磺胺间二甲氧嘧啶纳米抗体免疫磁珠的制备及其鉴定

基于纳米抗体(nanobody,Nb)和磁小体(bacterial magnetic particles,BMPs)的免疫磁珠在污染物分离分析中具有良好的应用前景,然而,不同长度柔性连接肽(linker)对免疫磁珠性能的影响尚未见相关报道。为了探究柔性连接肽长度对免疫磁珠的性能影响,本研究使用pET-28a作为载体,在磺胺间二甲氧嘧啶(sulfadimethoxine,SDM)Nb基因上融合了不同长度的柔性连接肽,分别为pET28a-SDM-Nb-(G4S)1-Cys和pET28a-SDM-Nb-(G4S)4-Cys,并使用大肠杆菌BL21(DE3)作为重组工程菌进行表达,最终获得Nb-(G4S)1-Cys和Nb-(G4S)4-Cys重组蛋白质。利用异源双功能试剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate,SPDP),分别将重组蛋白质与BMPs进行偶联,构建了免疫磁珠。利用免疫印迹对偶联结果进行了初步鉴定,并对偶联条件进行了优化。同时,使用透射电镜和Zeta电位分析仪对免疫磁珠的水合粒径、Zeta电位和分散性进行了分析。研究结果表明,SPDP能有效地将Nb-(G4S)1-Cys和Nb-(G4S)4-Cys定向固定在BMPs表面。通过差值法计算发现,Nb-(G4S)1-Cys与BMPs的偶联效率高于Nb-(G4S)4-Cys与BMPs的偶联效率。进一步表征结果显示,BMP-(G4S)1-Nb的Zeta电位绝对值更高,水合粒径更小,并且具有较低的多分散性指数,说明其在水相体系中具有更强的胶体稳定性。综上所述,利用BMPs和Nb-(G4S)1-Cys构建的免疫磁珠性能优于BMPs和Nb-(G4S)4-Cys构建的免疫磁珠。这为今后选择合适长度的连接肽构建高效的免疫磁珠分离分析SDM提供了理论依据。

3-苯氧基苯甲酸纳米抗体免疫磁珠的制备及其鉴定

基于纳米抗体(nanobody,Nb)的免疫磁珠,因其独特的性能在免疫检测、细胞分离、生物大分子纯化等领域受到广泛关注。但目前国内外缺乏对基于Nb与生物源性磁颗粒(bacterial magnetic particles,BMPs)和化学合成的磁颗粒(magnetic particles,MPs)构建的免疫磁珠性能差异的研究。本研究以3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoic acid,3-PBA)Nb作为研究对象,通过基因工程技术在其C-端引入半胱氨酸(cysteine,Cys),获得Nb-6His-Cys重组蛋白质。利用双功能交联试剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate,SPDP)将Nb-6His-Cys分别与BMPs和MPs进行偶联获得免疫磁珠,评价2种免疫磁珠的性能差异。结果表明,SPDP能够分别将Nb-6His-Cys定向固定在BMPs和MPs表面上;磁珠表征发现,BMP-Nb的水合粒径、电位和分散性均优于MP-Nb(BMP-Nb的水合粒径为68.43±24.54,电位-27.89 mV,分散性0.57;MP-Nb的水合粒径为27.31±5.28,电位-26.12 mV,分散性0.44);通过差值法计算发现,BMPs可展示更多的Nb-Cys(1 mg的BMPs上能够展示697±16μg 3-PBA Nb-Cys,1 mg的MPs上能够展示569±18μg 3-PBA Nb-Cys)。综上研究表明,Nb和BMPs构建的免疫磁珠性能优于Nb和MPs构建的免疫磁珠,本实验为合理选择免疫磁珠检测方法提供了理论依据,为实现3-PBA的环境快速检测提供物质支撑。

