基于低拷贝质粒的高产紫色杆菌素谷氨酸棒杆菌的构建和发酵

该研究以公认安全(Generally Recognized as Safe,GRAS)的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为宿主,构建高产紫色杆菌素的重组菌株。利用谷氨酸棒杆菌天然大质粒pTET3的复制与分配元件,构建了低拷贝质粒pOK12CG1,该质粒在谷氨酸棒杆菌中的拷贝数约为6拷贝/基因组,且与谷氨酸棒杆菌常用质粒pEC-XK99E和pXMJ19兼容。以低拷贝质粒pOK12CG1为骨架构建了携带紫色杆菌素合成操纵子(vioABCDE)的质粒pCGvio,并分别以谷氨酸棒杆菌标准株ATCC 13032和插入序列(Insertion Sequence,IS)元件删除株为宿主,构建了7株合成紫色杆菌素的重组菌株。通过初步筛选,发现基于低拷贝质粒的重组菌株ATCC 13032/pCGvio,其紫色杆菌素产量(508.24 mg/L)高于基于中高拷贝质粒的重组菌株ATCC 13032/pECvio(376.16 mg/L),而基于低拷贝质粒的IS元件删除重组菌株ISDM023/pCGvio紫色杆菌素产量达到了610.13 mg/L。进一步采用正交实验设计对重组菌株ISDM023/pCGvio进行培养基体积比(V_(LB):V_(BHIS))、诱导时间和IPTG诱导剂浓度这3个因素的发酵条件优化。结果表明,在VLB:VBHIS为1:2、诱导时间为18 h、IPTG浓度为0.75 mmol/L的优化条件下,紫色杆菌素的摇瓶发酵产量可达了1007.47 mg/L。该研究成功构建了紫色杆菌素的谷氨酸棒状杆菌重组菌株ISDM023/pCGvio,为谷氨酸棒状杆菌高效合成紫色杆菌素奠定了实验基础,也为其它产物的高效合成提供参考。

耐热酿酒酵母海藻糖代谢途径对热胁迫的响应

为深入探讨酵母的热响应机制,测定了热胁迫条件下耐热酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中海藻糖含量的变化,并通过实时定量聚合酶链式反应,分析了热胁迫下参与海藻糖代谢的相关基因的表达.结果表明:在42℃热胁迫下,酿酒酵母细胞内的海藻糖含量显著提高,在处理240min时达到0.20g/g(以细胞干重计),约为热胁迫前的4倍;随着胁迫时间的增加,胞内海藻糖的含量开始下降。参与海藻糖代谢的基因表达变化与海藻糖含量变化高度一致,说明海藻糖在酵母适应高温的过程中起重要作用.

酿酒酵母对数生长后期代谢重构的全基因组表达谱芯片分析

为了探讨酵母进入对数生长后期以后酒精生产速度降低的原因,我们利用酵母表达谱芯片技术对酿酒酵母细胞从对数生长中期进入对数生长后期时的全基因组表达谱进行了分析,发现酵母在对数生长中期的表达谱非常稳定,而一旦进入对数生长后期,则出现明显的代谢重构现象。许多氨基酸合成和代谢相关的基因、离子转移以及与能量的生成和储存等功能相关的基因出现了不同程度的上调;而许多涉及酵母转座和DNA重组的基因则表达下调;一些中心代谢途径也发生了代谢重构,包括:琥珀酸和α-酮戊二酸生成途径基因的一致上调,都与氨基酸合成和代谢相关基因表达的结果相吻合。结果表明:由于氨基酸合成的需求量增加,进入对数生长后期酵母的代谢转向TCA循环和乙醛酸循环,导致酒精的生产速率降低。

以酵母病毒杀伤系统为基础的抗病毒药物筛选模型

许多病毒利用程序性-1核糖体移码作为翻译调节机制进行繁殖。程序性酵母的病毒杀伤系统由L-A病毒和M1卫星病毒组成。M1病毒编码一种分泌型毒素K1,能杀死不含病毒的酵母细胞,但有自身免疫功能。L-A通过一定频率-1移码事件进行繁殖,-1移码效率的改变影响L-A病毒的存活,使M1数量快速下降。因此以程序性-1核糖体移码为靶位,建立以酵母病毒杀伤系统为基础的筛选模型,在抗病毒药物的高通量筛选方面有良好的应用前景。

