MTB Hsp16.3重组蛋白通过Fractalkine/CX3CR1信号轴调控小鼠肺泡巨噬细胞M2型极化

目的初步探讨Fractalkine/CX3CR1信号轴在MTB Hsp16.3重组蛋白诱导小鼠肺泡巨噬细胞向M2型极化中的作用及机制。方法提取小鼠肺泡巨噬细胞,观察细胞形态后用其特异性标志CD68鉴定;MTB Hsp16.3(100 ng/mL)刺激肺泡巨噬细胞后,采用Real-time qPCR检测TNF-α、Arg-1等极化相关分子mRNA表达水平,Western blot检测Fractalkine、CX3CR1的表达情况。用慢病毒干扰肺泡巨噬细胞CX3CR1的表达后,荧光显微镜观察病毒感染情况;流式细胞术检测感染效率;Real-time qPCR和Western blot检测感染前后肺泡巨噬细胞CX3CR1的表达情况。采用MTB Hsp16.3刺激慢病毒感染过的肺泡巨噬细胞,Real-time qPCR检测各组极化相关分子mRNA表达水平;Western blot检测CD206、Arg-1的蛋白表达情况。利用Western blot检测各组中JNK、p38、ERK的磷酸化水平。结果显微镜下观察发现新分离的肺泡巨噬细胞为圆形,大小不等,约2 h后贴壁较牢,24 h后,肺泡巨噬细胞呈圆形、梭形等多种形态,且胞体更大,通过CD68鉴定为肺泡巨噬细胞;经MTB Hsp16.3处理后巨噬细胞TGF-β、IL-10、Arg-1、Fizz1的mRNA水平明显增高(P<0.05),巨噬细胞表面Fractalkine、CX3CR1的表达增高(P<0.05),与JNK、p38的磷酸化水平升高(P<0.05)相关。干扰肺泡巨噬细胞CX3CR1的表达后,慢病毒感染效率在72 h达到最高峰,并且可降低巨噬细胞表面CX3CR1的表达。经MTB Hsp16.3刺激慢病毒感染过的肺泡巨噬细胞发现,TGF-β、IL-10、Arg-1、Fizz1 mRNA水平降低(P<0.05),CD206、Arg-1的表达水平降低(P<0.05),与JNK、p38磷酸化水平被抑制(P<0.05)相关。结论Fractalkine/CX3CR1信号轴可能参与调控MTB Hsp16.3重组蛋白诱导的肺泡巨噬细胞M2型极化,并且可能通过激活JNK、p38的磷酸化水平发挥作用。

结核分枝杆菌H37Ra热休克蛋白16.3敲除菌株对小鼠骨髓来源巨噬细胞炎性细胞因子表达及趋化功能的影响

目的初步探讨结核分枝杆菌H37Ra热休克蛋白16.3敲除菌株对小鼠骨髓来源巨噬细胞炎性细胞因子表达及趋化功能的影响。方法从BALB/c小鼠胫腓骨中提取骨髓细胞,与GM-CSF共培养获得骨髓来源的巨噬细胞,流式细胞术检测巨噬细胞表面F4/80和CD11b的表达;分别用H37Ra野生型菌株(WT)、H37Ra热休克蛋白16.3回补菌株(COMP)、H37Ra热休克蛋白16.3敲除菌株(MUT)感染小鼠骨髓来源巨噬细胞,Real-time PCR检测巨噬细胞炎性细胞因子TNF-α、IL-6和iNOS以及趋化因子CCL2、CCL3、CCL4、CCL5和CCL12 mRNA的相对表达水平;ELISA以及Western blot检测TNF-α、IL-6和iNOS的表达水平;Transwell实验检测巨噬细胞的趋化功能;流式细胞术检测F4/80^(+)CCR1^(+)、F4/80^(+)CCR2^(+)和F4/80^(+)CCR5^(+)的细胞数量。结果F4/80^(+)CD11b^(+)的细胞数量占比为97.8%,提示小鼠骨髓来源巨噬细胞诱导成功;相较于WT和COMP菌株感染组,在感染巨噬细胞3 h后MUT感染组CCL2、CCL3、CCL4、CCL5和CCL12 mRNA的相对表达水平上调,继续感染24 h,相较于WT和COMP菌株感染组,MUT菌株感染组TNF-α和IL-6mRNA的相对表达水平更高,各感染组间iNOS mRNA的相对表达水平没有差异,而在感染48 h后,各感染组间TNF-α和IL-6mRNA的相对表达水平没有差异,MUT菌株感染组相较于WT和COMP菌株感染组iNOSmRNA的相对表达水平更低;ELISA结果显示TNF-α和IL-6的分泌水平在各感染组间没有差异;Western blot结果显示iNOS的表达在各感染组间也没有明显差异;Transwell实验结果显示,MUT感染组能够趋化更多数量的巨噬细胞至下室;流式结果显示,各感染组间F4/80^(+)CCR1^(+)的细胞数量没有差异,MUT菌株感染组F4/80^(+)CCR2^(+)和F4/80^(+)CCR5^(+)的细胞数量相较于WT和COMP菌株感染组明显上调。结论MTB Hsp16.3能在基因表达水平调控小鼠骨髓来源巨噬细胞炎性细胞因子TNF-α、IL-6和iNOS的表达且可能通过CCL3、CCL4、CCL5/CCR5和CCL2、CCL12/CCR2抑制小鼠骨髓来源巨噬细胞的趋化功能。