鸡胚盲肠上皮细胞原代培养与鉴定

为研究鸡E.tenella的宿主细胞——盲肠上皮细胞体外培养技术,为E.tenella损伤机制及抗球虫药的研究提供体外模型,分别用胰蛋白酶法、胶原酶Ⅰ法、嗜热菌蛋白酶法、嗜热菌蛋白酶+胶原酶Ⅰ法和中性蛋白酶Ⅰ+胶原酶Ⅺ法分离纯化原代鸡胚盲肠上皮细胞,通过测定细胞活力、细胞团块比例、总细胞产量和细胞团块产量,筛选出鸡胚盲肠上皮细胞最佳分离方法,并进行了纯化和培养,对培养细胞进行了鉴定。结果表明:嗜热菌蛋白酶消化、低速离心去除单细胞、差速贴壁除去成纤维细胞,为最佳分离和纯化盲肠上皮细胞的方法;分离纯化的细胞接种后分别于第3-5天、第10-11天进入对数生长期,可存活14 d以上;经形态学观察、碱性磷酸酶染色、扫描电镜鉴定为盲肠上皮细胞,所分离的细胞培养至第4、7、11天时上皮细胞比例分别为81.67%、84.33%和72.00%。用该法可获得纯度较高的原代鸡胚盲肠上皮细胞。

柔嫩艾美耳球虫在鸡胚盲肠上皮细胞中体外培养营养条件的研究

探讨E.tenella在鸡胚盲肠上皮细胞体外培养的营养条件,观察其发育过程。用鸡胚盲肠上皮细胞体外培养E.tenella,对子孢子接种基础培养基、营养物质含量及血清浓度进行了优选,并对优化营养条件下E.tenella的发育过程进行了观察。MEM199培养基中24、48、72h的虫体感染率显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于DMEM培养基;MEM199培养基中叶酸、VB6、VB1的含量为6mg·L-1时,24、48、72h的虫体感染率显著(P<0.05)高于其他组,分别为25.33%、12.67%和12.33%;MEM199培养基中葡萄糖含量为3000mg·L-1,胰岛素含量为0.40mg·L-1时,有较多的成熟裂殖体形成;接种子孢子后于4、48、96h换液,接种时和4、48h血清浓度为2.5%,96h为1%,有利于子孢子的后期发育;优化营养条件下,细胞接种子孢子后4、24、48、72、96、120h的细胞虫体感染率分别为42%、28%、20%、15%、13.67%、13.67%,且E.tenella可在鸡胚盲肠上皮细胞中完成内生发育过程,并形成卵囊。结果表明,获得了能使E.tenella在鸡胚盲肠上皮细胞完成整个内生发育的体外培养营养条件。

铜和维生素A及其互作效应对肉鸡免疫功能的影响

采用4×2（铜×维生素A）完全随机试验设计,研究了日粮添加不同水平的铜（0mg·kg-1、8mg·kg-1、150mg·kg-1、225mg·kg-1）和维生素A（1500IU·kg-1、5000IU·kg-1）对肉仔鸡不同生长阶段（0~4周龄和5~7周龄）免疫功能的影响。结果表明：添加铜为8mg·kg-1时,肉鸡生长前期（0~4周龄）可显著（P〈0.05）或极显著（P〈0.01）提高肉鸡脾脏活化T淋巴细胞百分率和血清抗体效价,生长后期（5~7周龄）可极显著（P〈0.01）或显著（P〈0.05）提高脾脏、胸腺、盲肠扁桃体活化T淋巴细胞百分率和外周血液中活化T、B淋巴细胞百分率;整个试验期添加高铜（150mg·kg-1、225mg·kg-1）时,活化T、B淋巴细胞百分率均不同程度下降。添加维生素A5000IU·kg-1时,肉鸡生长前期可显著（P〈0.05）提高其外周血液中活化T淋巴细胞百分率,生长后期可极显著（P〈0.01）或显著（P〈0.05）提高脾脏、盲肠扁桃体活化T淋巴细胞百分率和血清抗体效价。铜和维生素A互作效应对肉鸡生长前期的活化T、B淋巴细胞百分率和血清抗体效价影响不显著,对生长后期的外周血液、胸腺、盲肠扁桃体活化T淋巴细胞百分率影响显著（P〈0.05）,以8mg·kg-1铜×5000IU·kg-1维生素A处理最高;以上结果提示铜和维生素A对肉鸡免疫功能的影响存在互作效应。

