琼脂糖凝胶的合适浓度对于回收酶切后质粒载体的重要性

目的:探讨琼脂糖凝胶的不同浓度对回收不同大小的酶切后质粒载体纯度的影响。方法:将2种质粒载体酶切,并经不同浓度的琼脂糖凝胶电泳分析,通过比较酶切前和酶切后载体的相对位置,研究胶浓度对回收酶切后载体纯度的影响。结果:不同浓度的琼脂糖凝胶中,酶切前和酶切后载体的相对位置会发生变化,对能否成功回收到纯度高的酶切后DNA片段有重要影响;质粒大小不同,胶浓度的影响也不同。结论:合适的胶浓度对于回收酶切后质粒载体具有重要意义,应选择合适的胶浓度回收酶切后质粒载体。

CHMP4A真核表达载体的构建及其对肾透明细胞癌的影响

背景肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)的靶向治疗可显著改善晚期ccRCC患者的预后,寻找新的治疗靶标可为开发新型治疗药物提供依据。目的构建真核表达载体pcDNA3.0-Flag-CHMP4A。在体外细胞实验中检测CHMP4A对ccRCC 786-O细胞增殖和迁移的影响,分析CHMP4A在ccRCC中的表达及对ccRCC患者预后的影响。方法利用PCR技术从乳腺文库中扩增目的基因CHMP4A,通过同源重组将CHMP4A与载体pcDNA3.0连接。786-O细胞转染pcDNA3.0-Flag-CHMP4A后,Western blot方法检测CHMP4A的蛋白表达,CCK-8、克隆形成及划痕实验检测CHMP4A对786-O细胞增殖和侵袭的影响。检索TCGA数据库中ccRCC转录组数据,分析CHMP4A在肿瘤不同分期、分级和淋巴细胞转移组中的表达,应用Kaplan-Meier法分析CHMP4A表达与ccRCC预后的关系。结果成功构建了pcDNA3.0-Flag-CHMP4A真核表达载体,并在786-O细胞中成功表达,体外实验发现Flag-CHMP4A可抑制ccRCC 786-O细胞的增殖和迁移(P<0.05);TCGA数据库显示,CHMP4A是mRNA表达水平与ccRCC患者的分期、分级及淋巴结转移强相关(P<0.01)。CHMP4A高表达组有较长的无病生存期和总生存期(P<0.01)。结论CHMP4A在抑制肿瘤细胞增殖和迁移中发挥了重要作用,其表达与ccRCC患者的预后呈正相关。本研究为ccRCC的治疗提供了潜在靶标。

利用染色质结构检测技术研究乳腺癌易感蛋白BRCA1转录激活区突变

乳腺癌易感基因BRCA1突变引起的遗传性乳腺癌占 4 0 %～ 5 0 % ,其突变引起的遗传性乳腺癌和卵巢癌的比例至少为 80 %。许多乳腺癌易感突变发生在BRCA1C末端转录激活结构域 (15 6 0～ 186 3aa) ,但该区域大部分突变导致何种表型 (良性多态性或乳腺癌易感突变 )目前还不清楚。由于染色质结构调节是基因转录调节的早期事件 ,该文基于lac阻遏物识别和结合lac操纵基因的原理 ,利用染色质结构检测技术比较BRCA1转录激活结构域不同突变体与野生型的染色质伸展活性。将 1种野生型、2种良性多态型 (S16 13G和M16 5 2I)和 4种乳腺癌易感突变型(A170 8E、M1775R、W1837R和Y185 3term)转录激活区片段以正确相位融合于lac阻遏物的下游 ,得到野生型重组质粒pwt和pS16 13G、pM16 5 2I、pA170 8E、pM1775R、pW1837R及pY185 3term 6种突变型重组质粒。Westernblot检测表明 ,这些重组质粒分别转染AO3-1细胞后均表达了相应的融合蛋白。对这些重组质粒的染色质伸展活性检测表明 ,野生型pwt和两种良性多态性突变体不具有染色质伸展活性或只有极微弱的染色质伸展活性 ,而其他 4种乳腺癌易感突变体均具有过强的染色质伸展活性 ,提示利用染色质伸展技术可预测BRCA1转录激活区基因型与乳腺癌发生风险的表现型的关系。

