DAPK基因甲基化模式在白血病诊断中的价值初步研究

目的:筛选抑癌基因DAPK特异的甲基化模式并评价其作为白血病诊断分型标志物的价值。方法:通过亚硫酸氢盐测序法(BSP)分析DAPK基因启动子区Cp G岛在正常人外周血白细胞和HL-60、U937及Jurkat白血病细胞株中甲基化的状态及模式,选择特异的甲基化位点应用甲基化特异性PCR法(MSP)在白血病细胞株和患者外周血标本中验证DAPK基因异常甲基化模式诊断白血病的效能。结果:DAPK基因Cp G岛不同细胞基因组甲基化模式图谱显示,在正常细胞基因组中去甲基化程度高于白血病细胞株,各白血病细胞株甲基化模式存在差异,能找到特异的Cp G甲基化位点并应用MSP检测区分HL-60与其它3种细胞,而临床标本中MSP检测可区分急性非淋巴细胞白血病(ANLL)与其他类型白血病,其诊断的灵敏度、特异度和准确度分别为59.1%、100%和82.7%,没有发现MSP甲基化诊断与临床病理分型之间的关系。结论:DAPK基因启动子区异常甲基化模式作为白血病诊断分型的潜在肿瘤标志物之一,丰富了白血病诊断的方法,为今后寻找各类肿瘤甲基化标志物提供了思路并奠定了研究基础。

基于应用型本科人才培养目标的病理学实验教学改革

病理学具有很强的实践性,实验教学作为病理学教学的重要部分,是培养学生逻辑思维、提高临床实践和创新能力的必要途径。探讨传统实验教学过程中存在的不适应社会发展和医学人才培养需求的问题,改革和优化病理学实验教学,是提高病理学实验教学质量、培养合格应用型本科医学人才的有效手段。

以应用型人才培养为中心的病理学实验教学优化与改革

病理学实验教学是培养医学生病理诊断思维,提高临床实践技能和创新能力的重要途径。目前病理学实验教学中存在教学方法单一、内容陈旧、学习资源匮乏、专业特色不突出等问题,不能满足应用型医学人才培养要求。因此需要在实验教学方法、手段、内容等方面进行优化与改革,以提高病理学实验教学质量,培养应用型人才。

3种白血病细胞株中P73、DAPK、O^6 MGMT和CDH1基因启动子区CpG岛甲基化模式分析

目的分析3种白血病细胞株中P73、DAPK、O6MGMT和CDH1基因启动子区Cp G岛甲基化模式。方法运用亚硫酸氢盐测序法分析P73、DAPK、O6MGMT和CDH1抑癌基因启动子区Cp G岛在健康人外周血白细胞(正常对照)和U937、HL-60及Jurkat白血病细胞株中甲基化状态,绘制其甲基化图谱,并应用甲基化特异性PCR法在不同细胞中进行验证。结果正常对照、U937、HL-60及Jurkat基因组甲基化率分别为7.26%(238/3 279)、61.33%(1 813/2 956)、89.35%(3 090/3458)、58.10%(1 342/2 310),白血病细胞株与正常对照比较,P均<0.01。P73基因可鉴别正常细胞和肿瘤细胞,DAPK基因可区分开肿瘤细胞HL-60、U937及Jurkat,O6MGMT可进一步把U937与Jurkat区分开。结论 P73、DAPK、O6MGMT和CDH1基因具有特异的甲基化模式,通过3次MSP检测能将正常细胞和白血病细胞株进行鉴别。

DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐修饰方法的改进与评价

目的:建立一种快速便捷的亚硫酸氢盐修饰DNA方法用于DNA甲基化检测。方法:提高亚硫酸氢盐浓度及修饰温度、缩短修饰时间并用玻璃奶回收DNA改进DNA修饰方法,用亚硫酸氢盐测序法分析MAGE-A3基因和DAP-K基因目的片段中胞嘧啶转化为胸腺嘧啶的效率,评价改进方法与传统方法、试剂盒方法对DNA的修饰效果。结果:改进的方法可将操作过程缩短到3 h左右;非甲基化的胞嘧啶到胸腺嘧啶的转化率超过99%,与传统方法、试剂盒方法相比差异无统计学意义(χ~2=0.0564,P>0.05);只针对非甲基化的胞嘧啶进行转化修饰,而在对甲基化胞嘧啶过度修饰为胸腺嘧啶方面与传统方法无统计学差异(χ~2=0.0149,P>0.05)。结论:改进的亚硫酸氢盐DNA修饰方法修饰效率高,对甲基化的胞嘧啶过度修饰影响不显著,且具有节省时间,操作简便等优点。

