猪细小病毒7型荧光定量PCR检测方法的建立与应用

猪细小病毒7型(PPV7)是近年来新发现的一种新型PPV。目前,缺乏更为高效的针对PPV7的检测方法,为了建立能够快速检测PPV7的方法,本研究根据PPV7 NS1基因的保守区序列,设计1对特异性引物及TaqMan探针。经过各反应条件的优化,初步建立了一种便捷、灵敏、能够快速准确检测PPV7的荧光定量PCR(qPCR)方法,并对其特异性、敏感性、稳定性以及与SYBR GreenⅠqPCR检测方法的符合率进行检测与对比。结果显示,该方法除对PPV7的基因组DNA有特异性扩增,对猪伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、日本乙型脑炎病毒及PPV1核酸均无交叉反应,特异性较强。该方法对重组质粒标准品检测限为1.76拷贝/μL,而常规PCR方法检测限为1.76×10^(2)拷贝/μL,表明本研究建立的方法敏感性较高。该方法对不同浓度质粒标准品的组内和组间重复性试验变异系数均小于1.7%,重复性较好。利用本研究建立的qPCR方法和SYBR GreenⅠqPCR方法对采自福建地区的150份样品进行检测,结果显示,两种检测方法的阳性率分别为24.67%(37/150)和6.67%(10/150),二者的总符合率为80.67%(121/150)。表明本研究建立的qPCR方法可以用于临床样品的检测。本研究建立的qPCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性稳定性好,为PPV7的流行病学调查及检测提供了新的技术支撑。

猪细小病毒7型VP2蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了表达猪细小病毒7型(PPV7)VP2蛋白(由Cap基因编码)并制备其多克隆抗体,试验从GenBank数据库中下载PPV7 Cap基因序列,选择不同毒株的高频序列作为目的基因序列,使用T4 DNA连接酶将目的基因与pET-32a表达载体连接,将连接产物转化至DH5α感受态细胞中,并使用IPTG对重组菌进行诱导,对表达的重组蛋白进行可溶性分析与纯化并通过Western-blot检测重组蛋白的反应原性,用纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并分别通过间接ELISA方法、Western-blot检测多克隆抗体的效价及其与重组蛋白的反应性。结果表明:诱导后的重组菌在56 ku处出现明显条带,重组蛋白主要以包涵体的形式表达;纯化后的重组蛋白为单一条带,质量浓度为0.46 mg/mL,能与His标签抗体特异性结合;制备的多克隆抗体的效价为1∶51200,能与重组蛋白特异性结合。说明PPV7 VP2蛋白获得了成功表达,该蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,所制备的多克隆抗体效价较高。

2020—2022年闽粤赣地区PRRSV ORF5基因的分子流行病学调查

【目的】了解闽粤赣地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的分子流行动态,为该疫病的科学防控提供参考。【方法】采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对2020—2022年闽粤赣地区1475份临床猪组织和血清样品进行检测,对PRRSV阳性样品进行ORF5基因扩增和测序,并对ORF5基因的序列进行系统发育分析。【结果】2020、2021、2022年闽粤赣地区发病猪PRRSV的阳性率分别为24.23%(95/392)、27.69%(162/585)、18.07%(90/498),2020—2022年福建、广东、江西地区PRRSV的阳性率分别为23.20%(272/1172)、23.96%(52/217)、26.44%(23/87)。挑选来自不同猪场的86份阳性样品进行PCR扩增,成功获得62株PRRSV ORF5基因序列,并下载GenBank已发布的18株2020—2022年闽粤赣地区PRRSV的ORF5基因序列,与127株PRRSV国内外参考株ORF5基因序列构建系统发育树。系统发育树显示,80株闽粤赣PRRSV分离株均属美洲株。其中,40株分布在谱系1(NADC30-like株、NADC34-like株)上,12株分布在谱系3(GM2-like株、QYYZ-like株)上,7株分布在谱系5(VR2332-like株、BJ-4-like株)上,21株分布在谱系8(JXA1-like株、CH-1a-like株)上。对核苷酸和氨基酸序列的同源性进行分析,结果显示,80株PRRSV ORF5基因编码的核苷酸序列同源性为81.2%~100%,氨基酸序列同源性为78.6%~100%。33株PRRSV ORF5基因编码的GP5蛋白氨基酸序列在中和表位区第39氨基酸残基处存在变异。【结论】2020—2022年闽粤赣地区PRRSV流行株以谱系1为主(50.00%),并存在谱系1、3、5、8的混合流行。

