Sysmex XE-2100中Q-flags阳性报警临界值的调整与验证

目的对Sysmex XE-2100中可疑报警信号(Q-flags)设置合理的临界值,制定适合于本实验室Q-flags的镜检标准,提高工作效率,保证血液分析结果的准确性。方法选择2011年3月至2012年3月期间本院门急诊及住院患者的4 500例标本,上机检测后推片、染色、手工镜检。以查见原始和幼稚细胞≥1%,早幼粒和中幼粒细胞≥1%,晚幼粒细胞>2%,杆状核粒细胞>5%,异型淋巴细胞>5%,有核红细胞≥1%为阳性标准。重新定义仪器Q-flags主要参数的临界值,最后选择1 400份标本验证新确定临界值可信度。结果 (1)修订前/后临界值为:原始细胞:100/130、未成熟粒细胞:100/150、核左移:100/160、异形淋巴细胞:100/180、有核红细胞:100/90、异常/原始淋巴细胞:100/200;(2)修订前/后假阳性率(%)分别为61.05/50.15、56.36/35.60、44.34/14.10、62.12/32.20、36.18/40.61、62.96/26.30;真阴性率(%)分别为38.95/49.85、43.64/64.36、55.66/85.90、37.88/67.80、63.82/59.39、37.04/73.70;总符合率(%)分别47.75/56.42、57.00/71.83、73.44/89.67、45.33/71.33、80.17/79.17、43.33/76.00;报警率下降了14.67%;(3)验证试验显示无初发白血病细胞漏检。结论 (1)Sysmex XE-2100设置合理Q-flags的临界值,保证血液分析结果的准确性,有效地筛选出真正异常样本,有选择性地对复片镜检,提高工作效率;(2)对于自动化血液分析系统Q-flags的临界值应根据各实验室实际情况重新修订,不应直接使用其出厂值。

Sysmex XE-2100对未成熟粒细胞临界值的确定

目的对Sysmex XE-2100全自动血细胞分析仪的白细胞分类报警系统(Q-Flags)中提示的"未成熟粒细胞?(Imm Gran?)"报警信息的可信度进行分析,选择最佳临界值以确定手工镜检复查的标准。方法选择本院门、急诊及住院患者的1 200例标本,根据仪器分类报警系统中"Imm Gran?"不同提示值的标本进行分类、染色、镜检,计数200个白细胞,以查见原始和幼稚细胞细胞大于或等于1%,早幼粒和中幼粒细胞大于或等于1%,晚幼粒细胞大于2%为阳性标准。把Imm Gran的临界值分别设为10、20、30……290、300,通过数据分析确定最佳临界值。其中假阴性率的最大可接受限不能超出5%。最后选择744例标本验证新确定临界值的可信度。结果 (1)通过比对确定临界值为150是最佳临界值。修改后,在假阴性不超过5.00%(4.51%)的情况下,假阳性率由56.36%降到35.64%,真阴性率由43.64%提高到64.36%,总符合率由57.00%提高到71.83%。(2)验证试验显示无初发白血病细胞漏检。结论 (1)重新建立了合适的Imm Gran临界值后,在保证检验质量的同时,减少了镜检复片数量,又提高了工作效率。(2)Imm Gran报警提示值在150～300范围时应进行手工分片镜检复查。(3)Q-Flags中临界值应根据自己实验室的实际情况重新修定。

维甲酸诱导基因G慢病毒表达载体的构建及对肺癌细胞A549的影响

背景与目的:维甲酸诱导基因G(retinoic acid-induced gene G,RIG-G)是从急性早幼粒细胞性白血病细胞系NB4细胞中克隆出的肿瘤抑制基因。我们通过调控基因(Tet-on)系统构建受强力霉素(doxycycline,DOX)诱导RIG-G基因表达的A549细胞系,并观察其对A549细胞增殖的作用。方法:采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)技术扩增RIG-G基因片段,利用LR重组系统构建p Lenti6/TO/V5-GIM-RIG-G慢病毒载体,对该慢病毒载体和Tet-on慢病毒载体包装和病毒滴度测定后,感染A549细胞;采用有限稀释法筛选稳定株;使用细胞免疫荧光和蛋白[质]印迹法(Western blot)鉴定RIG-G基因受DOX调控表达的效果;CCK-8试验检测细胞增殖能力。结果:成功构建p Lenti6/TO/V5-GIM-RIG-G慢病毒载体,包装后测得其活性滴度为1.0×108 TU/m L;慢病毒经Tet-on包装后物理滴度为4×109 VP/m L;RIG-G蛋白成功地在慢病毒感染后的A549稳定株中合成和表达,并且受DOX的诱导调控。RIG-G蛋白表达成功后,A549细胞的增殖与对照组相比显著降低(1.168±0.107 vs 2.099±0.162,P<0.05)。结论:本研究成功建立了RIG-G基因可调控表达的A549稳定株;RIG-G蛋白对A549的增殖有抑制作用。