酱油曲霉孢子原生质体的制备与紫外诱变育种

由1株分离、纯化自曲精的酱油曲霉的分生孢子制备原生质体,并进行紫外诱变,得到7株中性蛋白酶活提高幅度较大的紫外突变株U系,中性蛋白酶活最高的1株达到6 197.4U,为出发株的1.94倍。对原生质体制备条件进行了优化:选取孢子生长旺盛的新鲜斜面培养物(培养5 d左右)制备孢子悬浮液;采用25 mmol/L-巯基乙醇+5 mmol/L Na2EDTA体系预处理20 min;酶解条件是:1%溶菌酶+1%蜗牛酶+1%纤维素酶,山梨醇作为渗透压稳定剂(0.6 mol/L,pH6.88),酶解温度33℃,酶解5 h;再生培养基为0.6 mol/L NaCl高渗透压豆汁培养基,涂布法再生。

以酵母嗜杀系统为基础的抗病毒药物筛选模型的建立

根据嗜杀酵母T158c/S14a中L-A病毒-1移码效率改变影响M1病毒的存活,导致K1毒素减少,在低pH的美蓝平板上用杯碟法通过抑菌圈的大小检测酵母K1毒素的嗜杀活性,建立了一个以酵母嗜杀系统为基础的抗病毒药物筛选模型.研究了杯碟法检测酵母毒素嗜杀活性的各种条件.对不同pH和温度下酵母的嗜杀活性进行了研究,确定了模型用于筛选的最适pH范围为4.3～4.7,最适温度范围为20～22℃.运用该模型研究了几种中药对嗜杀活性的抑制作用,发现了金银花和升麻具有一定的抗病毒作用.该模型为抗病毒药物的高通量初筛奠定了基础.

酵母耐性评价方法的比较

酿造酵母对发酵中所形成胁迫的耐受能力是乙醇工业生产中酵母菌株所应具备的重要特性。为了筛选和评价具有胁迫耐受能力的乙醇发酵生产酵母菌株,需要建立通用的实验方法。文中通过比较耐性生长曲线、点滴试验和杜氏管产气3种方法,来评价4株酿造酵母的耐渗性能、耐乙醇性能及耐温性能。结果表明,评价体系下4株酵母耐渗性与耐温性体现了相似的趋势;在耐乙醇性能评价试验中,点滴试验评价与耐性生长曲线评价结果拟合度较高,而杜氏管产气作为酵母耐性评价的方法实验中未能得到很好的规律,其可靠性有待商榷。

基因组改组:几株同源酱油曲霉的多亲株电融合育种

酱油酿造中原料的全氮利用率是一个主要的生产指标,通过育种提高生产菌株的中性蛋白酶活是一个有效的方法。利用一株用曲精中分离、纯化的酱油曲霉,制备其分生孢子的原生质体,并优化了原生质体制备的条件。将分生孢子的原生质体进行紫外诱变,得到7株酶活提高幅度较大的紫外诱变株U,以此作为候选株文库,采用基因组改组(Genome shuffling),进行多亲株灭活电融合,获得9株酶活进一步提高的菌株。

酿酒酵母乙醇发酵性能与胁迫耐性的相关性

针对酿酒酵母在乙醇发酵过程中所面临的高温、高渗透压和高浓度乙醇等环境胁迫问题,研究了乙醇发酵性能与胁迫耐性的相关性.通过对13株工业菌株和1株实验室标准菌株的发酵性能(包括菌株的生长速率、底物的消耗速率和乙醇终产量)的分析,发现这14株酵母菌可以根据其发酵性能的差异归类划分为3类.通过线性判别分析法(LDA)建立了酵母发酵性能与不同胁迫耐受能力之间的相关性;此外,引入了量化评价参数———生长抑制因子(Gi),客观地表征了不同菌株的胁迫耐受能力.基于该胁迫耐受能力并结合LDA建立了预测菌株发酵性能的统计学模型,为酿酒酵母的培育和筛选提供了一种新的评价方法.

酿酒酵母获得耐性及相关基因转录水平的研究

本文通过对酿酒酵母在温和NaCl预处理后获得耐性以及用qRT-PCR技术对几个相关基因的转录水平进行了研究。结果如下:酿酒酵母BY4743经1.5MNaCl预处理30min后,可以获得对55℃高温或3MNaCl的耐性,但是无法获得对高温和高浓度NaCl的多重耐性,表明高温和高浓度NaCl产生了累加的胁迫作用;qRT-PCR的结果表明,胁迫响应基因的表达对酵母获得耐性起重要的作用。

几株酱油米曲霉的分离和RAPD分析

从不同来源的酱油曲中分离出6株形态有差异的米曲霉,分别测定所产蛋白酶酶活,并与沪酿3.042进行了RAPD分析,探讨其系统发育的亲缘关系。结果表明,从RAPD扩增图谱可以区分形态上难以分辨的不同米曲霉。聚类分析结果表明,各菌株遗传分化不大,具有相近的亲缘关系。初步探讨了RAPD在曲霉分类上应用的可行性,认为RAPD分析结果可作为曲霉分类参考的依据。