乳腺癌易感蛋白BRCA1的BRCT1结构域染色质伸展活性的定位

乳腺癌易感基因BRCA1(Breastcancersusceptibilitygene 1)在乳腺癌的发生、发展中起重要作用。BRCA1C末端含有 2个BRCT结构域 (BRCT1和BRCT2 ) ,许多乳腺癌易感突变发生在BRCA1的BRCT结构域中。利用染色质结构检测技术表明 ,BRCT结构域具有染色质伸展活性。本文利用缺失突变技术构建了 6种BRCT1结构域 (16 42 1736aa)缺失突变体并将BRCT1结构域中与染色质伸展相关的重要区域定位到 16 91 172 1之间的氨基酸残基 ;用丙氨酸扫描技术构建了 10种BRCT1结构域丙氨酸扫描突变体并将重要氨基酸残基序列定位到 170 7 1711之间的IAGGK。利用定位的重要区域进行Blast分析 ,结果找到一新型同源蛋白质。BRCT1结构域的定位有助于预测BRCT1结构域突变后发生乳腺癌的风险 。

人肺癌细胞cDNA表达文库的构建

用磁珠从肺癌细胞株Ａ５４９中直接分离ｍＲＮＡ。以随机六聚体为引物，在Ｍ－ＭＬＶ反转录酶作用下，合成ｃＤＮＡ第一链，在ＲＮａｓｅＨ和ＤＮＡ聚合酶的共同信息处理上合成双链ｃＤＮＡ，经Ｔ４ＤＮＡ聚合使其末端平齐化后，连接到经ＥｃｏＲＩ酶切后消平的质粒表达载体中，电击转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α。

人肺癌细胞CPP32基因的克隆及表达

蛋白酶尤其是ＩＣＥ家族的蛋白酶是细胞死亡机制的核心成分．ＩＣＥ蛋白酶家族中，ＣＰＰ３２（又称Ｙａｍａ，ａｐｏｐａｉｎ）在不同形式的凋亡途径中起核心作用．为深入研究ＣＰＰ３２的结构与功能，克隆了ＣＰＰ３２基因，并在大肠杆菌中进行了表达．采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从人肺癌细胞株中获得了ＣＰＰ３２蛋白酶基因．ＤＮＡ序列分析表明，该基因由已报道的编码ＣＰＰ３２αｐ２０亚单位和ＣＰＰ３２βｐ１０亚单位的核苷酸组成，提示ＩＣＥ家族蛋白酶寡聚化可能受ＤＮＡ水平调控．将获得的ＣＰＰ３２基因分别重组到ｐＢＶ３２１和ｐＥＸ３１Ｂ载体上，并分别转化到大肠杆菌中，均获得了ＣＰＰ３２基因的较高表达，表达产物主要以包涵体形式存在．

不同剂量rhGM-CSF cDNA直接注射小鼠骨骼肌的表达

将表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的重组真核表达质粒(pCG1),以30μg和60μg的剂量分别直接注射小鼠骨骼肌,观察不同剂量的质粒(pCG1)在小鼠体内分泌表达rhGM-CSF的情况。ELISA检测表明,注射60μg质粒DNA的小鼠血液中测得的rhGM-CSF含量与对照组相比有显著差别,而注射30μg质粒DNA的小鼠血液中rhGM-CSF含量与对照组相比无显著差别。以60μg质粒DNA直接注射骨骼肌后第15～20天左右表达量最高,平均约91ng/ml。生物学活性检测结果显示,注射60μg质粒DNA的小鼠血液能维持GM-CSF依赖的TF-1细胞的生长。这提示用质粒DNA直接注射小鼠骨骼肌时,质粒DNA必须达到足够的量。

重组人GM-CSF/MCAF融合蛋白的变性、复性及纯化研究

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和单核细胞趋化激活因子(MCAF)融合蛋白在大肠杆菌中高效表达后,表达产物以包涵体形式存在。包涵体经分离和洗涤后,探索了rhGM-CSF/MCAF变性和复性的合适条件。复性后的样品经Sephadex G-75凝胶过滤和CM-Sepharose FF离子交换两步层析,得到了具有生物学活性的SDS-PAGE纯的rhGM-CSF/MCAF。Western blot检测表明,纯化的rhGM-CSF/MCAF能分别与GM-CSF和MCAF抗体发生特异反应。

以融合蛋白形式在大肠杆菌中表达人MCP－1

将编码人单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体ｐＥＸ３１Ａ中，在大肠杆菌中表达出ＭＳ２／ＭＣＰ－１融合蛋０白，该表达产物约占菌体总蛋白的１５％左右，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表明，表达产物可与ＭＣＰ－１抗体特异反应。采用琼脂糖平板法进行活性测定表明，表达产物具有明显的单核细胞趋化活性，说明Ｎ端融合一段细菌蛋白对ＭＣＰ－１有无趋化活性可能没有影响。

p21基因的克隆及其对肺癌细胞生长的抑制

用反转录ＰＣＲ从正常人胚胎肺细胞中获得了ｐ２１基因ｃＤＮＡ，将其插入真核表达载体ｐＭＳＣＶｎｅｏ，构建成重组质粒，ｐＭＳ２１，并将其转染至肺癌细胞株Ａ５４９．通过集落形成观察到ｐ２１对肺癌细胞具有明显的抑制作用，经ＲＮＡ狭缝杂交、Ｗｅｓｔ－ｅｒｎｂｌｏｔ分析和免疫细胞化学实验证实这是ｐ２１表达的结果．荷瘤裸鼠实验也进一步证实了ｐ２１对肺癌细胞具有明显的抑制作用．为ｐ２１的深入研究提供了基础．

