巨噬细胞作用的新概念:正反两面性

巨噬细胞的特性主要是一大(最大的吞噬细胞)、二多(受体多、酶及活性产物多),并有三步激活过程(触发、兴奋、充分激活)。其作用有正反两面性,既能参与免疫防护,又能造成不利影响,分别表现为:1、加工提呈抗原辅佐生成免疫,却因提呈差错引起病害;2、吞噬消毁病原异物,但会误伤正常组织和庇护某些病原体侵害;3、协同抗癌,亦可促瘤生长和转移;4、配合增强细胞及体液免疫,而又会抑制生成免疫力。提示应按具体情况区别看待巨噬细胞作用。

热休克/应激蛋白的特性及生理与免疫病理作用

热休克或应激蛋白是生物进化最保守的伴随细胞蛋白.本文概述了热休克或应激蛋白发现的缘由、产生原因及机制,列举其分类族别及产生的细胞类别,简介其管理细胞家务及参与抗原加工、提呈、免疫应答和细胞导航功能,协同病原体致病及抗感染免疫.模拟机体自身抗原引起免疫耐受及致使自身免疫病与肿瘤防护,γδT细胞与αβT细胞选择免疫激活机理.

正常人外伤脾多向混合淋巴细胞培养产生较高效价γ干扰素

三例正常人外伤猝死者,取其全脾细胞加无血清培养基作多向混合淋巴细胞培养,不加任何干扰素诱生剂,37℃5％CO_2中培育72h后,产生出γ干扰素(1FN-γ)的效价达10240IU/ml,比用一般诱生剂的产量高。这种多向混合淋巴细胞反应的转化率>48％。文中讨论了MLC产生IFN-Y的机理,多向MLC产生较高效价IFN-γ的原因以及与所谓混合淋巴细胸肿瘤细胞培养(MLTC)产生IFN的类型和过程的不同特点。

成纤维细胞介导的人白介素6基因疗法增强机体免疫功能的实验研究

通过研究成纤维细胞介导的人ＩＬ－６基因疗法对机体免疫功能的影响，结果发现，高分泌ＩＬ－６成纤维细胞克隆体内移植后，能显著提高淋巴细胞增殖反应、ＩＬ－２和ＩＦＮ－ｒ产生水平以及ＮＫ和ＬＡＫ细胞的杀伤活性，当与ＩＬ－２合用时，对ＮＫ和ＬＡＫ活性的增强作用更加明显，表明成纤维细胞能显著增强机体免疫功能，可望为肿瘤生物治疗、造血功能重建等开辟新的途径。

GM-CSF重组腺病毒扩增的骨髓树突状细胞体外经肿瘤抗原刺激后诱导抗肿瘤免疫应答

用ＧＭ－ＣＳＦ重组腺病毒感染小鼠骨髓细胞，观察扩增到的骨髓树突状细胞的生物学功能。结果表明，ＧＭ－ＣＳＦ重组腺病毒一次性感染骨髓细胞，１ｗ后能从一只小鼠股骨中扩增到２．４×１０６～３．３×１０６树突状细胞，扩增到的骨髓树突状细胞表达ＭＨＣ－Ⅱ、ＭＨＣ－Ⅰ、Ｂ７－１、Ｂ７－２和Ｉ－ＣＡＭ－１等免疫分子，分泌一定水平的ＧＭ－ＣＳＦ，对同种异体Ｔ细胞具有很强的刺激活性，体外经Ｂ１６肿瘤瘤苗刺激后免疫同系小鼠，能诱导出抗原特异性的ＣＴＬ活性，使免疫动物产生更强的保护性免疫反应，抵抗Ｂ１６细胞的攻击。提示可用ＧＭ－ＣＳＦ重组腺病毒从骨髓中扩增足够数量的树突状细胞，用于肿瘤的免疫治疗和基因治疗。

IL－3基因转染的肿瘤细胞增强机体免疫功能的实验研究

建立了ＩＬ－３基因转染的Ｂ１６小鼠黑素瘤细胞株（Ｂ１６－ＩＬ－３），发现其体内的致瘤性和肺转移能力明显下降。对其免疫机理作一探讨。结果发现接种Ｂ１６－ＩＬ－３细胞的小鼠脾细胞体外所诱生的ＬＡＫ活性和ＣＴＬ活性显著升高，外周血和脾细胞的ＣＤ４￣＋／ＣＤ８￣＋比值都有所升高；此外，在裸鼠体内，Ｂ１６－ＩＬ－３细胞的致瘤性也有一定程度的降低。结果表明ＩＬ－３基因转染的肿瘤细胞能诱导机体的特异性和非特异性免疫功能，参与机体的抗肿瘤作用。