黄芪提取物对大鼠心肌梗死后心肌组织PKD1蛋白表达的影响

目的探讨黄芪提取物对大鼠心肌梗死后心肌组织蛋白激酶D1(PKD1)蛋白表达的影响。方法成功构建大鼠心肌梗死模型后,随机分为模型组、黄芪提取物3个不同剂量组,每组8只大鼠,另设假手术组8只。术后48 h,黄芪提取物组分别给予低、中、高10,20,40 mg.(kg.d)-1灌胃;模型组和假手术组给予生理盐水20 ml.(kg.d)-1灌胃。8周后测定大鼠的血流动力学变化;应用HE染色分析左心室心肌细胞组织形态学变化;采用Masson染色法检测左心室心肌胶原纤维变化;应用免疫组化法和免疫印迹法分析左心室心肌组织PKD1蛋白的表达情况。结果血流动力学检测结果表明,和模型组相比,假手术组、各治疗组心脏左室收缩压(LVSP)、左室内压曲线最大上升和下降速率(±dp/dt)均明显升高(P<0.05),左室舒张末压(LVEDP)均明显降低(P<0.05)。HE染色分析,模型组大鼠心肌细胞坏死严重,成纤维细胞增生明显,伴有炎症细胞浸润;黄芪提取物低、中剂量组大鼠心肌细胞淡染,界限欠清晰,部分细胞核肥大,伴有成纤维细胞增生和少量炎症细胞浸润;高剂量组大鼠心肌细胞形态较清晰,成纤维细胞和炎症细胞少见。Masson染色表明,模型组大鼠心肌以胶原组织为主,各治疗组大鼠以红色心肌组织为主,间杂以胶原组织。免疫组化和免疫印迹分析表明,模型组大鼠心肌组织胞质中PKD1蛋白的表达明显;和模型组相比,各治疗组大鼠心肌细胞胞质中PKD1蛋白的表达明显下调(P<0.05),但仍清晰可见。结论黄芪提取物可明显改善大鼠心肌梗死后异常的血液流变学指标、组织病变及胶原纤维构成比例,其作用机制可能与下调心肌组织PKD1蛋白的表达相关。

蛋白激酶D1在大鼠骨髓源性内皮祖细胞中的促血管新生作用

目的探讨蛋白激酶D1(PKD1)对大鼠骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)黏附、迁移、增殖、血管形成能力及内皮型一氧化氮合成酶(e NOS)表达的影响。方法体外培养、分离和鉴定大鼠骨髓源性EPCs,观察PKD1及其特异性阻断剂CID755673对EPCs的黏附、迁移、增殖、血管形成能力的影响,以及对EPCs中e NOS的mRNA表达和蛋白表达的影响。结果 EPCs体外细胞培养实验表明,PKD1可明显促进EPCs的黏附、迁移和增殖,提升EPCs的血管形成能力,上调EPCs中e NOS的mRNA表达和蛋白表达水平。结论 PKD1具有调控EPCs促血管新生的作用,其促血管新生的作用可能以一种依赖e NOS的方式进行。