IL-1β促进肺癌细胞增殖的作用机制研究

目的:研究IL-1β在巨噬细胞促进肺癌细胞增殖的作用机制。方法:采用Transwell插入式细胞培养皿共培养人肺癌细胞株A549、NCI-H520细胞和巨噬细胞。Brd U-ELISA法检测巨噬细胞对肺癌细胞的增殖能力。采用Real-time PCR法检测巨噬细胞和A549、NCI-H520细胞中IL-1βmRNA的表达。应用IL-1β的中和抗体抑制IL-1β的活性,观察IL-1β在巨噬细胞促进肺癌细胞增殖中的作用。利用Western blot法检测肺癌细胞中自噬标志物Beclin 1的表达。结果:Brd UELISA检测结果:A549细胞与巨噬细胞以1∶0.5的比例共培养,A549细胞的OD值从(0.41±0.06)增加到(1.13±0.10),差异有统计学意义(P<0.05),且A549细胞的OD值随共培养巨噬细胞比例的增加而升高(P<0.05)。NCI-H520细胞与不同浓度的巨噬细胞共培养后,NCI-H520细胞的OD值变化趋势与A549细胞相似。Real-time PCR法检测结果:在共培养后,巨噬细胞中IL-1βmRNA的表达显著上调,且有时间依赖性,并显著高于肺癌细胞中的表达。加入IL-1β中和抗体后,Brd U ELISA法检测的细胞增殖,结果显示IL-1β中和抗体可明显抑制巨噬细胞对肺癌细胞A549和NCI-H520的增殖促进作用。Western blot法检测结果显示IL-1β可显著抑制肿瘤细胞Beclin 1的表达。结论:巨噬细胞和肺癌细胞通过增强IL-1β的表达促进肿瘤细胞的增殖。抑制肿瘤细胞的自噬可能是IL-1β促进肺癌发展的作用机制。

银杏内酯A、B混合物抑制永久性大脑中动脉栓塞大鼠神经细胞JNK凋亡途径

目的研究银杏内酯A、B混合物(GKAB)对永久性大脑中动脉栓塞(p MCAO)大鼠神经元的保护作用及相关分子机制。方法取雄性SD大鼠60只,随机分为假手术组、p MCAO模型组和GKAB处理低、中、高剂量组。除假手术组(仅分离动脉而不阻断)外,其余4组均采用阻断右侧大脑中动脉的方法制备大鼠p MCAO模型。GKAB处理低、中、高剂量组于术后10 min分别经舌下静脉注射GKAB 12.5、25、50 mg/kg,假手术组、p MCAO模型组给予中剂量组药物等容量的生理盐水。用药12 h后,采用TUNEL法检测各组大鼠脑组织神经细胞凋亡率,免疫组织化学法检测神经细胞磷酸化JNK(p-JNK)表达,蛋白质印迹法检测脑组织中p-JNK、Bcl-2、Bax、细胞色素C(Cyt C)、caspase-9、caspase-3以及cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白的表达。结果与假手术组相比,p MCAO模型组大鼠神经细胞凋亡率和p-JNK表达水平均增加(P<0.01),凋亡相关蛋白Bax、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3的表达均升高(P<0.01),Bcl-2、caspase-9、caspase-3的表达均降低(P<0.01);给予GKAB处理后,与p MCAO模型组比较,GKAB处理低、中、高剂量组大鼠神经细胞凋亡率和p-JNK水平均降低(P<0.01),凋亡相关蛋白Bax、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3的表达也呈下降趋势(P<0.01),而Bcl-2、caspase-9、caspase-3的表达呈升高趋势(P<0.01),并表现出一定的剂量依赖性。与假手术组相比,p MCAO模型组神经细胞胞质Cyt C表达升高,线粒体Cyt C表达降低(P<0.01);与p MCAO模型组比较,GKAB低、中、高剂量组神经细胞胞质Cyt C表达逐渐降低,线粒体Cyt C表达逐渐升高(P<0.05,P<0.01)。结论 GKAB可抑制p MCAO大鼠脑神经细胞凋亡,其机制可能与其抑制JNK磷酸化、抑制JNK信号通路的激活、阻断线粒体凋亡途径有关。