白细胞介素4基因转移的肿瘤细胞体外生物学特性及体内致瘤性的研究

观察了白细胞介素４（ＩＬ－４）基因转移的肿瘤细胞体内致瘤性的变化。构建了含５００ｂｐ的小鼠ＩＬ－４ｃＤＮＡ的真核表达载体ＢＭＧＮｅｏ－ＩＬ－４．用该表达载体将ＩＬ－４基因转移至小鼠Ｂ１６黑色素瘤细胞，通过Ｇ４１８抗性筛选、有限稀释法及ＩＬ－４活性检测，获得了高分泌ＩＬ－４的黑色素瘤细胞克隆株并经Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹鉴定，将其接种于小鼠皮下后观察到肿瘤生长缓慢、小鼠存活期延长，表明高分泌ＩＬ－４的细胞克隆株体内致瘤性显著下降。该结果为进一步研究肿瘤的ＩＬ－４基因治疗打下了基础。

人G-CSF基因的克隆及其重组逆转录病毒载体的构建与初步应用

利用RT-PCR方法克隆到包括有全部编码序列和部分5',3'端非编码序列的人G-CSF cDNA,并通过核苷酸测序得到证实。将其定向克隆至逆转录病毒载体pLXSN、构建成人G-CSF的重组逆转录病毒表达载体pLGSN。体外经CRE和CRIP细胞的两欹包装，病毒滴度达到了临床应用的水平(1.1×10^6CFU／m1)。hG-CSF逆转录病毒感染NIH3T3小鼠成纤维细胞后．分泌G-CSF达168U／m1．Southern分析表明hG-CSF基因己整合至NIH3T3-G-CSF细胞的基因组中，Northern和Western分析分别从mRNA和蛋白质水平证实了人G-CSF在ENIH3T3-G-CSF细胞的表达。NIH3T3-G-CSF细胞植入同系小鼠体内．能从血清中检测到持续表达的G-CSF活性。本研究为开展人G-CSF基因治疗奠定了基础。

白细胞介素2基因转移的肿瘤细胞克隆的建立及其体内外生长特性的研究

为了开展ＩＬ－２基因转移后免疫原性增强的新型瘤苗抗肿瘤作用的研究，须首先获得ＩＬ－２基因转移后、能够高分泌ＩＬ－２的肿瘤细胞并确定其生长特性。本室构建了含５６３ｂｐ的小鼠ＩＬ－２全长ｃＤＮＡ的真核表达载体ＢＭＧＮｅｏ－ＩＬ－２，采用磷酸钙ＤＮＡ共沉淀法将ＢＭＧＮｅｏ－ＩＬ－２转移入Ｂ１６黑色素瘤细胞中，通过Ｇ４１８抗性筛选、有限稀释法及活性检测，获得一株高分泌ＩＬ－２（５０６Ｕ／ｍｌ）克隆，并经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹法证实ＩＬ－２基因已转入该克隆中。结果表明ＩＬ－２基因转移的肿瘤细胞体外生长能力没有明显变化，但体内致瘤原性显著下降，从而为制备新型瘤苗打下了基础。

成纤维细胞介导的IL-3基因疗法的体内IL-3水平及其增加外周血细胞数量的动态观察

为了更好地使IL-3在体内发挥其造血促进作用和免疫增强作用,于本实验中建立了IL-3基因疗法的小鼠模型;并动态观察了其外周血细胞数量的变化.通过基因转染、G418抗性筛选、有限稀释及IL-3活性测定,从16株NIH3T3成纤维细胞克隆中选出一株分泌IL-3高达2416U/ml的克隆株.将其移植入小鼠腹腔后,实验小鼠血清可检测出一定水平的IL-3并维持至半个月之久.实验小鼠外周血白细胞,特别是中性粒细胞数量显著增加,血小板也有不同程度的升高.该实验结果表明成纤维细胞途径能将IL-3基因携至体内进行有效表达并发挥显著的生物学作用.

成纤维细胞介导的人白细胞介素6基因疗法的建立及其体内白细胞介素6分泌水平的实验研究

细胞因子基因治疗是近年来生物治疗的重要进展。本文以人IL-6基因为治疗目的基因,以成纤维细胞为载体细胞,建立了人IL-6基因疗法的实验模型,并动态观察了其体内IL-6分泌水平.将650bp的人IL-6 cDNA 插入到携有Neo^R 基因的表达载体BCMGNeo 的Xho I 位点上,对此重组表达载体进行限制性酶切鉴定。用磷酸钙共沉淀法将BCMGNeo-IL-6转入NIH3T3成纤维细胞中,通过G418抗性筛选、有限稀释和上清中IL-6活性的测定,从多株阳性克隆中筛选到一株高分泌IL-6(184.6U/ml)的克隆株。对此阳性克隆进行了Southern 杂交分析。将此阳性克隆体外扩增、包裹入胶原中,然后移植入小鼠腹腔内,可从小鼠血清中(直至移植后15天)检测出IL-6,明成纤维细胞能成功地将IL-6基因导入体内并有效表达,证明该基因疗法是可行的。

