寡核苷酸阵列芯片快速鉴定大肠杆菌O_(157):H_7初步研究

目的设计、制作一种微型化寡核苷酸阵列芯片,评价快速鉴定肠出血性大肠杆菌O157:H7的效果。方法多重PCR扩增大肠杆菌O157:H7七个特异性基因位点(rfbEf、licH7i、ntimin、Shiga-like toxins I and II、hemolysin A和uidA),通过PCR反应掺入SpectrumOrangTM-dUTP获取荧光标记的靶序列,与制备的芯片寡核苷酸探针杂交。结果寡核苷酸阵列芯片检测结果与试验预期相符,获取的杂交图分辨效果明显优于多重PCR琼脂糖凝胶电泳。结论基于玻片的寡核苷酸阵列芯片制作简便,鉴定病原菌检测细菌毒力因子快速、灵敏、特异,有良好的应用前景。

江苏省传染性非典型肺炎病原学检测研究

目的:建立传染性非典型肺炎(SARS)实验室检测方法,为SARS病例诊断和现场防治提供依据。方法:用逆转录套式PCR、实时荧光定量PCR检测SARS病毒核酸;酶联免疫法检测血清标本SARS病毒IgM抗体;部分PCR检测阳性或SARS病毒IgM抗体阳性病例的标本进行直接电镜观察;简并引物PCR检测冠状病毒属病毒核酸;鉴别诊断IFA检测血清中肺炎支原体等9种常见呼吸道感染病原IgM抗体,PCR检测军团菌以及甲、乙型流感病毒核酸。结果:检测各类临床标本506份。2003年全省报告临床诊断病例7例,5例检测结果阳性;逆转录套式PCR检测各类标本132份,阳性8份;对其中4份PCR扩增产物(108bp)进行了序列分析,与SARS病毒序列100%同源;实时荧光定量PCR检测各类标本30份,阳性3份;酶联免疫法检测血清标本101份,SARS病毒IgM抗体阳性4份;3个诊断病例的各类标本电镜检查发现冠状病毒样颗粒;IFA检测血清标本75份,嗜肺军团菌IgM抗体阳性9份,乙型流感IgM抗体阳性11份,两者同时阳性3份,其他病原体IgM抗体均为阴性。不明发热病例的标本21份简并引物PCR检测冠状病毒,2份咽拭子标本阳性;漱口液、尿液标本各15份PCR检测军团菌、漱口液25份PCR检测甲、乙型流感病毒结果均为阴性。结论:本研究建立的检测方法与临床诊断有比较好的符合性,对于临床诊断和防治工作具有重要的参考价值。PCR检测SARS-CoV特异性较好,而敏感性有待提高。

江苏省不明原因轻型呼吸道传染病暴发的病因学研究

自2004年4月18日起至6月末,江苏省东台市发生以发热、咽部充血、扁桃体肿大为临床表现的原因不明的疫情暴发,发病人群以中小学生、幼儿为主,地域以许河镇、新街镇以及临近乡镇为主.疫情涉及东台市9个镇,合计报告709例,分布在75个学校,240个班级.暴发的特点为传染性强,短期内出现大量的患者,发病有班级聚集性特点,未发现成人感染.临床表现以发烧(100%)、咽部充血(91.40%)、扁桃体肿大(60.22%)、咽痛(50.00%)为主;X线检查可发现肺纹理增强(90.3%).用Hep-2细胞从患儿20份咽拭子标本中分离到12株病毒,经PCR扩增腺病毒L3部分基因及其PCR产物的序列测定和分析,证实这12株病毒为腺病毒3型;对28份咽拭子标本直接进行DNA提取和PCR扩增,有17份标本PCR扩增L3部分基因呈阳性,经序列测定和分析,也为腺病毒3型.这29个阳性标本L3基因的1 446个核苷酸的序列与GenBank上所发表的腺病毒3型序列同源性高达99.5%.双份血IgG检测:对江苏省采集10份患儿急性期和恢复期双份血清,以从患儿咽拭子分离到的腺病毒3型作为抗原,进行病毒抗体测定,6份患儿的双份血清腺病毒总IgG滴度呈4倍以上增高.患儿急性期血IgA检测:对暴发疫情34例患儿急性期血清(发病时间为1～3天)进行腺病毒IgA抗体测定,结果有9份标本为阳性,1份标本为可疑阳性,阳性率为26.47%.IgA阳性率低可能与血清采集时间过早有关,机体还未全部产生IgA.另外,还对江苏省送检的从患儿血培养基培养的细菌毒株进行了鉴定,对其16S rRNA基因进行了基因扩增及序列分析,序列测定和分析提示为A组M3型化脓性链球菌.实验研究结果并结合此次疫情的流行病学和患儿的临床表现,证实腺病毒3型是引起此次儿童不明原因轻型呼吸道传染病暴发的病原体,部分病例伴有原发或继发化脓性链球菌感染.