鸡胚盲肠上皮细胞的传代培养

本研究旨在探讨鸡胚盲肠上皮细胞传代培养条件及其特性,为E.tenella损伤机制及抗球虫药的研究提供体外模型。分别用胰酶-EDTA联合消化和分步消化2种方法分离纯化原代鸡胚盲肠上皮细胞,通过测定贴壁细胞覆盖率选择细胞传代的适宜消化方式;筛选了传代细胞培养液中L-GLN和胰岛素的最佳浓度,通过贴壁差进一步纯化盲肠上皮细胞,探索其合适的培养条件。通过形态学观察、透射电镜、免疫组织化学技术、组织化学技术、糖原染色、流式细胞术的方法对传代细胞特性进行了鉴定。结果表明:胰酶-EDTA联合消化、15min贴壁差纯化除去成纤维细胞,72.5mg.L-1 L-GLN、0.05mg.L-1胰岛素和5%FBS的传代细胞培养液更有利于盲肠上皮细胞的生长;经形态学和透射电镜观察,AKP、Vimentin及PAS染色,所培养的传代细胞具有典型的上皮细胞特征,在传代后24～72h盲肠上皮细胞纯度达95%以上,贴壁细胞覆盖率达85%以上;细胞凋亡测定表明,细胞连传5代,活性较好,第6代细胞凋亡率显著增加,贴壁细胞覆盖率降低。本研究提示用该法传代可获得稳定、数量大、活性高、纯度高的鸡胚盲肠上皮细胞。

新形势下动物性食品 卫生学课程教学改革探索

党的二十大报告指出,要坚持为党育人、为国育才,全面提高人才自主培养质量,培养德智体美劳全面发展的社会主义建设者和接班人。高校做好人才培养工作,是支撑引领科技进步,服务经济社会发展的重要举措,同时能够更加有力地实施科教兴国战略、人才强国战略、创新驱动发展战略。为此,高校要把为党育人、为国育才作为初心使命,做好人才培养工作。

^(60)Coγ射线对高免卵黄液中AE病毒的灭活

用不同剂量、剂量率的 6 0 Coγ射线 ,对人工污染一定量的禽传染性脑脊髓炎病毒 ( AEV)的高免卵黄液进行辐照 ,研究了其对病毒的灭活效果和对卵黄抗体的影响。结果表明 ,6 0 Coγ射线辐照 ,可以灭活高免卵黄液中的 AEV,且随辐照剂量、剂量率的增大 ,灭活率也增高 ;AEV在卵黄液中的 D1 0 值为 6 .6 1～ 7.0 6 k Gy;9.2 k Gy以上的辐照剂量 ,可以将高免卵黄液中的 AEV完全灭活 。

柔嫩艾美耳球虫病鸡盲肠上皮细胞凋亡的分析

从细胞凋亡的角度探讨柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)对鸡盲肠黏膜的损伤机理,为鸡球虫病的防治提供理论依据。用E.tenella孢子化卵囊感染雏鸡,于感染后不同时间段取盲肠组织,运用常规病理组织学、超微病理学和原位末端标记技术对感染E.tenella病鸡盲肠黏膜上皮细胞和肠腺上皮细胞进行观察和分析。结果表明:鸡感染E.tenella的第2天,盲肠黏膜上皮细胞凋亡数即开始增加,感染后第4～6天是病变最严重且具有特征性的阶段,主要表现为中、后段盲肠黏膜深层严重出血,大量黏膜上皮脱落,严重者可见整个黏膜几乎完全脱落,肠腺破坏,其表面被覆盖大量脱落的变性、坏死的上皮细胞和红细胞,残存的黏膜上皮细胞和肠腺上皮细胞凋亡速度加快,大多数上皮细胞处于凋亡状态,凋亡指数极显著(P≤0.01)高于空白对照组,凋亡细胞体积缩小,细胞线粒体肿胀,严重时破裂成大空泡,染色质致密边集或断裂成核碎片,形成膜包裹性凋亡小体。结果提示E.tenella感染鸡后盲肠上皮细胞凋亡加重,以裂殖生殖阶段最为明显,且与损伤程度和病程密切相关。

柔嫩艾美耳球虫山西株早熟系的免疫特性

对鸡柔嫩艾美耳球虫山西株早熟系的免疫特性进行了研究。结果表明:该株的早熟系与亲本株具有相同的免疫原性,但致病性大大降低;其最佳免疫剂量和次数:首次免疫为1500个/只,14 d后以2000个/只二免,二免后免疫保护期可达90 d以上,免疫后鸡群的抗球虫能力与血清中特异性IgG的变化规律一致;提示该早熟系具备早熟疫苗株的免疫特性。