香烟烟雾激活肺癌细胞Wnt/β-catenin信号途径的机制研究

背景与目的:香烟烟雾诱导的炎性反应可显著促进肺肿瘤的生长,本研究通过体内外实验明确香烟烟雾激活肺癌细胞Wnt/β-catenin信号途径的机制。方法:利用尾静脉注射鼠Lewis肺癌细胞方法建立小鼠肺癌模型,然后采用香烟烟雾对其进行刺激,诱发炎性反应。免疫组化方法检测小鼠和人肺肿瘤组织中CD68、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)和无磷酸化β-catenin的表达。采用Transwell插入式细胞培养皿共培养人巨噬细胞和人肺癌细胞株A549细胞。采用蛋白质印迹法(Western blot)检测A549细胞中无磷酸化β-catenin的表达及磷酸化的GSK-3β和Akt蛋白的表达。结果:免疫组化结果显示,香烟烟雾刺激肺肿瘤负荷小鼠后,其肿瘤组织中巨噬细胞CD68+、TNF-α和无磷酸化β-catenin的表达均明显高于对照组。肺癌患者肿瘤组织中,CD68和TNF-α的阳性表达均明显高于正常组织。肺腺癌和鳞癌的无磷酸化β-catenin的染色阳性率分别为68.9%和62.2%,其阳性率与患者吸烟与否及肿瘤分期有关,差异有统计学意义(P均<0.05),并且CD68+的细胞数在无磷酸化β-catenin染色阳性的标本中显著升高(P<0.01)。Western blot检测结果显示,不同浓度香烟抽提物(cigarette smoke extract,CSE)刺激共培养细胞后,A549细胞中无磷酸化β-catenin的表达随着CSE浓度的增加而显著上升。在加入TNF-α中和抗体后,A549细胞中无磷酸化β-catenin的表达被抑制。用TNF-α处理A549细胞后,磷酸化的GSK-3β和Akt蛋白在2 h后表达增加,4 h后无磷酸化β-catenin蛋白表达也开始上调。结论:香烟烟雾诱导肺肿瘤组织中巨噬细胞释放炎性反应因子TNF-α,进而通过Akt/GSK-3β途径激活肿瘤细胞中Wnt/β-catenin信号通路。

全自动血细胞分析仪Sysmex XE-2100复检规则的建立及应用评价

目的采用复检标准制定协作组推荐的血细胞复检规则,通过对实验数据进行分析,建立适合该实验室的Sysmex XE-2100血细胞分析仪复检规则,保证血细胞分析结果的准确性,便于临床诊断和治疗。方法根据医院的实际情况建立Sysmex XE-2100血细胞分析仪复检规则,并在复检规则指导下通过对1 020例标本仪器检测结果和显微镜镜检结果的数据分析,评价规则的可行性和可靠性。结果根据该科室建立的Sysmex XE-2100血细胞分析仪28条复检规则和涂片镜检阳性规则对检测结果进行统计分析,复检率为22.84%,真阳性率18.92%,假阳性率3.92%,真阴性率74.61%,假阴性率2.55%,且无血液病细胞漏检。结论 2.55%的假阴性率符合国际血液学复审协作组关于假阴性率小于5.0%的规定。该科室制定的复检规则既提高了检测效率,又能防止漏检和误检,合适该实验室质量要求。

Beclin 1在乳腺浸润性导管癌中的表达及其与Ki67的关系

目的探讨自噬相关基因Beclin 1和增殖相关基因Ki67编码的蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达情况。方法选取乳腺浸润性导管癌患者64例。采用免疫组化法检测癌组织及对应的癌旁组织中Beclin 1和Ki67蛋白的表达,同时采用免疫荧光法和免疫印迹法检测癌组织及对应癌旁组织中Beclin 1蛋白的表达。结果癌组织中Beclin 1的阳性表达率(43.8%)明显低于癌旁组织(98.5%)(P<0.05),而Ki67的阳性表达率(76.6%)则高于癌旁组织(0.00%)(P<0.05)。癌组织中Beclin 1蛋白表达与Ki67蛋白表达呈负相关(r=-0.256,P<0.05)。Beclin 1蛋白表达与乳腺浸润性导管癌病理分级、有无淋巴结转移有关(P<0.05),与肿瘤直径、年龄、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人类表皮生长因子受体2(HER-2)均无关(P>0.05)。Ki67蛋白表达与乳腺浸润性导管癌病理分级、肿瘤直径有关(P<0.05),与有无淋巴结转移、年龄、ER、PR、HER-2均无关(P>0.05)。免疫荧光法检测结果显示癌组织中Beclin 1蛋白的阳性表达率(30.0%)明显低于癌旁组织(100.0%)(P<0.05)。免疫印迹法检测结果显示癌旁组织中Beclin l蛋白的相对表达量为0.43±0.12,明显高于癌组织(0.20±0.18)(P<0.05)。结论乳腺浸润性导管癌组织中Beclin 1蛋白表达明显降低,Ki67蛋白表达明显升高。

艾瑞德免疫分析仪C反应蛋白检测项目的性能评价

目的 对检测C反应蛋白的艾瑞德干式免疫分析仪进行性能验证,确保其结果的准确、可靠。方法 参考美国临床和实验室标准化协会（CLSI）推荐的EP5-A2文件进行精密度验证,参考EP15-A2文件进行正确度的验证,参考EP6-A2文件进行线性范围的验证,参考CLSI C28-A2文件进行参考区间的验证,参考常规检测方法进行携带污染率的验证。结果 全血高、低浓度批内精密度分别为3.29%、3.68%,总精密度分别为4.91%、5.26%;参考区间为0~10mg/L;线性回归方程Y=1.070 2 X＋0.448 4,r=0.979;线性范围为2.5~160.0mg/L;携带污染率小于1%。结论 艾瑞德免疫分析仪具有良好的精密度、准确度,较宽的线性范围、较快的检测速度等优点,适用于临床检测。