重组毕赤酵母细胞壁蛋白的抽提和分析

建立稳定有效的细胞壁蛋白(CWPs)抽提方法,是开展毕赤酵母细胞壁蛋白质组学及甲醇代谢调控相关性研究的基础.为此,以具重组非共价结合壁蛋白Flo1p絮凝素的酵母GS115/KFS-CALB、具共价结合壁蛋白α凝集素的酵母GS115/KNS-CALB和具重组共价结合壁蛋白Pir1的酵母GS115/Pir1-CALB为对象,用热十二烷基磺酸钠(SDS)、昆布多糖酶、氢氟酸吡啶和温和碱水解对上述壁蛋白进行抽提,结果表明:3种壁蛋白已成功地展示于毕赤酵母细胞壁的表面;用这3种毕赤酵母锚定蛋白展示脂肪酶,对细胞的生长状况影响不大,而对展示酶的表达量影响较大,GS115/KFS-CALB、GS115/KNS-CALB和GS115/Pir1-CALB的脂肪酶水解比酶活最高达855.02、1239.40和210.47 U/g(以干细胞计);热SDS可有效抽提GS115/KFS-CALB上的Flo1p絮凝素,昆布多糖酶和氢氟酸吡啶可释放GS115/KNS-CALB上的α凝集素,而昆布多糖酶和温和碱可释放GS115/Pir1-CALB上的Pir1.

DNA微阵列数据特征提取的分类方法研究

常用的排列方法从DNA微数据中选择的基因集合往往会包含相关性较高的基因,而且使用单个基因评价方法也不能真正反映由此得到的特征集合分类能力的优劣。另外,基因数量远多于样本数量是进行疾病诊断面临的又一挑战。为此,提出一种DNA微阵列数据特征提取方法用于组织分类。该方法运用K-means方法对基因进行聚类分析,获取各子类DNA微阵列数据中心,用排列法去除对分类无关的子类,然后利用ICA方法提取剩余子类集合的特征,用SVMs方法构造分类器对组织进行分类。真实的生物学数据实验表明,该方法通过提取一种复合基因,能综合评价基因分类能力,减少特征数,提高分类器的分类准确性。

营养基因组学研究与应用

随着基因组学、生物信息学等领域的迅猛发展,营养基因组学应运而生,并迅速发展成为营养学研究的热点。营养基因组学主要研究营养素和植物的化学物质对人体基因的转录、翻译表达以及代谢机制,是将高通量组学技术用于食物营养素与基因组的相互作用,及其与健康关系的研究,其应用范围包括营养素作用的分子机制、营养素的人体需求量、个体食谱的制定以及动物生产等。本文重点介绍营养基因组学的研究与应用的现状,并对今后的研究趋势作了进一步的展望。

巴斯德毕赤酵母表达重组人对氧磷酶1的发酵条件优化

本研究采用响应面方法优化重组人对氧磷酶1(Recombinant Human Paraoxonase 1,rhPON1)在毕赤酵母中的表达。首先通过研究甲醇浓度、p H、培养基装液量3个单因素对rhPON1表达的影响,然后以rhPON1单位体积酶活力为响应值进行响应面分析。结果显示:甲醇浓度1.42%,p H值5.91,培养基装液量9.39%是最优发酵条件。在此优化条件下,rhPON1的单位体积酶活力预测值为0.737U/mL,与验证值(0.735U/mL)基本一致。人对氧磷酶1可以水解多种有机磷化合物,被认为是一种有机磷农药中毒的解毒剂。

毕赤酵母新启动子GCW14在细胞表面展示CALB中的应用

以毕赤酵母内源壁蛋白Gcwl4p为锚定蛋白,分别以新的内源组成型启动子P_(GCW14)与诱导型启动子P_(AOXI)、组成型启动子P_(GAP)和P_(TEF1)4种启动子将南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)展示于毕赤酵母细胞表面,通过检测4种重组细胞的CALB酶活比较这4个启动子在毕赤酵母中的转录活性。结果显示,P_(GCW14)的启动子活性与P_(AOX1)相当,最高菌体酶活力分别在发酵48 h和168h时达到694.8 U/g(Dry cell weight)和684.3 U/g(Dry cell weight),以P_(GCW14)为启动子的重组菌产酶周期大大缩短;组成型启动子P_(GAP)和P_(TEF1)的最高菌体酶活分别在发酵24 h和168 h达到266.7 U/g(Dry cell weight)和449.2 U/g(Dry cell weight),可见P_(GCW14)的启动子活力性要高于P_(GAP)和P_(TEF1)。此外,以P_(GCW14)为启动子,利用壁蛋白Gcw14p自身的信号肽代替载体上的α-信号肽使重组菌的菌体酶活力提高了约4%。