江苏省手足口病病原阳性检出率相关因素及病原学特征

目的:了解江苏省手足口病(Hand-foot-mouth disease,HFMD)肠道病毒阳性检出率相关因素,并对其EV71病毒的VP1基因特征进行分析。方法:在2008年4～12月份,通过监测哨点医院收集全省手足口病病例的咽拭子、粪便或肛拭子、疱疹液、脑脊液、血清标本,并填写病例相关基本信息。结果:共采集手足口病病例的各种类型标本2082份,咽拭子、肛拭子、疱疹液、粪便、脑脊液、血清的总肠道病毒阳性检出率分别为53.52%、41.12%、40.74%、27.27%、25.00%、9.80%,EV71阳性检出率分别为47.03%、30.84%、33.33%、22.73%、25.00%、2.94%,CoxA16阳性检出率分别为5.34%、8.41%、3.70%、0.00%、0.00%、6.68%,不同类型标本的肠道病毒阳性检出率和阳性检出构成均有差异(P值均<0.0001)。总肠道病毒阳性检出率在发病后第2天最高(56.59%),不同发病与采样时间间隔的总肠道病毒阳性检出率和EV71病毒阳性检出率均有统计学意义(P值分别为0.0019、0.0139),而与CoxA16阳性检出率没有统计学意义(P=0.2558)。总肠道病毒阳性检出率在就诊后第2天最高(59.90%),不同就诊与采样时间间隔的总肠道病毒与EV71病毒阳性检出率有统计学差异(P值分别为0.0228、0.0333),与CoxA16阳性检出率没有统计学差异(P=0.3958)。分离的4株EV71病毒均为C4.3基因亚群。结论:标本类型、采样与发病时间间隔、采样与诊断时间间隔均与手足口病病例的肠道病毒阳性检出率密切相关,分离的EV71毒株为C4亚型。

单管高灵敏度等温扩增技术快速检测甲型H1N1流感病毒

建立了单管逆转录环介导等温扩增法(RT-LAMP)快速检测甲型H1N1流感病毒的方法。针对甲型H1N1流感病毒的M基因和HA基因的保守区,设计了两组特异性引物,分别用于筛选甲型流感病毒及鉴定甲型H1N1流感病毒。对反应体系中的关键因素进行优化,反应结果可直接通过浊度或者SYBR GreenⅠ荧光进行判定。本方法最低可检测到10拷贝/管的甲型H1N1流感病毒。为验证方法的可行性,对30例临床样本进行了检测,与美国疾病控制与预防中心(CDC)的TaqMan方法进行对比,检测的灵敏度和特异性分别为92%和100%。本方法实现了单管快速检测甲型H1N1流感病毒,为甲型H1N1流感病毒的现场检测提供了新方法。

人-猪链球菌感染性综合征的病原特征分析

目的 评价人源和猪源猪链球菌的药敏和致病力情况 ,分析这些菌株间的同源性。方法 用K -B法对这些菌株进行药敏试验 ;用菌株对家兔和小白鼠进行攻击试验 ;用菌体脂肪酸分析和随机DNA基因扩增分析技术进行菌株间的同源性研究。结果 人源和猪源猪链球菌对青霉素钾、氯霉素、头孢拉定、头孢呋新、头孢三嗪、头孢噻甲羧肟、菌必治、万古霉素、氨苄青霉素、红霉素敏感 ,对四环素、链霉素不敏感 ,小白鼠对这些菌株不敏感 ,而家兔敏感 ,接种这类菌株可致家兔死亡。菌体脂肪酸分析和随机DNA基因扩增分析提示 :这些菌株间的以及与猪链球菌 2型参考菌株间的亲缘关系很近 ,与血链球菌、无乳链球菌等 7种链球菌及肠球菌的亲缘关系较远。结论 这些人源和猪源猪链球菌均为猪链球菌 2型 ,致病力极强 ,人源与猪源猪链球菌同源。