尿多酸肽作用于肺肿瘤小鼠的研究

目的:研究尿多酸肽(CDA-2)作用于转移性肺肿瘤小鼠的机制。方法通过注射鼠Lewis 肺癌细胞到C57BL/6小鼠体内建立小鼠转移性肺癌模型。采用HE染色对小鼠肺部肿瘤数、肿瘤大小进行评价。利用Kaplan-Meier (K-M)生存率曲线分析小鼠生存情况。免疫组化方法检测小鼠肿瘤增殖抗原 Ki-67的表达;TUNEL凋亡免疫组化染色观察肿瘤细胞的凋亡。结果经CDA-2治疗后,小鼠的肺肿瘤数和最大肿瘤尺寸均显著低于 PBS组肿瘤小鼠,并且CDA-2呈剂量依赖性抑制肿瘤的生长(均P<0.05)。K-M结果显示,使用PBS组肿瘤小鼠的生存时间显著低于CDA-2治疗组,且随着CDA-2剂量增加肿瘤小鼠生存时间不断延长。免疫组化染色结果显示,肺肿瘤小鼠经CDA-2治疗后,Ki-67阳性肿瘤细胞数显著低于PBS治疗的肿瘤小鼠(P<0.05);而肿瘤凋亡细胞数却明显高于 PBS组(P<0.001)。结论 CDA-2可抑制小鼠肺癌的生长;延长肺癌小鼠的生存期;抑制肿瘤细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡。

苯基乙酰对小鼠移植性肺癌的抑制作用及其机制

目的观察苯基乙酰(PG)对肺癌的抑制作用,并探讨其作用机制。方法选择C57BL/6小鼠40只,尾静脉注射肺癌LLC细胞建立肺癌模型。随机将成模小鼠分为PG组、PBS组各20只,PG组腹腔内注射800 mg/kg PG,PBS组腹腔内注射等量PBS,连续10天。两组各随机取5只,计数肺肿瘤个数、测量肿瘤最大直径;各随机取5只,采用Western blotting法观察肺癌组织Bcl-2、Bcl-XL、细胞凋亡抑制蛋白1(c IAP1)、Survivin、增殖细胞核抗原(PCNA)表达。剩余小鼠收集支气管肺泡灌洗液(BALF),取5只小鼠的BALF,检测炎症细胞(包括WBC总数及分类)及炎症因子(TNF-α、IL-6、趋化因子);剩余小鼠的BALF,采用电泳迁移位移试验观察NF-κB DNA结合活力。结果与PBS组比较,PG组肺肿瘤个数和肿瘤最大直径明显减少或降低(P均<0.05)。Western blotting结果显示,PG组Bcl-2、BclXL、c IAP1、Survivin及PCNA表达均明显下调,BALF中巨噬细胞中NF-κB与靶DNA结合活性明显被抑制。与PBS组比较,PG组可显著降低BALF中各种炎性细胞数量及炎症因子水平(P均<0.05)。结论 PG能明显抑制小鼠肺癌的生长,其机制与诱导肿瘤细胞凋亡、抑制巨噬细胞中NF-κB活性、减轻肺部炎症反应有关。

CDA-2抑制肺癌生长的炎症机制研究

目的探究尿多酸肽(CDA-2)抑制肺癌生长的作用及炎症机制。方法通过给雌性C57BL/6小鼠尾静脉注射LLC细胞,建立小鼠肺癌模型。采用肿瘤计数和测量大小评价CDA-2对肺肿瘤增殖的影响;收集经CDA-2治疗过的小鼠肺支气管肺泡灌洗液(BALF)并分离肺泡巨噬细胞,采用白细胞分类计数、电泳迁移位移试验(EMSA)、ELISA试验,研究CDA-2抑制肿瘤的作用机制。结果与对照相比,CDA-2明显抑制小鼠肺肿瘤的生长,肿瘤数和肿瘤尺寸显著下降(P<0.05)。经CDA-2处理后支气管肺泡灌洗液(BALF)的巨噬细胞中的NF-κB与靶DNA结合的活性被强烈的抑制。此外,CDA-2处理显著减少BALF中各种炎性细胞的数量(P<0.05),以及炎症因子TNFα,IL-6,KC在肺组织中的表达(P<0.05)。结论 CDA-2能抑制肺肿瘤的生长,通过抑制髓系细胞中NF-κB的活性,减少肺部炎症,可能是CDA-2抑制肺癌的生长的机制。