人趋化细胞因子超家族研究进展

人趋化细胞因子超家族是由分子量８～１８ＫＤ小分子蛋白组成的一大类细胞因子，主要由白细胞分泌，具有对中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性细胞的趋化和激活活性，在机体防御、抗感染抗肿瘤等方面起重要作用。因此，对趋化细胞因子超家族成员的结构和功能研究具有较大的理论和应用价值。

人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的研究进展

巨噬细胞是与免疫活动直接相关的一类细胞,它在引起和调节免疫反应中起着重要作用。大多数巨噬细胞是由进入组织中的单核细胞转变而来,单核细胞发生于骨髓中的造血干细胞,当单核细胞进入血液后,经血细胞渗出作用而通过血管壁,进而迁移到组织内分化成巨噬细胞。单核细胞的迁移是一个十分复杂的过程,其中趋化因子在该过程中起着重要作用。

乳腺癌易感蛋白BRCA1的BRCT2结构域染色质伸展活性的定位

40 %～ 5 0 %的遗传性乳腺癌和至少 80 %的既有乳腺癌又有卵巢癌家族史的患者是由BRCA1突变引起的 .BRCA1C末端含有 2个BRCT结构域 (BRCT1和BRCT2 ) ,它们与BRCA1的重要功能密切相关 .许多乳腺癌易感突变发生在BRCA1的BRCT结构域中 .利用染色质结构检测技术表明 ,BRCT结构域具有染色质伸展活性 .利用缺失突变技术构建了 6种BRCT2结构域 (175 6～ 185 2位氨基酸残基 )缺失突变体并将BRCT2结构域中与染色质伸展相关的重要区域定位到 175 6～ 180 8之间的氨基酸残基 ;用丙氨酸扫描技术构建了 6种BRCT2结构域丙氨酸扫描突变体并将重要氨基酸残基序列定位到 1784～ 1788之间的VQLCG .BRCT2结构域的定位有助于预测BRCT2结构域突变后发生乳腺癌的风险 ,也为进一步研究BRCT2结构域的功能机制提供了有用的材料 .

白血病细胞中新型G_sα缺失体与CPP32的相互作用(英文)

CPP32/Yama/Apopain/Caspase-3在不同形式的细胞凋亡途径中起核心作用。目前发现,CPP32可切割多种底物,但以CPP32为引诱蛋白用酵母双杂交系统分离与其相互作用的分子方面的研究,在国内外尚未见报道。为进一步了解肿瘤细胞信号转导途径,本文用该系统筛选与CPP32(作为引诱蛋白)相互作用的蛋白质。将CPP32引诱蛋白表达载体和肿瘤细胞文库质粒导入到酵母细胞HF7C中,用Trp-Leu-His-营养缺陷培养基初步筛选文库中插入cDNA所编码的序列与CPP32相互作用的菌落,再进一步检测β-半乳糖苷酶活性,结果从200多个Trp^+Leu^+His^+酵母菌落中获得7个LacZ^+阳性的酵母菌落。经分离阳性菌中的文库质粒和序列分析发现,在人白血病细胞株Jurkat中,新型G_sα缺失体(其正常蛋白与腺苷酸环化酶信号转导途径的激活相关)可与CPP32相互作用。纯化大肠杆菌中表达的G_sα缺失体及CPP32,用ELISA法进一步证实了这种相互作用。结论推测白血病细胞(至少某种白血病细胞)中CPP32参与了腺苷酸环化酶信号转导途径。

应用相互作用陷阱发现蛋白质——实例分析

为了了解某一特定蛋白的功能,通过识别与该蛋白相关的其它蛋白不失为一种有用的研究策略。研究两种蛋白之间相互作用的方法通常采用生化技术如偶联、免疫共沉淀等。1989年,Fields等首先创立了用遗传学方法研究蛋白之间相互作用。1991年,与Fields同实验室的Chien等在上述基础上进一步简化了该方法中的蛋白构建途径,并将这种方法称为双杂交系统(Two-hybrid system)。1993年,Gyuris等利用同样原理建立了研究蛋白之间相互作用的有效方法,将这种方法称为相互作用陷阱(Interaction trap)。随后研究者们纷纷采用这种方法去发现相互作用的蛋白质。