分子鉴别诊断(MDD)技术在呼吸道病原体检测中的应用

目的:以靶序列富集多重PCR(Tem-PCR)和液相芯片(xMAP)检测技术结合,建立常见呼吸道病原体的分子鉴别诊断(MDD)平台,对其可靠性进行评估,并用于临床样品的检测。方法:采集苏州大学附属儿童医院呼吸科住院病例呼吸道灌洗液样品22例和苏州大学附属第一医院呼吸内科门诊病例咽拭子样品20例,使用Tem-PCR技术对样品的核酸进行多重扩增,以液相芯片技术进行高通量的多重检测。结果:对已知样品的检测表明该平台具有高度的特异性和敏感性。对42例临床样品进行检测的结果显示,22例呼吸道灌洗液的阳性检出率为63.6%。呼吸道灌洗液阳性检出率高于门诊病例咽拭子样品的阳性检出率,RNA病原体(以病毒为主)的阳性率高于DNA病原体(以细菌为主)的阳性率。结论:建立了呼吸道病原体的MDD平台,具备了对呼吸道传染性疾病的高通量快速诊断能力。

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

目的制备发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)核衣壳蛋白(NP)的单克隆抗体,并探讨其在该病诊断中的作用。方法克隆NP基因,构建原核表达载体pComb3XSS-NP,并转化大肠杆菌Top10F′,经诱导表达,纯化获得6HIS-NP融合蛋白。以该融合蛋白免疫Balb/c小鼠,经杂交瘤技术制备NP的鼠源单克隆抗体。经鉴定后,选择1株1C8-C6进行大量制备、纯化,并偶联辣根过氧化物酶(HRP),用该酶标抗体对SFTSV感染人的急性期血清进行Western blot检测。结果成功表达、纯化SFTSV重组的NP。经小鼠免疫、细胞融合和ELISA筛选后,共获得4株鼠源单克隆抗体。具较高滴度的1C8-C6酶标抗体能与SFTSV感染人的急性期血清中的NP在Western blot水平上结合,而与汉坦病毒、登革热病毒感染人急性期血清及正常人血清不反应。结论 SFTSV NP的表达及其单抗的制备为该病的实验室诊断奠定了基础。

家庭聚集性人感染高致病性禽流感病例的确认及其病原的HA基因特征分析

目的确认江苏南京市2007年12月期间二例家庭聚集性人感染高致病性禽流感病例,探究家庭聚集性病例的临床变化规律及其病毒的基因特征。方法通过知情人访谈和查阅病志方式开展流行病学调查。同时采集二病例咽拭子等标本,运用荧光定量RT-PCR法进行H5N1基因检测,并开展病毒分离,分析血凝素(HA)基因特征。结果流行病学调查结果表明二病例为家庭聚集性病例,首发病例病后第5d出现"白肺",病后第8d后死亡,白细胞和血小板呈进行性下降。第二例病人存活,肺部未出现遍及全肺的大面积实变。二病例呼吸道标本H5N1基因检测均为阳性,培养物经鉴定均为H5亚型。二分离株HA基因同源性为100%,同我国浙江、安徽等地人源分离株接近(99.0%,98.9%),同江苏禽源分离株同源性达98.7%。二分离株经系统发生树分析均为CladeⅡ系的2.3.4基因亚群,HA1和HA2连接肽及细胞受体结合位点仍表现为禽源特性。结论二病例为人感染高致病禽流感H5N1病毒家庭聚集性病例,为有限的直系亲属间的人与人传播模式,分离株的HA基因特征仍为禽源性。

2004年中国四省市腺病毒疫情的流行病学和病原学研究

目的对2004年发生在湖北省、江西省、江苏省和北京市的腺病毒暴发及散发的疫情进行流行病学总结和分析以及病原学研究,以了解中国腺病毒感染状况。方法对各地分离的共16株腺病毒毒株进行了病原学研究,包括病毒的培养,提取病毒核酸,针对Hexon蛋白基因的PCR扩增以及PCR产物的序列测定和分析,并根据流行病学资料对腺病毒的疫情特点进行总结和分析。结果2004年引起湖北省、江西省、江苏省和北京市的腺病毒暴发及散发的疫情均为腺病毒3型;分离到的16株腺病毒毒株,在所选的900bpHexon基因片段,基因变异较小,核苷酸和氨基酸的同源性在98.5%￣100%。结论目前我国学龄儿童以及低年龄组儿童的腺病毒感染主要为3型所致,各地分离的病毒株未观察到明显的基因变异。