抗菌肽hCAP18在结肠癌患者血清中的表达及其临床应用价值

目的探讨结肠癌患者血清中抗菌肽人类阳离子抗菌蛋白18（hCAP18）水平的变化及其在结肠癌辅助诊断和预后中的价值。方法采用病例对照研究。选择同济大学附属同济医院胃肠外科2014年1月至2015年6月结肠癌患者标本68例及同期体检科40名健康对照者进行研究，用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中hCAP18的浓度，并比较结肠癌患者术前和术后血清中hCAP18的浓度变化情况；免疫组化检测结肠癌组织中的hCAP18的表达；采用溴脱氧核苷尿嘧啶（BrdU）——酶联免疫吸附试验（ELISA）法和软琼脂克隆形成实验检测hCAP18对结肠癌细胞增殖能力的影响。通过分析受试者工作特征曲线（ROC）判断hCAP18浓度在结肠癌诊断中的敏感度、特异度。采用t检验和单因素方差分析等方法进行统计学分析。 结果血清hCAP18水平在结肠癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者中分别为（0.46±0.18）mg/L、（0.65±0.45）mg/L、（1.26±0.68）mg/L、（2.35±1.06）mg/L，均值为（1.16±0.88）mg/L；显著高于健康对照组的（0.19±0.07）mg/L，差异有统计学意义（t＝5.290，P〈0.05）；在结肠癌患者肿瘤切除后30 d血清中hCAP18的浓度为（0.26±0.06）mg/L，明显低于术前均值（1.16±0.88）mg/L，差异有统计学意义（t＝3.971，P〈0.05）；免疫组化结果显示与癌旁组织相比，结肠癌组织中hCAP18高表达；BrdU-ELISA法检测的结果显示，用浓度为0.05 ～ 1.00 mg/L的hCAP18在处理后，HCT116和SW480细胞的增殖能力明显增加；软琼脂克隆形成实验显示结肠癌细胞HCT116和SW480经1.00 mg/L hCAP18处理后，HCT116细胞克隆簇大小由（145.40±35.20）μm增加到（370.80±32.65）μm，差异有统计学意义（t＝10.50，P〈0.05），数量分别由（8.50±2.30）个增加到（42.80±6.60）个，差异有统计学意义（t＝3.945，P〈0.05）；SW480细胞克隆簇的大小由（101.00±27.10）μm增加到（369.00±27.29）μm，差异有统计学意义（t＝15.58，P〈0.05），数量分别由（6.20±1.70）个增加到（46.00±7.20）个，差异有统计学意义（t＝4.775，P〈0.05）；血清hCAP18检测结肠癌的ROC曲线下为0.93（95% CI＝0.859～0.999），对结肠癌诊断的敏感度和特异度分别达到91.17%和80.00%，优于结肠癌肿瘤标记物癌胚抗原（CEA）[0.78 （95% CI＝0.699～0.933）]对结肠癌的辅助诊断效能，差异有统计学意义（t＝4.519，P〈0.05）。 结论血清hCAP18检测对结肠癌的辅助诊断具有良好的敏感度和特异度，有可能成为一项潜在的检测指标应用于结肠癌的无创诊断和病情检测；hCAP18能促进结肠癌细胞的增殖，在结肠癌的进展过程中扮演着重要的作用。

维甲酸诱导基因G抑制小鼠肺癌生长作用机制

目的肺癌是世界范围内患病率和死亡率最高的恶性肿瘤,建立小鼠肺癌模型是研究肺癌成因、预防与治疗的重要途径.本研究通过构建维甲酸诱导基因G(retinoic acid induced gene G,RIG-G)过表达的小鼠肺癌模型,探讨RIG-G抑制小鼠肺癌生长的作用机制.方法实验分为Lewis肺癌细胞(Lewis lung cancer,LLC)注射组和LLC-RIG-G注射组(前期构建好的RIG-G基因过表达稳转细胞株),分别将LLC和LLC-RIG-G通过尾静脉注射C57BL/6J小鼠体内,建立小鼠转移性肺癌模型.对小鼠肺质量及肺肿瘤表面结节数进行评价,利用Kaplan-Meier生存率曲线分析小鼠生存情况,免疫组织化学方法检测小鼠RIG-G和肿瘤增殖抗原Ki-67表达,采用原位末端转移酶标记技术(terminal deoxynu-cleotidyl transferase-mediated nick end labeling,TUNEL)检测肺肿瘤的凋亡,实时荧光定量聚合酶链反应法(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测肺组织中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)和白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)的变化,采用蛋白质印迹法检测肺肿瘤组织中RIG-G、信号转导转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、磷酸化STAT3、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达.结果 LLC注射组和LLC-RIG-G注射组小鼠肺质量分别为(0.76±0.02)和(0.39±0.01)g,t=15.24,P=0.001;肺肿瘤表面结节数分别为(28.65±1.77)和(9.45±0.62)个,t=10.28,P=0.001.生存分析结果显示,LLC注射组小鼠中位生存时间为31.5(27~41)d,短于LLC-RIG-G注射组的53(39~65)d,χ^2=16.53,P=0.01.免疫组化显示,LLC注射组RIG-G阳性细胞数为(5.43±0.14)个/高倍镜视野,低于LLC-RIG-G注射组(42.21±3.42)个/高倍镜视野,差异有统计学意义,t=10.74,P=0.001;LLC注射组Ki-67阳性细胞数为(29.90±1.06)个/高倍镜视野,高于LLC-RIG-G注射组(5.60±0.16)个/高倍镜视野,差异有统计学意义,t=22.6,P=0.001.qRT-PCR结果显示,TNF-α在LLC注射组和LLC-RIG-G注射组的mRNA相对表达量分别为1.02±0.11和0.38±0.04,t=5.39,P=0.006;IL-6 mRNA相对表达量分别为0.98±0.08和0.28±0.06,t=7.04,P=0.002.蛋白质印迹法检测结果显示,LLC注射组和LLC-RIG-G注射组STAT3蛋白表达的积分光密度值(integrated optical density,IOD)分别为2.58±0.44和0.89±0.24(t=10.14,P=0.002),Phosphorylated-STAT3分别为0.76±0.15和0.18±0.02(t=14.37,P=0.001),PCNA分别为1.58±0.26和0.78±0.15(t=5.39,P=0.004),Bcl-2分别为1.91±0.37和0.59±0.14(t=6.69,P=0.002),VEGF分别为1.64±0.32和0.48±0.12(t=6.38,P=0.001),差异均有统计学意义.结论 RIG-G能够抑制转移性小鼠肺癌的生长,其作用机制是通过抑制STAT3信号通路;同时发现炎性因子TNF-α和IL-6参与肺癌进展.