抗体监测在规模猪场猪繁殖与呼吸综合征防控中的预警作用

为了揭示猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)抗体水平在免疫猪群与非免疫猪群中的变化规律,本研究选取福建省龙岩市两个规模相似的自繁自养猪场,其中一个场免疫国内某厂家的TJM-F92株,另一个场不进行免疫。试验采用ELISA方法对两个场不同周龄的商品猪进行PRRS抗体检测及分析,通过RT-PCR方法对临床样品中检测到的两株PRRSV的ORF5基因进行测序,并结合参考株进行序列分析。抗体检测结果表明,未免疫场248份血清中PRRS抗体阳性率从4周龄的70.0%下降至10周龄的26.7%,14周龄后抗体阳性率开始上升直至18周龄,保持在97.1%~100%;免疫场170份血清中未免疫的2周龄抗体水平较高,阳性率为100%,免疫后除6周龄、8周龄、10周龄分别为80%、70%、90%,其他周龄均为100%。ORF5基因遗传演化分析表明,免疫场检出毒株为HP-PRRSV,与HP-PRRSV(JXA1、HuN4等)、疫苗株HP-PRRSV TJM-F92等的同源性为70.5%~93.8%,并与JXA1、HuN4等处于同一小分支。未免疫场检出毒株与PRRSV NADC30株同源性为87.2%,属于NADC30-like分支。因此,当发现PRRS抗体阳性率较低、出现个别S/P值高且离散度大时,猪场要立刻采取处理措施预防因PRRSV感染而引起的继发感染。表明抗体定期监测在疫苗免疫场和阳性稳定场PRRS防控上可发挥有效的预警作用。

液体培养法与qPCR法对检测猪鼻支原体灵敏度比较

为了比较《中国药典》已收录但相当耗时的液体培养法和未收录但相对快速的荧光定量PCR(qPCR)法对支原体检测的灵敏度,试验分别在猪鼻支原体生长的对数期(48 h)、稳定期(96 h)和衰亡期(144 h)取样,将样品10倍系列稀释后,使用液体培养法和qPCR法对各个稀释度进行检测(两种方法的样品加入体积分别为0.5 mL和5μL),以比较二者的灵敏度。结果显示:在存活支原体占比高的对数期和稳定期,液体培养法比qPCR法的检测灵敏度高约100倍;而在死亡支原体占比大幅增加的衰亡期,结果则相反,qPCR法反而比液体培养法的检测灵敏度高约1 000倍。当把对数期样品高速离心浓缩约100倍后再用qPCR法检测,其检测灵敏度比浓缩之前提高了约100倍。上述结果表明:影响液体培养法和qPCR法相对灵敏度的主要因素是各自体系中不同的样品加入体积和样品中存活支原体的比例,而由于前一因素导致的两种方法灵敏度的差异,可以通过高速离心浓缩的方法缩小,使两种方法的相对灵敏度基本相同。