内皮素A型受体胞内区在大肠杆菌中的表达及其纯化

利用ＰＣＲ技术和ＤＮＡ体外重组方法，将内皮素Ａ型受体（ＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎｔｙｐｅＡｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＴＡＲ）胞内区ｃＤＮＡ克隆到ｐＵＣ１８载体中进行序列分析。结果表明，ＤＮＡ序列与预期结果完全相符。然后用低熔点琼脂糖回收插入到ｐＵＣ１８载体中的ＥＴＡＲ胞内区ＤＮＡ片段，连接到ｐＧＥＸ２Ｔ融合蛋白表达载体的凝血酶位点下游，转化大肠杆菌ＪＭ１０３，得到的重组质粒命名为２Ｔ／ＥＴＡＲ。ＪＭ１０３（２Ｔ／ＥＴＡＲ）经３０℃培养、ＩＰＴＧ诱导明显表达出ＥＴＡＲ胞内区融合蛋白，表达产物主要以包涵体形式存在。包涵体经变性和复性后，用亲和层析一步纯化法获得了较纯的ＥＴＡＲ胞内区融合蛋白。

5′端非翻译区对LT-B基因表达的影响

mRNA5＇端非翻译区的不同结构可影响基因表达,为了改善编码人毒素源性大肠杆菌热敏感肠毒素B亚单位的LT-B基因的表达水平,我们把该基因置于pBV220载体的P_RP_L串联启动子下游,构建了带有不同核苷酸组成的5＇端非翻译区的重组体。这些重组体分别在大肠杆菌HB101和DH5α中表达。结果表明,起始密码前有两个连续串联SD序列的LT-B基因的表达水平低于只有单个SD序列下的表达水平,而翻译偶联可使表达改善;用不同的SD序列LT-B基因的表达水平也有所不同,用基因本身SD序列可能要比用pBV220P_L启动子下游的SD序列好;在只含单个LT-B基因SD序列的重组体中,5＇端非翻译区序列的长短对LT-B基因表达没有什么影响;重组体在HB101中的表达水平高于在DH5α中的表达水平。

重组人GM－CSF／MCAF融合蛋白抗血清的制备与鉴定

重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）和人单核细胞趋化激活因子（ＭＣＡＦ）融合蛋白经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５和ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ两步柱层析，获得了电泳纯的ＧＭ－ＣＳＦ／ＭＣＡＦ融合蛋白。为进一步研究其结构与功能，我们以纯化的该融合蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清。ＤｏｔＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ试验表明，该抗血清效价高、特异性好，可分别与ＧＭ－ＣＳＦ／ＭＣＡＦ、ＧＭ－ＣＳＦ和ＭＣＡＦ发生反应。

基于报告基因和PPARγ信号通路的药物筛选模型的建立

目的 建立基于报告基因和PPARγ(peroxisomeprolif erator activatedreceptorγ)信号通路的药物筛选模型,用此模型筛选具有胰岛素增敏活性的小分子化合物。方法 五种细胞分别进行瞬时转染,将含有目的片段PPRE(peroxisomeproliferatorresponseelement)和报告基因荧光素酶(Luc)的质粒及表达PPARγ的质粒共转染到细胞中,通过测定荧光素酶活力来考察马来酸罗格列酮对PPARγ信号通路的影响,选取诱导表达倍数最高的细胞株建立模型。用其他类型核受体激动剂对此模型进行特异性考察。结果 293T细胞中,荧光素酶的表达受马来酸罗格列酮的诱导倍数最高,可达4 9倍,并呈现一定的剂量依赖关系,Z′因子为0 .72。而其他各类核受体激动剂的诱导表达率均在1倍左右。马来酸罗格列酮在转染剂量范围内无促进细胞增殖的作用。结论 马来酸罗格列酮对共转染报告基因质粒和表达PPARγ质粒的293T细胞Luc的表达具有较强的诱导作用,此模型具有较好的特异性和稳定性,适用于建立筛选PPARγ激动剂的高通量筛选模型。

白藜芦醇对大鼠慢性肝纤维化的影响

目的:观察白藜芦醇对四氯化碳(CCl4)致大鼠慢性肝纤维化的影响。方法:Wistar大鼠皮下注射50%CCl41mL·kg-1,每周2次,共10周。设白藜芦醇25,50,100mg·kg-1组,每组10只大鼠,连续灌服6周。检测大鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)水平,测量肝组织羟脯氨酸(Hyp)和丙二醛(MDA)水平,肝组织胶原纤维染色后半定量分析和肝组织病理组织学检查。结果:高剂量组的ALT明显低于模型对照组(P<0·01)。中剂量组和高剂量组肝组织Hyp和MDA水平、胶原化程度明显低于模型对照组。结论:白藜芦醇对肝纤维化可能有治疗作用。