黄芪提取物对大鼠骨髓源性内皮祖细胞的作用

目的探讨黄芪提取物对大鼠骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)黏附、迁移、活力、血管形成能力及内皮型一氧化氮合成酶(e NOS)表达的影响。方法体外培养、分离和鉴定EPCs,设10-4、10-3、10-2g/L黄芪提取物组和对照组。倒置显微镜下观察并比较各组EPCs黏附、迁移、血管形成能力的差异;MTT法检测EPCs的活力变化;RT-PCR法检测EPCs中e NOS m RNA的表达;Western blot检测EPCs中e NOS蛋白的表达。结果与对照组相比,不同浓度黄芪提取物组促EPCs黏附、迁移、血管形成能力均显著增强,且呈浓度依赖性(F值分别为15.256、13.633、97.549,均P<0.05);EPCs的活力显著增加,呈时间(F时间=9.755)和浓度依赖性(F组间=10.018);且EPCs中e NOS m RNA和蛋白的表达水平均明显升高,呈浓度依赖性(F值分别为56.356、77.125,均P<0.05)。结论黄芪提取物具有调控EPCs促血管新生的作用,该作用可能与上调e NOS的表达水平密切相关。

益气养阴化浊通络方对糖尿病肾病大鼠转化生长因子-β1/Smads信号通路的影响

目的观察益气养阴化浊通络方对糖尿病肾病(DN)大鼠转化生长因子(TGF)-β1/Smads信号通路的影响,探讨其对DN的作用机制及治疗效果。方法选择50只健康雄性SD大鼠,随机分为正常组10只,造模组40只。造模组大鼠接受单侧肾切除手术2 w后,给予高糖高脂饮食4 w,再加用小剂量链脲佐菌素(30 mg/kg)腹腔注射,造模组在DN模型成模后,随机分为模型组、中药组、西药组。中药组给予益气养阴化浊通络方煎剂,西药组给予贝那普利,治疗8 w后处死大鼠。测定血糖、24 h尿蛋白定量、血尿素氮及肌酐的变化,同时检测肾组织TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白的表达。结果与模型组相比,中药组血糖、24 h尿蛋白量、血尿素氮及肌酐均显著降低(P<0.01),TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表达下调,Smad7蛋白表达增强(P<0.05,P<0.01)。结论在DN大鼠模型中,益气养阴化浊通络方能够改善肾功能,保护肾组织,调节TGF-β1/Smad信号通路是其作用机制之一。

蛋白激酶D1促血管新生的体内外实验分析

目的:探讨蛋白激酶D1(PKD1)促血管新生的作用,为心肌梗死等缺血性疾病以PKD1为治疗靶点提供新的思路。方法:体外培养、分离和鉴定内皮祖细胞(EPCs),观察PKD1及其特异性阻断剂CID755673对EPCs中血管内皮生长因子(VEGF)及其受体KDR表达的影响。复制大鼠心肌梗死模型,分析PKD1及CID755673干预对大鼠心肌梗死后受损心肌组织病理形态学、微血管和内皮细胞变化以及VEGF、KDR表达的影响。结果:EPCs体外细胞培养实验表明,PKD1可明显上调EPCs中VEGF和KDR的表达水平。大鼠心肌梗死动物实验结果表明,PKD1干预后的大鼠心肌组织排列较为有序,结构较为清晰,内皮细胞胞膜光滑、完整,周细胞可见,心肌组织中的VEGF和KDR表达水平显著上调。结论:PKD1有明显的促血管新生作用,该作用可能是通过VEGF介导而实现的。

丹参提取物促大鼠心肌梗死后心肌组织血管新生的作用

目的:观察丹参提取物对大鼠心肌梗死后心肌组织血管新生的作用并分析其可能的机制。方法:采用经典的冠状动脉左前降支结扎造模方法成功复制大鼠心肌梗死模型后,随机将大鼠分为模型组以及丹参提取物低(10 mg·kg-1·d-1)、中(20 mg·kg-1·d-1)、高(40 mg·kg-1·d-1)剂量治疗组,另设假手术组大鼠为对照组,各组大鼠数量均为8只。丹参提取物各治疗组给予上述对应的各药物剂量灌胃给药,模型组及对照组大鼠给予等量的生理盐水灌胃,连续饲养4周后应用HE染色、Masson染色和电镜法观察大鼠左心室心肌组织和血管结构病理成分变化,免疫组化染色分析心肌组织中血管内皮生长因子(VEGF)及CD34蛋白的表达变化。结果:组织病理学分析表明,与假手术组相比,模型组大鼠心肌组织形态较为紊乱,部分心肌细胞轮廓消失,坏死心肌组织呈现明显的纤维化,血管不完整,血管超微结构模糊或者消失;丹参提取物治疗之后,新生的血管数量明显增多,且超微结构分析表明,内皮细胞形态相对完整。心肌组织中VEGF及CD34蛋白表达结果证实,模型组较假手术组大鼠表达略有增加,但没有统计学差异;和模型组比较,丹参提取物各治疗组VEGF及CD34蛋白表达明显增多(P<0.01)。结论:丹参提取物可明显促进大鼠心肌梗死后心肌组织的血管新生。