一例母猪混合感染猪圆环病毒3型与近平滑假丝酵母菌的病例报告

2022年6月福建省龙岩市某规模化猪场的母猪陆续发病,临床主要表现为病猪的膝关节轻微肿大,不愿久站,甚至站立困难。为查明发病原因,对病猪进行病理剖检,并采集血液和膝关节积液样品,分别用于生猪常见疫病病原体的核酸检测和微生物的分离培养。结果显示:病理剖检未发现主要脏器的明显病变;血液样品的核酸检测显示,猪圆环病毒3型(Por⁃cine Circovirus type 3,PCV3)为阳性,未检出其它主要病原体;膝关节积液样品的微生物培养产物的显微镜镜检结果显示有酵母样真菌,经培养产物的PCR扩增和DNA测序表明:该酵母样真菌为近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)。结论:该病例为猪圆环病毒3型(PCV-3)与近平滑假丝酵母菌的混合感染。根据文献查询,这是世界首例有关近平滑假丝酵母菌导致生猪膝关节深部感染并从膝关节积液中成功分离到近平滑假丝酵母菌的报道。

闽粤地区PPV7与PCV2的混合感染调查及PPV7 Cap基因的遗传变异分析

【目的】调查闽粤地区猪细小病毒7型(Porcine parvovirus type 7,PPV7)与猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)的混合感染情况,并掌握两地PPV7 Cap基因的分子遗传特征。【方法】收集闽粤地区69个猪场的432份发病猪血液进行PPV7和PCV2的PCR检测,并对阳性样品的PPV7 Cap基因进行克隆测序。利用DNAStar软件对两地PPV7 Cap基因的核苷酸序列及氨基酸序列进行分析,并采用Mega 7.0软件绘制遗传进化树。【结果】闽粤地区PPV7阳性率为21.99%(96/432),场阳性率为53.62%(37/69),PCV2阳性率为54.17%(234/432),两者共感染率为13.43%(58/432)。应用PCR方法成功扩增出17株PPV7 Cap基因序列。核苷酸相似性分析发现,17株PPV7 Cap基因序列之间相似性在85.6%~100%,与国内外参考毒株相似性在85.8%~99.0%。氨基酸序列比对发现,17株PPV7 Cap蛋白氨基酸序列相似性为87.6%~100%,与国内外参考毒株间的氨基酸相似性为82.6%~98.7%。基于Cap基因的遗传进化分析表明,PPV7可分为PPV7a~PPV7e 5个主要的进化分支,其中9株属于PPV7a进化分支,3株属于PPV7b分支,4株属于PPV7c分支,仅有1株属于PPV7e分支。【结论】PPV7在闽粤地区广泛流行,并且与PCV2有较高的共感染率,可能为猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated disease,PCVAD)的潜在致病因子。闽粤两地PPV7毒株具有丰富的遗传多样性,而PPV7a分支毒株为目前的主要优势毒株。本研究为闽粤地区PPV7的防控及疫苗研究提供理论依据及数据参考。

猪细小病毒6型研究进展

猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是造成母猪繁殖障碍的重要致病原之一,并在世界范围内广泛流行,感染后可造成猪的死木胎综合征(Stillbirth,mummification,embryonic death and infertility,SMEDI),即母猪产死胎、木乃伊胎、胚胎发育不良和死亡及母猪不孕等[1]。PPV在临床上常与猪圆环病毒(PCV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等病原产生共感染并引发猪的免疫抑制,给猪场带来巨大的经济损失[2]。

1例犬阿迪森氏病的诊治

6岁雄性贵宾犬出现食欲下降,精神极度沉郁,基本废食,体重下降及站立不稳。通过临床检查、实验室检查、影像学检查和促肾上腺皮质激素(ACTH)刺激试验进行诊断,血常规结果显示红细胞压积和红细胞数目升高,提示患犬严重脱水;血气分析结果表明患犬出现低钠血症、高钾血症与低氯血症,属于肾上腺皮质机能减退的典型电解质紊乱情况;超声检查结果表明该犬肾上腺萎缩;ACTH刺激试验结果为肾上腺皮质机能减退,确诊该犬患有阿迪森氏病。采取静脉输液、口服醋酸氟氢可的松、肌肉注射泼尼松龙等进行治疗,预后良好。