慢病毒介导可调控表达维甲酸诱导基因G的肺癌细胞A549的建立

为了进一步研究维甲酸诱导基因G（RIG-G）基因,特别是RIG-G基因的肿瘤抑制功能是否可以复现在肺癌细胞中,我们采用Tet-on表达系统,利用慢病毒载体介导RIG-G基因转染肺癌细胞株A549细胞,建立RIG-G可调控表达的稳转细胞株,观察RIG-G在肺癌细胞A549中的表达及生物学作用.一。

抗菌肽hCAP18在非小细胞肺癌患者血清中的表达及其临床应用价值

目的探讨非小细胞肺癌（NSCLC）患者血清抗菌肽人类阳离子抗菌蛋白18（hCAPl8）水平的变化及其在NSCLC辅助诊断和预后中的价值。方法采用病例对照研究。选择同济大学附属同济医院胸外科2011年1月至2012年1月NSCLC患者标本50例（其中腺癌28例，鳞癌22例）及同期体检科50名健康对照者进行研究，用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测血清中hCAPl8的浓度，并比较NSCLC患者术前和术后血清中hCAPl8的浓度变化情况；通过分析受试者工作特征曲线（ROC）判断hCAPl8浓度在NSCLC诊断中敏感度和特异度。采用t检验和Log—rank检验等方法进行统计学分析。结果NSCLC患者血清中的hCAPl8浓度为（6733．0±771．8）μg／L，明显高于健康对照组的（253．0±6．9）μg／L，差异有统计学意义（t=8．396，P〈0．05）；hCAP18在肺鳞癌和腺癌患者血清中浓度分别为（6300．0±1221．0）μg／L和（7074．0±1005．0）μg／L，差异无统计学意义（t=0．4942，P〈0．05）；在NSCLC患者肿瘤切除后30d血清hCAPl8的浓度为（433．6±38．2）μg／L，明显低于术前的（6733．0±771．8）μg／L，差异有统计学意义（t=8．512，P〈0．05）。血清hCAPl8检测NSCLC的ROC曲线下面积为0．931（95％CI=0．884～0．978），对NSCLC诊断的敏感度和特异度分别达到95．0％和96．3％，优于肺癌肿瘤标志物细胞角蛋白19（CYFRA21．1）[0．873（95％CI=0．758～0．917）]对NSCLC的辅助诊断效能。血清hCAP18〈390．0μg／L的NSCLC患者的复发率为12．5％（4／32），而血清hCAP18〉390．0μg／L的NSCLC患者的复发率为44．4％（8／18），差异有统计学意义（x2=22．64，P〈0．05）。结论血清hCAP18检测对NSCLC的辅助诊断具有良好的敏感度和特异度，有可能成为一项潜在的检测指标应用于肺癌的无创诊断和病情监测。