温肾醒脑方对血管性痴呆大鼠认知功能和神经干细胞增殖的影响

目的:探讨温肾醒脑方对VD模型大鼠学习记忆功能、神经干细胞增殖及b FGF基因表达的影响,阐明温肾醒脑方益智醒脑开窍的机理。方法:采用"劳倦过度、房室不节"法、高脂饮食法以及反复性脑缺血再灌注结合降压法复制肾(阳)虚痰瘀型VD模型,将动物随机分为正常组、假手术组、模型组、温肾醒脑方组(中药组),于造模后1 d、30 d处死动物,评价动物的认知功能,免疫组织化学法观察nestin阳性细胞,ELISA和RT-PCR检测b FGF表达水平。结果:造模后动物逃避潜伏期明显延长,中药治疗组与模型组相比较,逃避潜伏期时间明显缩短差异具有统计学意义(P<0.05);中药组与假手术组相比,差异无显著性(P>0.05)。正常大鼠海马和皮层有少量nestin阳性细胞,造模后假手术组、模型组和中药组大鼠nestin阳性细胞数稍有增加,差异无统计学意义(P>0.05);30天后模型组、假手术组与正常组nestin阳性细胞数基本相近,差异无统计学意义(P>0.05),中药治疗组在海马与皮层均有显著增加,与正常组、模型组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。正常组脑组织有低水平b FGF蛋白和基因表达,造模后模型组、假手术组与中药治疗组表达增强,中药治疗组、模型组与正常组相比差异有统计学意义(P<0.05),但两组间差异无统计学意义(P>0.05);中药治疗组b FGF水平维持在比较高的水平,而模型组基本恢复到正常组水平,中药治疗组与模型组、正常组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:温肾醒脑方能促进认知功能的恢复,增强VD大鼠神经干细胞增殖和b FGF表达,是其益智醒脑开窍的可能机理。

温阳化浊通络方对系统性硬化病小鼠体内血管内皮生长因子、结缔组织生长因子与内皮素-1水平的影响

为探讨温阳化浊通络方对系统性硬化病(SSc)小鼠血清中VEGF、CTGF与ET-1水平的影响,运用ELISA法检测小鼠血清中VEGF、CTGF、ET-1的含量。将SPF级C3H/He小鼠75只,造模成功后随机分为正常组、PBS组、模型组。正常组为每天胃内灌注等量生理盐水;PBS组为PBS 0.1 mL/d,连续皮下注射3周,每天胃内灌注等量生理盐水;模型组为每天胃内灌注等量生理盐水;模型+温阳化浊通络方组为每天胃内灌注等量温阳化浊通络方煎;模型+XAV939组为每天给以XAV939(10mg/kg,i.p)。结果:模型+温阳化浊通络方组和模型+XAV939组精神恢复良好、体重增加、背部表皮较硬、出现少数毛囊,血清中VEGF、CTGF、ET-1的含量均有所下调,两组比较无统计学差异(P>0.05);与模型组相比差异明显(P<0.01)。说明温阳化浊通络方可调控SSc小鼠血清中VEGF、CTGF与ET-1的表达,改善皮肤纤维化的病理损伤,阻止纤维化进展。