IL－2基因转移的瘤苗与IL－1、低剂量环磷酰胺合用后的肿瘤治疗作用及其免疫学机理

经ＩＬ－２基因转移瘤苗治疗后荷瘤小鼠肺转移结节明显减少、存活期明显延长，与ＩＬ－１或低剂量Ｃｙ合用后，可使荷瘤小鼠的肺转移结节更少，存活期更长，特别是当ＩＬ－２基因转移的瘤苗、ＩＬ－１、低剂量Ｃｙ三者合用时抗肿瘤转移效果最强。对瘤苗治疗后荷瘤小鼠体内免疫功能的研究表明，小鼠脾脏ＣＴＬ活性、ＮＫ活性、ＩＬ－２导的ＬＡＫ活性均显著增强，脾脏细胞分泌ＩＬ－２和ＴＮＦ水平也显著升高，当与ＩＬ－１、低剂量Ｃｙ合用时，上述抗肿瘤免疫功能升高得更加明显，可见ＩＬ－２基因转移的瘤苗能通过有效地激活体内抗肿瘤免疫功能而具有显著的抗肿瘤转移效果，将其与ＩＬ－１或低剂量Ｃｙ联合应用时抗肿瘤效果更佳，当三者同时合用时抗肿瘤效果最佳。

瘤体内注射脂质体包裹的IL－2基因的抗肿瘤作用及其局部免疫机理分析

脂质体可以介导体内的细胞因子基因治疗。将脂质体包裹的ＩＬ－２基因直接注射到小鼠黑色素瘤（Ｂ１６－Ｆ１０）瘤体内，结果发现，肿瘤的生长明显受到抑制，部分小鼠的瘤体完全消退，存活期明显延长；从瘤体中分离的肿瘤细胞经Ｇ４１８筛选后产生阳性克隆，其上清中分泌有ＩＬ－２；肿瘤局部浸润性淋巴细胞（ＴＩＬ）具有较高的杀伤活性，揭示瘤体内注射脂质体包裹的ＩＬ－２基因后，可增强肿瘤细胞的免疫原性，激活瘤体局部的抗肿瘤免疫功能。结果表明瘤体内注射脂质体包裹的ＩＬ－２基因具有良好的抗肿瘤效果。

腺病毒介导IFN-γ基因转染的瘤苗体内抗肿瘤转移作用

通过缺陷型腺病毒载体的介导将小鼠ＩＦＮ－γ基因转染入肿瘤细胞，经５０００ｒａｄ６０Ｃｏ照射后制备成瘤苗，观察其对实验性肺转移荷瘤小鼠的治疗效果，并对其治疗作用的免疫机理进行了研究。结果显示：经ＩＦＮ－γ基因转移瘤苗治疗后荷瘤小鼠肺部转移结节明显减少，小鼠存活期明显延长。体内免疫功能检测表明；经ＩＦＮ－γ基因转染瘤苗治疗后小鼠脾淋巴细胞诱导的ＣＴＬ，ＬＡＫ及腹腔巨噬细胞杀伤活性均明显升高，但ＮＫ活性变化不明显。本实验表明：通过腺病毒载体的介导而制备的ＩＦＮ－γ基因转染瘤苗能有效地通过激活体内抗肿瘤免疫功能而对实验性黑色素瘤肺转移有显著的治疗效果。

脂质体介导的IL－2基因疗法的建立及其免疫增强作用

用反相蒸发技术制备出包裹有ＩＬ－２ＤＮＡ的脂质体，将其直接注射至小鼠腹腔中，经１０ｄ后发现，腹腔细胞体外培养的上清中含有较高水平的ＩＬ－２，腹腔巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的活性明显增强，脾细胞体外增殖、脾细胞ＮＫ活性及体外诱导的ＬＡＫ活性均明显高于对照组；同时经脂质体转染ＩＬ－２基因的脾脏细胞具有较高的内源性ＬＡＫ活性。这表明，脂质体能将目的基因经腹腔途径直接转染体内细胞，表达出基因产物──ＩＬ－２。这种靶细胞表达的基因产物可作用于体内免疫系统，调节机体的免疫功能。本文结果为细胞因子的基因治疗的研究提供了一种简便有效的方法。

