莲藕多酚氧化酶互作蛋白的筛选及验证

【目的】以中国莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)的多酚氧化酶家族成员之一NnPPO1(GenBank:ADC92563.1)为研究对象,筛选、验证与其互作的蛋白,为深入研究莲藕PPO的分子作用机制、精准抑制其活性奠定基础。【方法】利用酵母双杂交(Y2H)技术,验证莲藕抗氧化酶是否与NnPPO1存在互作关系。通过转化酵母试验检测互作蛋白过氧化氢酶同工酶NnCAT1(GenBank:XP_010242894.1)的毒性和自激活活性。构建双分子荧光标记试验(BiFC)所用的35S-NnPPO1-SPYNER173、35S-NnCAT1-SPYCEM表达载体,通过农杆菌介导法,将重组质粒转化烟草,进一步验证NnPPO1与NnCAT1之间的互作关系。根据NnPPO1和NnCAT1的结构域截短蛋白,寻找互作关键结构域。利用PlantCARE分析NnPPO1与NnCAT1启动子相关作用元件,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析NnPPO1与NnCAT1在莲藕不同组织中的表达水平。采用同源重组的方法构建35S-NnCAT1-GFP融合蛋白表达载体,用于亚细胞定位分析。运用DNAMAN软件对NnCAT1序列和其他物种序列进行多序列比对。运用生物信息学网站对NnCAT1进行理化性质与结构分析。【结果】NnCAT1与NnPPO1存在蛋白互作,且NnCAT1蛋白无自激活作用,对酵母菌株也没有毒性。在细胞膜和细胞核上观察到黄色荧光信号,进一步证实NnPPO1与NnCAT1之间存在互作。NnPPO1的酪氨酸酶结构域在蛋白互作中发挥主要作用。NnPPO1与NnCAT1启动子序列上存在多种顺式调控元件,如光响应元件Box 4、GT1-motif、TCT-motif,逆境响应元件ARE以及激素响应元件CGTCA-motif、TGACG-motif等。NnPPO1与NnCAT1的表达模式基本相同,在各组织中均有表达,均在叶中表达量最高,在茎尖中表达量最低。亚细胞定位结果显示NnCAT1定位于细胞膜和细胞核中。莲藕NnCAT1的相对分子质量约为57.0 kD,理论等电点(PI)为6.93;该蛋白为同源四聚体亲水性蛋白质;无跨膜结构和信号肽,存在叶绿体转运肽,前21 aa为转运肽区域;二级结构由27.64%的α-螺旋、15.65%延长链、6.30%β-转角和50.41%无规则卷曲构成。【结论】筛选出NnCAT1与NnPPO1之间存在蛋白互作,用BiFC进一步证实两者互作的真实性,NnPPO1保守的酪氨酸酶结构域在互作中发挥主要作用;NnPPO1与NnCAT1的表达模式基本相同,推测NnPPO1与NnCAT1协同互作导致莲藕等果蔬褐变。

10个产地莲藕营养成分分析与品质综合评价

为探究不同产地莲藕中主要营养成分与活性成分的含量特征,建立莲藕品质综合评价体系。对10个产地的12份莲藕样本中的粗蛋白、淀粉、脂肪、粗纤维、可溶性总糖、总黄酮、总多酚、维生素C、矿物质和氨基酸含量进行测定,结果显示,云南红河莲藕的淀粉(136.87 g/kg)、脂肪(7.26 g/kg)、总多酚(155.5 mg/kg)、总氨基酸(15.75%)、铁(50.7 mg/kg)、锌(3.52 mg/kg)和钾(407 mg/100 g)含量最高,山东菏泽莲藕的可溶性总糖(71.35 mg/g)和粗纤维(69.84 g/kg)含量最高,江苏淮安莲藕的VC含量最高(67.53 mg/100 g),四川眉山莲藕的黄酮含量最高(117.92 mg/kg),湖北荆州莲藕的粗蛋白含量最高(38.4 g/kg),河南三门峡莲藕的磷含量最高(61.3 mg/100 g),陕西富平1莲藕钙含量最高(323 mg/kg),湖南湘潭莲藕的硒含量最高(9.5μg/kg)。利用因子分析和系统聚类分析对莲藕营养成分和综合品质进行评价,因子分析表明可将评价莲藕品质的指标用2个因子表示,淀粉、钾、维生素C、硒、铁和锌含量可以用来衡量莲藕品质的优劣。综合评价显示云南红河莲藕的品质最优,陕西富平3、江苏淮安和湖北荆州莲藕的品质较差。

荷叶生物碱成分及其调脂机制研究进展

荷叶Nelumbo nucifera是《本草纲目》记载具有调脂减肥功效的药材。荷叶生物碱是从荷叶中提取的生物碱类活性物质,具有抑菌、调脂、止痉等多种功效。近年来因肥胖引发的健康问题受到高度重视,因此荷叶生物碱的调脂减肥功效成为研究热点。对荷叶生物碱的成分、调脂机制及其在药品开发中的应用进行综述,为荷叶生物碱调脂产品的开发及调脂机制的深入研究提供参考。