猫爪草醇类提取物对小鼠骨髓来源巨噬细胞极化的影响

目的探讨猫爪草(RTR)醇类提取物对于小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)极化的影响。方法提取6~8周BALB/c雌鼠骨髓细胞,用DMEM完全培养基(含有20 ng/mL GM-CSF)培养7 d诱导为BMDM。用CCK8摸索RTR刺激巨噬细胞的最适浓度,并观察巨噬细胞的形态变化。ELISA检测细胞培养液中iNOS、TGF-β、TNF-α、IL-10的变化;qRT-PCR检测细胞内的IL-6、TNF-α、iNOS、TGF-β、IL-10、Arg-1的表达;FCM检测细胞表面标志物NOS2和CD206的表达。结果RTR刺激BMDM的最佳浓度为100μg/mL,刺激24 h后呈梭形改变。RTR处理组与对照组相比,TNF-α和iNOS分泌水平升高,TNF-α、iNOS和IL-6的mRNA表达水平升高(P<0.05);TGF-β和IL-10分泌水平降低,TGF-β、IL-10和Arg-1的mRNA表达水平降低(P<0.05);刺激36 h后,巨噬细胞表面高表达NOS2,CD206低表达(P<0.05)。结论猫爪草醇类提取物可刺激小鼠骨髓来源巨噬细胞产生M1型极化。

MTB Hsp60重组蛋白对巨噬细胞趋化功能的影响

目的研究结核分枝杆菌H37Rv重组热休克蛋白60(Heat shock protein 60 of Mycobacterium tuberculosis,MTB Hsp60)对巨噬细胞(RAW264.7)趋化功能的影响。方法MTB Hsp60重组蛋白(100 ng/mL)刺激巨噬细胞24 h后,采用实时荧光定量PCR检测下列趋化因子如单核细胞趋化蛋白1(Monocyte chemotactic protein-1,MCP-1,CCL2)、巨噬细胞炎症蛋白1α(Macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α,CCL3)、巨噬细胞炎症蛋白1β(Macrophage inflammatory protein-1β,MIP-1β,CCL4)、调节活化正常T细胞表达与分泌的趋化因子(Regulation of Activation,Expression and Secretion by Normal T Cells,RANTES,CCL5)和单核细胞趋化蛋白5(Monocyte chemotactic protein-5,MCP-5,CCL12)的mRNA表达;ELISA法检测细胞培养上清液中趋化因子CCL2、CCL3、CCL4、CCL5和CCL12的分泌水平;Western bolt检测巨噬细胞表面趋化因子受体CC基序趋化因子受体1(C-C motif chemokine receptor 1,CCR1)、CCR2和CCR5的蛋白表达;流式细胞术检测表达趋化因子受体CCR1、CCR2、CCR5的巨噬细胞;Transwell实验检测巨噬细胞的趋化功能。结果100 ng/mL MTB Hsp60重组蛋白刺激巨噬细胞24 h后,其趋化因子CCL2、CCL3、CCL4及CCL12的mRNA表达水平无明显差异,但CCL5的mRNA水平显著上调(P<0.05);巨噬细胞表面主要的趋化因子受体CCR1、CCR2蛋白表达水平显著增高(P<0.05),而其表面CCR5蛋白的变化不明显;流式细胞术检测结果显示,与未处理组相比,处理组中CCR1^(+)、CCR2^(+)巨噬细胞数量明显增加(P<0.05),而CCR5^(+)巨噬细胞数量无明显差异;Transwell实验表明,经过MTB Hsp60重组蛋白处理后的巨噬细胞有更明显的被募集的趋势(P<0.05);而上清液中趋化因子CCL2、CCL3、CCL4、CCL5及CCL12的释放水平无明显变化。结论MTB Hsp60重组蛋白能上调巨噬细胞中趋化因子CCL5的mRNA表达水平,能增加巨噬细胞表面趋化因子受体CCR1和CCR2的表达,并且能增强巨噬细胞的趋化功能。

NLRP3炎症小体在感染性疾病中的作用研究进展

核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(Nucleotide-bindingoligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)是一类存在于胞浆中的大分子蛋白复合物,作为炎症反应的核心,能够感知外源性病原体和内源性危险信号,在多种感染性疾病的发生发展中发挥重要作用。因此,本文对NLRP3炎症小体的激活机制以及NLRP3炎症小体在感染性疾病中的研究进展予以综述,旨在为感染性疾病的治疗提供新的靶点。

防御素在抗结核分枝杆菌感染中的作用机制研究进展

防御素是广泛分布于生物界的一类富含半胱氨酸的内源性阳离子抗菌肽,在抵抗病原微生物入侵及调节机体免疫功能等方面发挥重要作用。研究发现,防御素对细菌、真菌或病毒等均具有杀灭作用,其在抗结核分枝杆菌感染中也展现出突出优势。防御素独特的抗菌机理可以破坏结核分枝杆菌的细胞壁、细胞膜等生物学结构,从而抑制结核分枝杆菌。本文对防御素的分子结构、生物学作用、抗结核作用及机制予以综述。