^(60)Coγ射线对高免卵黄液中EDS-76病毒灭活的研究

用不同剂量、剂量率的6 0 Coγ射线对卵黄液中的EDS 76病毒进行辐照 ,研究了其对病毒的灭活效果和对卵黄抗体 (IgY)的影响。结果表明 ,6 0 Coγ射线辐照 ,可以灭活高免卵黄液中的EDS 76病毒 ,且随辐照剂量、剂量率的增大 ,灭活率也增高 ;EDS 76病毒在卵黄液中的D10 值为 0 .57kGy～ 0 .60kGy ;6.0kGy的辐照剂量 ,可以将高免卵黄液中的EDS 76病毒完全灭活 ,且不影响卵黄抗体效价 ,该卵黄抗体稳定性好、耐酸、耐热。

柔嫩艾美耳球虫山西分离株的分离与致病性观察

运用单卵囊分离技术，从山西省某鸡场鸡球虫感染粪便样品中获得l株纯种球虫，鉴定为柔嫩艾美耳球虫并命名为Eimeria tenella SX010323，并对其致病性进行了研究。（1）该球虫卵囊寄生于盲肠、为宽卵圆形，卵囊壁光滑、褐色，无卵膜孔，有极粒，无内、外残体。孢子囊呈长卵圆形，有斯氏体。卵囊大小范围为（16．80～28．80）μm×（14．40～25．20）μm，平均大小为（21．54±0．24）μm×（17．85±0．24）μm，形状指数为1．21±0．05。子孢子，大小范围为（10．20～12．75）μm×（4．40—7．25）μm，平均大小为（11．54±0．24）μm×（6．27±0．43）μm。潜隐期为141h，最短孢子化时间为19h；（2）63只11日龄的海兰白公雏随机分为7组，分别口服感染此新鲜卵囊1×10^3、5×10^3、1×10^4、2×10^4、5×10^4、1．0×10^5个，并设立不感染对照组。结果表明：所有感染组增重均低于对照组（P〈O．05），各感染组间随着感染剂量的增加，增重和增重率显著降低，血便率和盲肠病变记分增加（P〈0．05）；（3）将4℃分别保存17、13、10、4、1个月和新鲜孢子化的虫株卵囊，以1．5×10^4个／只的剂量感染11日龄雏鸡，每组10只。结果表明：保存1个月和4个月活力较高，保存10个月活力开始下降，保存13、17个月活力下降较大。

柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)早熟株与亲本株致病性和繁殖力的研究

通过对经15代选育的柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)山西株的早熟株与其亲本株的繁殖力和致病性进行比较研究,证实早熟株的潜隐期比亲本株缩短21 h,繁殖力下降40%左右;对致病性的研究显示,早熟株感染后对鸡只增重、AC I的影响较小,对11日龄雏鸡的半数感染量和半数致死量较亲本株增大,肠道病变记分较亲本株下降。由此认为,该早熟株符合球虫早熟株的特性,可用于鸡球虫病早熟苗的制作。

《兽医病理学》精品课程的建设与实践

精品课程建设项目是高等学校教学质量的一项重要内容。以山西农业大学"兽医病理学"省级精品课课程建设为例,从强化师资队伍、优化课程体系、强调理论教学与实践教学并重、改善教学方法和手段等环节上等几个方面探讨了精品课程建设的途径,并取得了良好效果。

鸡胚盲肠上皮细胞体外培养纯化方法的研究

为探讨鸡胚盲肠上皮细胞体外培养的纯化方法,采用低速离心去除单细胞、差速贴壁去除成纤维细胞纯化上皮细胞,并对培养细胞的纯度进行了测定。结果表明:采用1200r.min-1 5min的离心条件,利用贴壁差细胞种植1.5h后倒瓶的方法可去除部分单细胞和大部分纤维细胞,细胞种植第3天～第11天纯度可达72.00%以上。提示低速离心结合差速贴壁法可达到纯化盲肠上皮细胞的目的,可为试验研究提供较为理想的细胞模型。