TNF基因转染的肿瘤细胞体内诱导免疫细胞杀伤活性的研究

本文观察了小鼠接种高分泌ＴＮＦ－ａ的Ｂ１６黑色素瘤细胞（Ｂ１６－ＴＮＦ－ａ￣＋）后体内免疫细胞（包括ＣＴＬ、ＮＫ细胞、ＬＡＫ细胞以及腹腔ＭΦ）杀伤活性的变化。实验结果发现：接种Ｂ１６－ＴＮＦ－ａ￣＋后第１５天，小鼠脾细胞ＮＫ活性和诱导后的ＬＡＫ活性显著高于对照组，而经诱导后的ＣＴＬ杀伤活性则无显著变化；腹腔内巨噬细胞吞噬功能及杀伤活性也显著提高，但其Ｉａ抗原表达与对照组无显著差异。本实验的结果表明：高分泌ＴＮＦ－ａ的黑色素瘤细胞主要诱导并增强机体非特异性免疫细胞的抗肿瘤作用。

红细胞增强中性粒细胞吞噬作用及红细胞过氧化物岐化酶的临床意义

应用简易形态学法及化学发光法检测了几种疾病病人的红细胞增强中性粒细胞(PMN)吞噬作用的功能及过氧化物岐化酶(SOD)的活性。结果发现恶性肿瘤病人的红细胞这一功能明显低下。自身免疫病、感染等也明显降低,但与恶性肿瘤病人间差异有显著意义。肿瘤患者间差异无显著意义。红细胞内SOD变化与其一致。经治疗后,肿瘸病人红细胞的此项功能有明显回升。提示检测红细胞促吞噬功能这一指标对区别良恶性疾病及判定疗效均有一定价值。

TNF-α基因和IL-2基因共转染的肿瘤细胞体内致瘤性和瘤苗效果的观察

为了探讨两种具有协同作用的细胞因子共转染的瘤苗是否具有更好的抗肿瘤作用，我们将ＴＮＦ－α基因和ＩＬ－２基因转染Ｂ１６黑色素瘤细胞，获得同时分泌ＩＬ－２和ＴＮＦ的Ｂ１６细胞克隆株（命名为Ｂ１６－ＩＬ－２＋－ＴＮＦ－α＋细胞），并观察了其体内致瘤性和瘤苗效果。结果发现，Ｂ１６－ＩＬ－２＋－ＴＮＦ－α＋细胞的体内致瘤性显著低于ＴＮＦ－α基因或ＩＬ－２基因单独转染的Ｂ１６细胞；而且，事先接种Ｂ１６－ＩＬ－２＋－ＴＮＦ－α＋细胞的小鼠能抵抗再接种的野生型肿瘤细胞的生长，表明其具有更佳的瘤苗效果。

肿瘤浸润性淋巴细胞在IL-2培养前后的免疫学特性比较

本实验观察到,从瘤体中新鲜分离到的、未经IL-2培养的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)分泌IL-2、IFN-r、淋巴毒素(LT)的能力及其NK活性均显著低下,此种免疫功能低下状态可能与TIL在肿瘤微环境中受到肿瘤细胞释放的免疫抑制物质的作用有关而不是由于分离操作过程所致。经IL-2体外培养后。TIL分泌上述三种抗癌淋巴因子的能力和NK活性均显著提高,这表明IL-2可以解除TIL的免疫抑状态、使其免疫功能显著增强,也证明了IL-2激活的TIL除了能通过细胞间识别接触的方式直接杀伤肿瘤细胞外,还可通过分泌抗癌淋巴因子而间接杀伤肿瘤细胞。

肝细胞癌P53基因突变和蛋白表达的研究

为了阐明Ｐ５３肿瘤抑制基因突变在人肝细胞癌发生和发展中的作用，应用聚合酶链反应——单链构象多态性银染技术和ＤＮＡ直接测序法研究了肝细胞Ｐ５３基因的分子结构改变，结果表明：３１％（１３／４２例）的病例显示有Ｐ５３基因突变，低分化癌的突变率显著高于高／中分化癌的突变率（ｘ２检验，Ｐ＜０．０１），突变主要集中于外显子７和外显子８。免疫组织化学染色表明：４２例肝细胞癌中２２例有Ｐ５３蛋白的核内堆积（５１％），低分化癌、ＨＢｓＡｇ阳性病例和伴有肝硬化患者的Ｐ５３蛋白表达率显著高于高／中分化癌、ＨＢｓＡｇ阴性病例和不伴有肝硬化患者的Ｐ５３蛋白表达率（ｘ２检验，Ｐ＜０．０５）。此外，Ｐ５３基因突变和蛋白表达之间存在相关关系（ｘ２检验，Ｐ＜０．０１）。这些资料提示：导致Ｐ５３蛋白异常堆积的Ｐ５３基因突变是肝细胞癌的一种常见的分子结构改变，可能在肝细胞癌的发生和发展中起着重要的作用。