丹参提取物对大鼠心肌梗塞后心肌组织PKD1表达的影响

目的探讨丹参提取物对大鼠心肌梗塞后心肌组织PKD1表达的影响。方法成功构建大鼠心梗模型后,随机分为模型组、丹参提取物3个不同剂量组,每组8只大鼠,另设假手术组8只。术后48 h,丹参提取物组分别给予低、中、高10,20,40 mg/(kg·d)灌胃;模型组和假手术组给予生理盐水20 ml/(kg·d)灌胃。8周后应用HE染色分析左心室心肌细胞组织形态学变化;采用Masson染色法检测左心室心肌胶原纤维变化;反转录PCR(RT-PCR)法测定蛋白激酶D1(PKD1)mRNA的表达。应用免疫组化法分析左心室心肌组织PKD1蛋白的表达情况。结果 HE染色分析,模型大鼠心肌细胞出现大片坏死,成纤维细胞增生明显,伴明显炎性细胞浸润;丹参提取物低、中剂量组大鼠,心肌细胞淡染,轮廓较为模糊,部分细胞核肥大,排列较为杂乱,伴有老化的肉芽组织和少量炎症细胞浸润;丹参提取物高剂量组大鼠心肌细胞形态较清晰,成纤维细胞增生明显减轻。Masson染色结果表明,模型组大鼠心肌中大片的胶原组织取代了正常的心肌组织,丹参提取物各剂量组大鼠以红色心肌组织为主,间杂以胶原组织。RT-PCR结果表明,和模型组相比,丹参提取物各剂量组PKD1 mRNA的表达均明显降低(P<0.05)。免疫组化分析结果表明,模型组心肌组织胞浆中PKD1蛋白的表达十分丰富;和模型组相比,丹参提取物各剂量组心肌组织胞浆中PKD1蛋白的表达明显下调(P<0.05)。结论丹参提取物可能通过下调PKD1的表达而改善心肌梗塞后的心肌组织病变。

益气养阴化浊通络方对早期糖尿病肾脏疾病患者内皮细胞及血液流变学的影响

观察益气养阴化浊通络方对早期糖尿病肾脏疾病(DKD)患者内皮细胞及血液流变学的影响,以70例早期DKD患者随机分组,对照组(35例)采用DKD常规治疗,治疗组(33例)在常规治疗基础上加用益气养阴化浊通络方,疗程12周。采用酶联免疫吸附法检测治疗前后2组患者血浆血管性血友病因子(v WF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平;血流变仪检测纤维蛋白原(PF)、全血高切黏度(HBV)、全血低切黏度(LBV)、血浆黏度(PV)、红细胞刚性指数(TK)等血液流变学指标;同时观察UP、SCr、UAER的变化。结果是两组治疗后UP、SCr、UAER、v WF、VEGF水平均较治疗前明显降低(P<0.05,P<0.01);且治疗组UP、SCr、UAER、VEGF水平降低更明显(P<0.05)。同时两组治疗后PF、LBV、PV、TK水平较治疗前明显降低(P<0.05,P<0.01);HBV、LBV、PV水平降低更明显(P<0.05)。说明益气养阴化浊通络方能够减轻内皮细胞的损伤,改善血流变,从而降低蛋白尿,改善肾功能。

解毒祛瘀滋阴法对系统性红斑狼疮发病中CD28/B7表达的影响

目的:探讨CD28/B7在系统性红斑狼疮(SLE)发病中的作用及解毒祛瘀滋阴法治疗SLE的分子免疫学机制。方法:63例SLE患者随机分为两组:西医组(32例)采用强的松、环磷酰胺治疗;中西医结合组(31例)采用解毒祛瘀滋阴法联合强的松、环磷酰胺治疗,均治疗3个月。另选20例健康女性作为正常对照。运用流式细胞仪检测外周血单个核细胞(PBMC)表面CD28、B7-1、B7-2的表达水平。结果:与正常对照组比较,治疗前不同病情SLE患者PBMC表面CD28的表达水平均显著降低(P<0.05或P<0.01),而B7-1和B7-2的表达明显增加(P<0.01)。治疗后中西医结合组能显著降低B7-1、B7-2的表达(P<0.05,P<0.01),升高CD28的表达(P<0.01),且B7-2分子的改善优于治疗后西医组(P<0.05)。同时SLE患者PBMC表面B7-2分子表达水平与SLE病情活动指数呈直线正相关(r=0.76,P<0.01);B7-1及CD28与SLEDAI无明显相关性。结论:CD28/B7共刺激途径在SLE的发生和发展过程中起着重要作用,通过影响CD28/B7共刺激信号传导可能是解毒祛瘀滋阴法治疗SLE的机理之一。