纳米金比色芯片检测和鉴定病原微生物

目的 :建立一种简单、快速的比色芯片判断PCR产物存在与否的方法。方法 :在多重PCR过程中掺入生物素化的dUTP (biotin 16 dUTP )制备生物素化的靶序列 ,与相应的生物芯片杂交后 ,用链霉亲和素 纳米金结合银染的方法鉴定 4种不同大肠杆菌血清型。同时 ,为了与链霉亲和素 藻红蛋白染色方法进行比较 ,用这两种方法检测了大肠杆菌血清型O15 7:H7的rfbE扩增产物。结果 :纳米金比色芯片检测结果与琼脂糖凝胶电泳的结果一致 ,芯片杂交的纳米金标记与荧光标记检测的结果相当。结论 :纳米金比色芯片能够对 4种不同的大肠杆菌血清型进行准确鉴定 ,而且不需复杂的仪器 。

大肠杆菌O157∶H7抗菌药物敏感性研究

为了解E .ColiO15 7∶H7对抗菌药物的敏感性及其耐药谱的差异 ,我们选择了常见的 19种抗生素 ,对 1999年分离到的 89株O15 7∶H7进行药敏试验。结果显示O15 7∶H7对氨基甙类、头孢类、喹诺酮类、呋喃类的实验药物、多肽类的多粘菌素B以及氯霉素的敏感率高 ,基本在 90 %以上。在宿主动物中家禽类的菌株耐药率大于家畜类 ,家畜类宿主中猪的菌株耐药率大于牛、羊。无毒力基因菌株对抗生素的耐药率高于有毒力基因的菌株 (P <0 0 5 )。样本来源不同和基因型别不同的耐药结果均显示菌株对抗生素的耐药情况与其是否携带有毒力基因有关。

小肠结肠炎耶尔森菌耐热性肠毒素B基因(ystB)初步研究

目的研究小肠结肠炎耶尔森菌的耐热性肠毒素B基因(ystB)的分布特征。方法通过聚合酶链反应(PCR)、DNA探针杂交方法与序列分析检测致病性和非致病性小肠结肠炎耶尔森菌携带ystB基因的情况。结果98株非致病性小肠结肠炎耶尔森菌中52株携带ystB基因,占53.06%。全部48株致病性小肠结肠炎耶尔森菌均不携带该基因。结论ystB基因仅存在于部分生物1A型非致病性小肠结肠炎耶尔森菌,而不存在于致病性菌株中。

蚊子再传新恶疾西尼罗病毒病

最近，我国南方部分地区正在受乙型脑炎袭扰。大家都知道，乙型脑炎病毒是通过蚊虫叮咬传播的。然而，你可否知道，蚊子还会传播另外一种脑炎病毒，叫做西尼罗病毒。去年，这种致命的脑炎病毒在美国造成了大规模爆发和流行，有4000多人受感染，其中284人死于西尼罗脑炎，引起了全球的广泛关注。

19份手足口病临床标本的病原学分离与鉴定

目的:为探索手足口病的病原并为该病的防治提供科学依据,对本省徐州地区采集的19份手足口病临床标本进行病原学分离与鉴定。方法:采集的患者咽拭子(6份)和肛拭子(13份)标本,接种Hep-2细胞进行病毒分离,经培养3代,对有明显致细胞病变效应并能连续传代的毒株,用肠道病毒通用引物real-time-RT-PCR方法鉴定确认为肠道病毒后,用肠道病毒分子分型引物(E187/E222)对肠道病毒VP1区进行扩增,将扩增产物测序获得的序列与GeneBank中肠道病毒核苷酸序列进行比对,确定毒株血清型别。结果:19份标本中分离到9株病毒,均为肠道病毒。对其VP1区部分核苷酸序列测定和比较分析后,鉴定出其中有6株为CoxB5,1株为CoxB3,2株为Echo6。结论:虽然肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16(CoxA16)是引起手足口病暴发流行的主要病原,但引起手足口病的肠道病毒存在多种血清型,CoxB5、CoxB3和Echo6等均能引起手足口病。因此,对手足口病的病原学检测,除EV71和CoxA16外,不能忽视对其他肠道病毒的病原学检测和鉴定。

应用实时定量PCR技术研究人重组干扰素α2b在人群中对麻疹病毒和风疹病毒的抑制作用

Human recombinant interferon α2b can inhibit replication of many viruses and it is an important prophylactic drug for virus infection. In this study, interferon α2b was used to study the biological function on measles virus and rubella virus replication in human. For each virus, selected population was divided into two groups, including with and without interferon α2b treatment, then the attenuated viral vaccine was used to inoculate each group and the respiratory samples were collected at fixed intervals. A highly sensitive and accurate Real-time PCR method was used to detect the virus copy number in samples. The results showed that the virus copy number was much lower after interferon treatment and suggested that interferon α2b could inhibit the measles virus and rubella virus replication in human.