毕赤酵母表面展示米黑根毛霉脂肪酶发酵条件

在50 L发酵罐水平对影响毕赤酵母表面展示米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase,RML)发酵因素进行了研究。最适初始菌体密度(OD600)约为250,最佳诱导pH为6.0;降低诱导温度能有效提高单位甲醇转化率,诱导温度为20℃和25℃时的转化率分别是30℃的1.56倍和1.32倍。在以上最适条件下单位干菌体展示酶活及生产强度分别达275.0 U/g和462.5 U/(L.h),比优化前提高54.5%。研究发现,山梨醇和甲醇混合补料有效地提高了诱导前期(t=12h)的产酶效率,当山梨醇和甲醇混合比例为1∶4及1∶5是以甲醇为单一碳源时酶活力的1.7倍。

MXR1基因对毕赤酵母工程菌代谢调控的影响

为了研究毕赤酵母中转录因子Mxr1p在毕赤酵母代谢调控中所起的作用,构建一株以南极假丝酵母脂肪酶B基因(CALB)作为报告基因,MXR1基因完全缺失的毕赤酵母基因工程菌株。将重组质粒pPIC9K-CALB转化毕赤酵母GS115,利用三丁酸甘油酯平板筛选得到分泌表达CALB的重组菌GS115/pPIC9K-CALB。通过重叠延伸PCR方法获得一段中间含有博来霉素抗性基因sh b le,两翼大约各有1 200 bp与毕赤酵母MXR1基因上下游同源的基因片段,将此片段用氯化锂法转化毕赤酵母细胞GS115/pPIC9K-CALB后,利用博来霉素抗性及CALB酶活力丧失双重筛选的方法得到一株MXR1基因完全缺失的毕赤酵母基因工程菌株。该菌株在以甲醇为唯一碳源的培养基中不生长,在以乙醇、葡萄糖或者甘油为唯一碳源的培养基中生长缓慢。结果表明转录Mxr1p因子在毕赤酵母中的多条代谢途径中起着关键性的作用,主要涉及甲醇、乙醇、甘油和葡萄糖等代谢途径。

重组猪圆环病毒2型Cap蛋白在毕赤酵母中的优化表达及疫苗活性研究

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要致病原,在全世界范围内对养猪业造成了巨大的经济损失。猪圆环病毒2型Cap蛋白(PCV2-Cap)是制备猪蓝耳病疫苗的主要靶蛋白。针对目前PCV2疫苗生产工艺复杂、成本较高的问题,本研究利用毕赤酵母表达系统研究PCV2-Cap蛋白的重组表达及疫苗活性,将PCV2-Cap基因序列去除核定位信号序列(NLS)后,经密码子偏好性优化,构建重组表达载体,并转化至毕赤酵母宿主菌X-33,经Zeocin抗性筛选获得重组菌株。SDS-PAGE和Western blot结果显示Cap蛋白在酵母表达系统中成功表达,蛋白质大小为26 ku。5 L罐高密度发酵小试,得到PCV2-Cap蛋白在发酵上清液中的浓度约为0.53 mg/m L,占总蛋白的23.5%。动物免疫试验显示重组Cap蛋白能刺激机体产生特异性抗体。结果表明,PCV2-Cap基因在毕赤酵母中实现了分泌表达,为PCV2-Cap毕赤酵母亚单位疫苗的研制提供了数据支持。

丁酰胆碱酯酶抑制剂对急性高血脂小鼠模型血脂的影响

目的观察丁酰胆碱酯酶抑制剂对急性高血脂小鼠血脂水平的影响。方法采用腹腔注射泰洛沙泊（400mg／kg）的方法建立小鼠急性高血脂模型，并通过灌胃给药的方式给予辛伐他汀（10mg／kg）、丁酰胆碱酯酶特异性抑制剂四异丙基焦磷酸亚胺（ISO-OMPA）（1mg／kg）和非特异性抑制剂新斯的明（0．5mg／kg），分别分析丁酰胆碱酯酶被抑制的程度以及小鼠血浆中血脂的变化。结果新斯的明对丁酰胆碱酯酶的体外抑制效果是ISO—OMPA的136倍，而ISO—OMPA体内抑制效果强于新斯的明；ISO—OMPA和新斯的明均可显著抑制小鼠血清丁酰胆碱酯酶的活性，模型组小鼠的血浆总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL—C）浓度分别为（586．1±99．8）、（277．2±92．7）、（164．6±82．5）mg／dl，新斯的明组与之比较分别下降了19％、15％和6％。结论丁酰胆碱酯酶与血脂明显相关。