柔嫩艾美耳球虫早熟系的选育及其生物学特性研究

选育制备弱毒疫苗所需的柔嫩艾美耳球虫早熟系并对其生物学特性进行研究。运用Jeffers建立的早熟系选育方法对柔嫩艾美耳球虫山西株（E．tenella SX010323）进行早熟选育，并对其内生发育、致病性、繁殖力、免疫原性、稳定性进行观察和检测。结果表明：经过海兰白雏鸡15次传代之后，E．tenella SX010323潜隐期由141h缩短至120h，卵囊明显缩小。选育得到的柔嫩艾美耳球虫山西株早熟系（E．tenella SX010323P15）其内生发育表现第二代裂殖生殖不完全；亲本株与早熟系对11日龄雏鸡的半数致死量分别为7．52×10^4个／只、27．64×10^4个／只，早熟系在致病性与繁殖力上均较母株大幅度降低，但保留了母株的免疫原性，经早熟系免疫的雏鸡可抵抗亲本株半数致死量的攻击。对选育的早熟系进行放松选择传代10次，其潜隐期、OPG、致病性均保持了早熟系的特征。提示通过早熟选育得到了遗传相对稳定的柔嫩艾美耳球虫早熟系。

血清浓度对鸡胚盲肠上皮细胞原代培养的影响

为探讨细胞培养基中血清浓度对鸡盲肠上皮细胞体外培养的影响，分别用舍0％、2．5％、5％和10％胎牛血清（FBS）的细胞培养液培养鸡胚盲肠上皮细胞，检测细胞活性；选择适宜的FBS浓度，并测定了该浓度条件下鸡盲肠上皮细胞的生长特性。结果表明：用含2．5％和5％FBS的培养基培养鸡胚盲肠上皮细胞，第4天细胞贴壁率达最高，分剐为84％和80．33％，显著地高于无血清和10％FBS组（P〈0．01／0．05），第7天仍均维持在76％以上，两者间除了第2天外，其余差异均不显著；用含2．5％FBS的细胞培养基进行鸡胚盲肠上皮细胞原代培养，第2～3天为适应阶段，第3～5天处于对数生长期，第5～9天细胞进入减速期，第10～11天再次进入对数生长期，第11天以后细胞进入衰退期，整个过程持续14d左右。鸡胚盲肠上皮细胞培养的血清浓度以2．5％FBS为宜。

不同光照时间对蛋鸡生产性能的影响

按光照时间不同分为四组：试验Ⅰ组（１４ｈ）、试验Ⅱ组（１５ｈ）、试验Ⅲ组（１７ｈ）、对照组（１６ｈ）。每组８０只，各组饲养管理相同，试验期为５周。试验结果：产蛋率和总产蛋重Ⅲ组最高，与Ⅰ组、Ⅱ组、对照组比较差异显著（ｐ＜００５）。Ⅲ组产蛋率为８１００％，比Ⅰ组、Ⅱ组和对照组分别高３６５％、４４３％、３２６％。Ⅰ组、Ⅱ组和对照组各组之间差异不显著（ｐ＞００５）。料蛋比Ⅲ组最低２３７∶１，与Ⅰ、Ⅱ组和对照组比较差异显著（ｐ＜００５）。蛋重四个组之间差异不显著（ｐ＞００５）。经济效益Ⅲ组最好，盈利分别比Ⅰ、Ⅱ组和对照组高：１１０８％、１２３９％、１４７５％。光照１７ｈ的Ⅲ组，产蛋率、产蛋重、料蛋比显著优于Ⅰ组、Ⅱ组和对照组。因此，产蛋鸡在产蛋中期、后期采用１７ｈ光照可以提高生产性能，降低饲养成本，提高经济效益。

不同棉酚含量的日粮饲喂伊莎褐生长鸡、产蛋鸡的试验研究

本试验Ⅰ组用１０％脱毒棉仁饼代替部分大豆饼，日粮中含游离棉酚０．００４９８％。试验Ⅱ组用５％棉仁饼代替部分大豆饼，８粮含游离棉酚０．００６％。对照组用低鱼粉大豆日粮，不含棉酚。试验分二个阶段进行。试验１，３种日粮饲喂莎褐生长鸡结果不影响增重，饲料利用率试验组低于对照组，增重成本试验Ⅰ组最低，试验Ⅱ组稍高于对照组。试验２，３种日粮饲喂伊莎褐商品代蛋鸡结果不影响产蛋率，蛋重和饲科利用率对照组高于试验组。鸡蛋成本试验Ⅰ组比对照组低０．０７元。试验证明１０％脱毒棉仁饼代替部分大豆饼合游离棉酚０．００４９８％的日粮经济效益最高。目前缺乏蛋白质饲料，而大豆饼价格上涨的情况下，试验Ⅰ、Ⅱ组日粮均可采用。