髓系细胞RelA／p65基因介导吸烟促进小鼠肺癌的生长机制

目的研究吸烟促进小鼠肺癌生长的作用机制。方法使用髓系细胞RelA／p65敲除小鼠（RelA／p65^-/-）和对照WT小鼠建立小鼠转移性肺癌模型，分为吸烟组和空气组，计数小鼠肺表面肿瘤数并对肿瘤大小进行评价，利用Kaplan—Meier生存曲线分析小鼠的生存情况。采用免疫组化法检测小鼠肿瘤增殖抗原Ki-67、肿瘤坏死因子仅（TNF-α）和CD68的表达，采用Westernblot法检测肿瘤细胞cyclinDI和c-myc的表达，采用原位末端转移酶标记技术（TUNEL）检测肿瘤细胞的凋亡，采用酶联免疫吸附（ELISA）试验检测肺肿瘤组织中TNF-α、白细胞介素6（IL-6）和KC的浓度。结果WT小鼠在受到香烟刺激后，肺重量、肿瘤个数和最大肿瘤直径分别为（1．5±0．1）g、（64．8±4．1）个和（7．6±0．2）mm，均明显高于未受香烟刺激的WT小鼠（均P〈0．05）；而RelA／p65^-/-小鼠的肺重量、肿瘤个数和最大肿瘤直径在香烟刺激前后无明显变化（均P〉0．05）。生存分析的结果显示，WT吸烟组小鼠的生存时间明显低于WT空气组（P〈0．05），但RelA／p65^-/-小鼠的生存时间均明显长于WT小鼠（均P〈0．05）。WT空气组、WT吸烟组、RelA／p65^-/-空气组和RelA／p65^-/-吸烟组小鼠Ki-67阳性肿瘤细胞的百分比分别为（43．4±2．9）％、（60．6±5．4）％、（12．8±3．6）％和（15．0±4．2）％，香烟刺激后，WT小鼠Ki-67阳性肿瘤细胞百分比明显增高（P〈0．05），而RelA／p65^-/-小鼠Ki-67的表达无明显变化（P〉0．05）。WT空气组、WT吸烟组、RelA／p65^-/-空气组和RelA／p65^-/-吸烟组小鼠肿瘤细胞的凋亡率分别为（11．6±1．7）％、（13．0±2．0）％、（13．2±2．0）％和（11．0±1．4）％，差异均无统计学意义（均P〉0．05）。WT小鼠受到香烟刺激后，肿瘤细胞中cyclinD1和c—myc蛋白的表达明显增强；而RelA／p65^-/-小鼠受到香烟刺激后，肿瘤细胞中cyclinD1和c—myc蛋白的表达没有明显变化。香烟刺激后，渗入到肿瘤组织中的巨噬细胞的数量无论在WT还是RelA／p65^-/-小鼠中均明显增加（P〈0．05）。wT小鼠在香烟刺激后，肿瘤组织中TNF-α、IL-6和KC的表达均明显升高（P〈0．05）。结论吸烟促进了小鼠肺癌的生长，髓系细胞的RelA／p65基因介导了吸烟的促肿瘤生长效应，由RelA／p65基因调控的TNF-α表达可能参与了肺癌的发展。

肿瘤相关巨噬细胞分泌的抗菌肽cathelicidin促进小鼠结直肠癌生长的作用及机制

目的研究肿瘤相关巨噬细胞分泌的抗菌肽cathelicidin促进小鼠结直肠癌生长的作用及机制。方法通过氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠（AOM/DSS）方法建立小鼠肠炎相关的结直肠癌模型。对诱导成瘤的小鼠，同时每隔3 d注射1次小鼠cathelicidin中和抗体、IgG抗体（阳性对照）和PBS（阴性对照），持续1个月，取小鼠结肠，拍照、计数肿瘤数目并进行评价。利用实时荧光定量PCR和Western blot法检测小鼠结肠肿瘤组织、非肿瘤组织以及组织中巨噬细胞cathelicidin的表达；采用免疫组化法检测小鼠结肠肿瘤组织与非肿瘤组织中的cathelicidin、肿瘤增殖抗原Ki-67和CD68的表达；采用原位末端转移酶标记技术（TUNEL）检测小鼠结肠肿瘤组织中细胞的凋亡情况。结果cathelicidin在小鼠结肠肿瘤组织的炎症免疫细胞（巨噬细胞）中呈高表达状态，而在肿瘤细胞中表达较弱。注射cathelicidin中和抗体组小鼠的肿瘤数目和长径分别为（4.50±1.18）个和（1.74±0.18）mm，明显低于注射PBS组小鼠的肿瘤数目[（13.88±1.98）个，P〈0. 01]和肿瘤长径[（3.74±0.38）mm，P〈0. 01]；也明显低于注射IgG抗体小鼠的肿瘤数目[（15.25±1.82）个，P〈0. 01]和肿瘤长径[（3.40±0.36）mm，P〈0.01]。注射cathelicidin中和抗体组肿瘤组织中Ki-67阳性肿瘤细胞百分比为（28.20±3.44）%，低于注射PBS组[（68.20±3.51）%，P〈0.01]和注射IgG抗体组[（69.20±3.41）%，P〈0.01]。免疫组织化学染色检测结果显示，注射cathelicidin中和抗体组小鼠组织中CD68的表达明显低于注射IgG抗体组和注射PBS组。TUNEL染色显示，注射cathelicidin中和抗体对肿瘤细胞的凋亡影响不大。结论肿瘤相关巨噬细胞分泌的cathelicidin具有促进小鼠结直肠癌增殖的作用，中和cathelicidin的表达可以抑制结直肠癌的生长和增殖。cathelicidin通过募集炎症细胞（巨噬细胞）进入肿瘤微环境可能是其促进结直肠癌增殖的主要作用机制。

