,且hCPA1活性短片段的活性与活性中心相当。MTT和细胞凋亡实验结果表明两者均能有效地水解前体药物MTX-α-Phe,抑制前列腺癌细胞株PC-3增殖,促进PC-3细胞凋亡。结论:成功克隆和表达了人hCPA1活性短片段基因和hCPA1活性中心,获得相对分子质量小而具有相似活性的hCPA1蛋白,为进一步将其应用于前列腺癌的ADEPT导向治疗创造了条件。

扩张器在修复瘢痕性秃发中的应用

目的探讨扩张器在头部瘢痕性秃发治疗中的应用效果。方法自2011年7月至2015年9月,应用扩张器扩张头皮修复23例瘢痕性秃发患者。一期手术:根据患者的秃发面积、部位及邻近区域毛发生长情况选择扩张器的容量及数量,将其埋置在秃发区周边正常毛发分布区,术后扩张器内注入生理盐水达到额定量。二期手术:切除瘢痕性秃发区皮肤组织,利用扩张的皮肤设计皮瓣来修复瘢痕切除后的创面。结果 18例患者经1次埋置1个或多个扩张器后,一次性修复瘢痕性秃发;5例患者因秃发面积较大经2次埋置扩张器后修复秃发区。扩张皮瓣易成活,切口瘢痕不明显,毛发分布均匀,密度可。结论采用扩张器修复大面积瘢痕性秃发,术后并发症较少,毛发分布均匀,生长良好,是修复较大面积瘢痕性秃发较理想的方法 。