一例猪蓝耳病与猪圆环病毒病及多重细菌共感染的实验室诊断

为了确诊2021年10月在福建龙岩地区某规模猪场发生的一起仔猪体温升高、呼吸困难、消瘦的病例,分别设计PRRSV、PCV2特异性扩增引物进行PCR检测及阳性样品基因克隆与序列分析。结果表明,送检病例检出PRRSV和PCV2型,PRRSV ORF5序列分析发现所得毒株为高致病性毒株,PCV2全长基因的序列分析为PCV2a亚型;同时从肺脏和肝脏分离所得细菌的16S rRNA进行鉴定与测序,结果发现分离菌为猪链球菌、肺炎克雷伯菌、O157:H7血清型大肠杆菌。说明该猪场疫情主要由高致性PRRSV与PCV2共感染,同时并发多重细菌感染引起。通过对该病例的诊断和疫情分析提出针对性防控措施,为养猪生产实践中的疫病防控提供参考。

6型及4型猪细小病毒双重实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

根据6型猪细小病毒(porcine parvovirus 6,PPV6)和4型猪细小病毒(porcine parvovirus 4,PPV4)全基因组的保守区域基因序列,分别设计了2对特异性的引物和2种不同荧光基团标记的Taqman探针。经过条件优化,建立能够同时诊断PPV6和PPV4的双重荧光定量PCR方法,并对其特异性、灵敏性、稳定性以及与常规PCR方法的符合率进行研究。结果显示,该方法能够同时检测鉴别PPV6和PPV4,且特异性良好,与猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、日本乙型脑炎病毒及猪细小病毒1型核酸均无交叉反应;本方法灵敏性强,PPV6和PPV4的最小检出限分别为7.7拷贝/μL和9.3拷贝/μL;组间和组内变异系数均未超过2%,具有良好的重复性;利用所建立的双重荧光定量PCR方法对福建省采集的68份猪血清及20份组织样本进行检测,PPV6阳性率为37.5%(33/88),PPV4阳性率为12.5%(11/88),混合感染率为11.36%,该结果与常规PCR的符合率分别为81.8%(PPV6),90.9%(PPV4)和90.05%(混合感染率),并且常规PCR鉴定的阳性样品通过本研究建立的方法复检时均未出现漏检。结果表明,本试验建立的检测方法对PPV6和PPV4的鉴别诊断、病原监测、流行病学调查等具有重要意义。

猪圆环病毒2型及猪细小病毒2型双重PCR检测方法的建立与应用

猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒2型(PPV2)均为猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的潜在致病病原。为了建立一种高效、快速、准确且能够同时鉴定PCV2和PPV2的双重PCR方法,下载GenBank已公布的多个PCV2及PPV2全基因序列并比对,针对PCV2和PPV2基因组的保守序列设计合成2对PCR引物,对双重PCR反应条件进行优化,建立了同时检测PCV2和PPV2的双重PCR方法,并对其敏感性,特异性及与普通单一PCR的符合率做出评价。结果显示,该方法能同时扩增出666 bp(PCV2)与254 bp(PPV2)的特异性片段,对阳性标准质粒pMD-PCV2和pMD-PPV2的检测限分别为1.0×10^(2)copies/μL和1.0×10^(1)copies/μL,对猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪乙型脑炎病毒、猪细小病毒1/4/6/7型和猪圆环病毒3/4型的核酸扩增结果均为阴性。对临床疑似患PRDC的86份肺部组织样品进行检测,结果显示,PCV2阳性率为30.2%,PPV2阳性率为59.3%,两者的共感染率为20.9%,与单一PCR检测结果一致。结果表明,本研究建立的双重PCR方法可有效、特异、灵敏、快速鉴定PCV2和PPV2,为PCV2和PPV2的快速检测及其流行病学调查提供有效的技术手段。