应用型中医学实验教学示范中心体系的构建

总结了南阳理工学院中医学实验教学示范中心的建设经验。该中心建设了良好的实验教学软硬件平台和较完善的管理体系;提出"通过导趣,引导学生乐学;通过导思,引导学生活学;通过导做,引导学生善学;通过导法,引导学生会学"的新型教学模式;创建了"3333"实验教学模式,建立了校、院两级管理体制,完善了实验软硬件平台建设,整合了实验教学课程及内容体系,促进了中医学实验教学和科学研究的发展。

黄芪提取物对血管紧张素Ⅱ致培养乳鼠心肌细胞肥大的影响

目的研究黄芪提取物对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)致心肌细胞肥大的影响及蛋白激酶D1(PKD1)基因转录表达的影响。方法乳鼠心肌细胞原代培养,复制AngⅡ致心肌细胞肥大模型后,随机分为正常对照组、模型组、缬沙坦(Val)对照组、黄芪提取物3个不同剂量组。正常对照组不加入任何药物;模型组加入终浓度为10-6g.L-1AngⅡ;Val组在模型组的基础上加入终浓度为10-6g.L-1的Val;黄芪提取物组在模型组的基础上加入低、中、高剂量(10-4,10-3,10-2g.L-1)的黄芪提取物。光镜下进行心肌细胞计数和直径测定,Bradford法测定心肌细胞蛋白质含量,反转录PCR(RT-PCR)法测定PKD1 mRNA的表达。结果和正常对照组相比,模型组心肌细胞数量上变化不大,心肌细胞直径、总蛋白质含量及PKD1 mRNA表达明显增加(P<0.05);和模型组相比,Val组及黄芪提取物中、高剂量组心肌细胞直径、总蛋白质含量及PKD1 mRNA表达均明显降低(P<0.05)。结论黄芪提取物可能通过下调PKD1 mRNA的表达而显著抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。

河南南阳城市与乡村成年人肥胖相关指数的年龄分布特征

目的：利用身体肥胖指数了解河南南阳地区城市与乡村成年人超重与肥胖现状。方法：随机抽取南阳市区及周边乡村居民，测量身高、体重、腰围（wc）、臀围，计算体质量指数（BMI）、腰臀比（WHR）与腰高比（WHtR），并作统计分析。结果：30岁以上城市及乡村居民组，BMI处于超重状态；超过60岁的城市男性组与50岁以上的女性组WC和WHR符合肥胖标准：城市30岁以上组与乡村50岁以上组的男性WHtR符合肥胖标准，40岁以上组城市与乡村女性都符合肥胖标准。城市男性BMI、WC、WHR、WHtR大于乡村男性（JP〈0．01）。BMI与WC在50。岁组，城市女性大于乡村女性（P〈0．01）；WHR在大于60岁组，乡村女性大于城市女性（P〈0．01）。结论：南阳地区无论是城市还是乡村肥胖情况均较严重，尤其在50岁以上年龄的人群．需着重进行健康教育。

反向点杂交检测肝癌细胞DNA甲基化方法的建立

目的建立反向点杂交(RDB)检测DNA甲基化的方法,并应用于临床肝癌细胞MAGE-A3 5'端CpG位点异常甲基化的检测。方法亚硫酸氢盐修饰后聚合酶链式测序分析细胞株Hep G2和外周血白细胞DNA的甲基化模式差异,建立RDB检测DNA甲基化方法,进行方法学评价,并运用于临床肝癌病理组织标本、肝硬化组织标本和正常对照组。结果 RDB检测肝癌细胞MAGE-A3 5'端CpG位点异常甲基化的灵敏度、特异度和准确性分别是83%(25/30)、100%(60/60)和94%(85/90)。其与临床肝癌诊断金标准的检验结果一致性较好(Kappa=0.870,P<0.05)。结论建立了RDB检测肝癌细胞DNA异常甲基化的方法,并可用于肝癌的临床早期诊断。