2008-2009年江苏省肠道病毒71型分子流行病学研究

目的探讨2008-2009年江苏省肠道病毒71型（EV71）分离株的病毒基因特征。方法选取18份EV71分离株,用一对特异引物进行VP1全基因核苷酸序列扩增,在ABI3130型自动测序仪上测序,序列结果用DNA Star和MEGA4软件进行分析,并与各型参考株进行比较。结果 18株病毒与安徽省阜阳市和山东省临沂市分离的C4a基因型参考株最为相近,核苷酸同源性在96.3%~99.6%之间,氨基酸同源性在99.0%~99.7%之间;而与A、B基因型参考株比较差异较大,核苷酸同源性只在81.8%~84.4%之间,氨基酸同源性在94.3%~97.0%之间;说明本文的18株病毒均属于EV71型C4a基因型。结论 2008-2009年江苏省分离的18株EV71可能与安徽省和山东省分离的EV71有相同的起源,均属于C4a亚型;目前C4a亚型病毒在中国大陆可能有较广泛的分布和传播。

2012年江苏部分地区动物中发热伴血小板减少综合征病毒携带状况调查

目的了解江苏部分地区动物中发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）携带状况,探讨其可能的传播媒介和自然宿主。方法 2012年3月-12月在江苏省发现发热伴血小板减少综合征病例的7个市/县,采集鼠、牛、羊、刺猬、鸟类和蜱等动物标本,提取总核酸后,应用实时荧光RT-PCR法对标本进行布尼亚病毒S基因核酸的检测,阳性标本采用Vero细胞进行病毒分离。结果采集761只（管）动物,43只（管）检出SFTSV核酸阳性,阳性率为5.65%。采集3 728份标本,阳性49份,阳性率为1.31%。鼠的病毒携带率最高（6.84%）,蜱标本阳性率最高（4.94%）。除蜱标本外的3 647份标本中检出阳性45份,阳性率为1.23%,不同器官阳性率分别为淋巴结（50.00%）、血清（2.34%）、脾（1.64%）、心（1.64%）、肝（1.28%）、肺（1.09%）、脑（0.94%）、肾（0.73%）、血块（0.41%）。5月标本阳性率最高（4.01%）。从1份羊血清及其体表1份蜱标本中各分离出1株SFTSV病毒。结论鼠、牛、羊和蜱均可携带SFTSV,可能是其自然宿主或传播媒介。

单克隆抗体S2C4对2型志贺毒素及其亚型毒性的中和作用(英文)

纯化的2型志贺毒素(Shiga toxin2,Stx2)经福尔马林脱毒后免疫BALB/c小鼠制备Stx2单克隆抗体,用体外中和试验对具有中和活性的阳性抗体克隆进行初筛,对所获得的中和抗体的重、轻链同种型及结合特异性进行鉴定,其中和保护作用通过体内、体外中和试验加以验证,最后,中和抗体对Stx2亚型Stx2c和Stx2vha的中和谱用体内中和试验验证.结果显示,12株抗Stx2的阳性抗体克隆中,只有1株具有中和活性,命名为S2C4,其重、轻链同种型为G1/κ,其靶分子为Stx2的A亚单位,与Stx2的B亚单位或Stx1不结合.在体外中和试验中S2C4可有效中和Stx2对Vero细胞的杀伤作用,同样,S2C4可中和致死量的Stx2及其亚型Stx2c和Stx2vha对小鼠的毒性作用.该抗体有望成为治疗产志贺毒素大肠杆菌感染的候选分子.

高通量测序H7N9禽流感病毒基因组模板制备方法的优化及应用

目的:建立一种较优的高通量测序H7N9禽流感病毒基因组模板制备方法,用于H7N9禽流感病毒基因组监测。方法:分别以6碱基随机引物反转录生成单链cDNA,合成双链cDNA;流感病毒通用反转录引物U12反转录生成单链cDNA,6碱基随机引物合成双链cDNA;U12引物反转录生成单链cDNA,通用流感病毒全基因扩增引物混合物生成双链cDNA制备高通量测序模板、构建测序文库、测序并分析数据,比较3种方法对高通量测序效率的影响,并与传统Sanger测序方法比较其测序的准确性,选择其中较优的方法用于高通量测序。结果:以U12引物反转录cDNA,通用流感病毒全基因扩增引物混合物生成双链cDNA制备的高通量测序模板,在测序族生成数、覆盖率、单核苷酸多态性及读长等方面均优于另外两种方法。结论:本研究建立的H7N9禽流感病毒基因组模板制备方法用于高通量测序具有准确性高,周期短,成本相对较低,可同时检测多个样本等特点,可用于大规模H7N9禽流感病毒基因组监测。