非肿瘤分泌的抗菌肽cathelicidin促进肺癌生长的作用及其机制

目的 探讨非肿瘤细胞分泌的抗菌肽cathelicidin促进肺癌生长的作用及其机制.方法 Lewis肺癌细胞（LLCl）通过尾静脉注射入cathelicidin敲除小鼠（CRAMP-/-）和对照小鼠（WT）建立小鼠转移性肺癌模型.对小鼠肺重量及表面肿瘤个数进行评价.利用Kaplan-Meier（K-M）生存率曲线分析小鼠生存率.免疫组织化学方法检测小鼠cathelicidin、肿瘤增殖抗原Ki-67和CD68表达;涂片染色计数肺泡灌洗液中各种炎症细胞个数.结果 Cathlicidin在肿瘤组织的炎症免疫细胞中呈高表达状态,而在肿瘤细胞中表达很弱.CRAMP-/-小鼠的肺重量和肿瘤数分别为（0.25±0.04）g和（9.60±2.25）个,均显著低于WT小鼠的（0.65±0.05）g和（23.40±2.68）个（t=6.07、3.95,均P＜0.05）.K-M生存率分析结果显示,CRAMP-/-小鼠的中位生存时间为49（46 ～51）d,长于Wr小鼠的34（28 ～39） d（x2 =12.00,P＜0.05）,且组织切片中Ki-67阳性肿瘤细胞为（18.80±2.38）％,明显低于WT小鼠的（35.80±2.96）％（=4.48,P＜0.05）.肺泡灌洗液炎症细胞计数显示,CRAMP-/-小鼠的总细胞、中性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞数量分别为（4.72±0.86）×104个、（0.08±0.02）×104个、（0.05±0.02） ×104个和（4.60±0.84）×104个,均低于WT小鼠的（16.18±1.61）×104个、（0.32±0.05）×104个、（0.20±0.05）×104个和（15.66±1.57）×104个（t=6.28、4.39、3.00、6.20,均P＜0.05）,其中以巨噬细胞数量下降最为明显;免疫组织化学检测结果显示,在肿瘤组织中CRAMP-/-小鼠巨噬细胞的数量为（6.77±3.12）个/高倍视野,明显低于WT小鼠的（15.53±2.28）个/高倍视野（t=3.41,P＜0.05）.结论 非肿瘤细胞分泌的cathelicidin具有促进小鼠肿瘤细胞增殖及肿瘤生长的作用,募集炎症细胞如巨噬细胞进入肿瘤微环境可能是其主要作用机制.

TaqMan—MGB实时荧光定量PCR检测RIG—G基因方法的建立及其方法学验证

目的：建立一种以TaqMan－MGB荧光探针为特点，检测人类急性早幼粒细胞白血病（ M3型）中维甲酸诱导基因G（ RIG－G）的实时荧光定量聚合酶链反应（ RT－qPCR）方法，并运用该方法对正常人、M3患者外周血中的RIG－G表达水平进行分析，探讨其在M3诊断中的价值。方法方法学建立。针对人RIG－G基因设计特异性引物和TaqMan－MGB荧光探针，以逆转录的互补DNA为模板，建立TaqMan－MGB实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线；在方法特异性、正确度、精密度、分析灵敏度、干扰物质等各方面对检测方法的性能进行评估，并用该法验证20例M3患者外周血与骨髓中RIG－G表达水平相关性，同时检测40份正常人及20份M3患者标本，t检验比较两组外周血RIG－G水平，用ROC曲线分析其对M3的检测效能。结果 RIG－G标准品拷贝数log值与循环阈值数（ Ct ）的标准曲线方程为：Y＝－3．539X＋42．952，R^2＝0．999，呈良好的线性关系。用建立的实时荧光定量PCR方法检测标准品，结果与已知值比较，相关性系数r＝0．999，计算偏倚值均＜5％；分别选取高值（107拷贝／μl）、中值（104拷贝／μl）、低值（10^1拷贝／μl）3个浓度，批内CV分别为1．38％、2．31％、7．56％；批间CV分别为0．71％、1．17％、5．07％，均＜10％；该方法的分析灵敏度为101拷贝／μl。 M3患者外周血与骨髓中RIG－G表达水平相关系数为r＝0．996，斜率b＝0．973，结果相关性良好，t＝0．099，P＞0．05，显示两组标本检测结果差异无统计学意义。40份正常健康体检外周血RIG－G基因的拷贝数[3．62×10^4（1．61×10^4～4．90×10^4）拷贝／μl]与M3患者[7．10×10^2（5．43×10^2～2．21×10^3）拷贝／μl]差异有统计学意义（U＝18，P＜0．001）。结论成功建立了检测人外周血RIG－G基因的TaqMan－MGB荧光实时定量PCR方法。该法具有较好的正确度、精密度、灵敏度及特异性，能够为临床M3患者的早期诊断及治疗监测提供必要帮助。