抗菌肽与碱性成纤维细胞生长因子基因的融合及其在酵母中的表达

从重组质粒ｒＢＳ上切下柞蚕抗菌肽Ｄ基因片段，切去终止密码后连接到重组穿梭质粒ｐＶＴ－ＧＦ上碱性成纤维细胞生长因子ｃＤＮＡ的５′端，使密码框正确排列，构建成融合基因重组质粒ｐＶＴ－ＣＤＧＦ，转化到酵母中进行表达。转化子酵母蛋白粗提物用Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２Ｄ３１作指示菌进行抑菌圈测试，初步检出具有抑菌活性，用ＥＬＩＳＡ检测证明其具有碱性成纤维细胞生长因子的抗原性。

三七总皂苷丹参注射液苦参碱对大鼠肝癌细胞CBRH-791生长的抑制作用

目的:观察不同浓度三七总皂苷、丹参注射液、苦参碱对体外培养大鼠肝癌细胞CBRH7919增殖的影响。方法:应用MTT比色法研究三七总皂苷、丹参注射液、苦参碱对体外培养大鼠肝癌细胞CBRH7919影响的量效关系。结果:在药物作用72h条件下,20mL/L的丹参注射液对CBRH7919细胞的体外抑瘤率均可达85%,IC50为12.5mL/L;而三七总皂苷低浓度对CBRH7919无抑制作用,在100mg/L以上浓度对CBRH7919细胞有抑制作用,140mg/L浓度的抑制达40.7%;苦参碱在10mg/L浓度下对CBRH7919无抑制作用,在50mg/L浓度以上对CBRH7919细胞有抑制作用,250mg/L的浓度下的抑制率为40.5%。结论:丹参注射液、三七总皂苷、苦参碱对体外培养的大鼠肝癌细胞CBRH7919增殖具有直接的抑制作用,并且呈浓度依赖性。

丹参素钠对大鼠肝癌细胞及自杀基因旁观者效应的影响

目的:探讨丹参素钠对大鼠肝癌细胞及自杀基因旁观者效应影响。方法:丹参素钠与丙氧鸟苷(GCV)分别或共同作用于大鼠肝癌CBRH7919的tk-细胞,以及含5%tk+细胞的tk+和tk-混合细胞,MTT检测各组存活率,两两比较各组存活率的差异,用q值分析药物与自杀基因系统联合的相互作用是否为协同性。结果:丹参素钠12.5、25、50、100 mg/L作用于CBRH 7919细胞72h存活率分别为87.8±12.4%、46.0±6.4%、20.2±4.6%、8.9±1.2%;IC50为24mg/L。10mg/L和50mg/L组的丹参素钠联合5%tk+/GCV组的细胞存活率比单纯丹参素钠或单纯自杀基因组明显低,两两比较差异有统计学意义(P<0.05),q值均>1.15。结论:丹参素钠有明显抑制癌细胞生长作用,并能协同性增强tk/GCV系统对癌细胞的杀伤作用,增强自杀基因旁观者效应。

单纯疱疹病毒胸苷激酶与绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建

目的建立既有TK活性又表达绿色荧光的融合蛋白治疗系统用于实验研究,为建立荧光活体成像技术,更为科学地进行肿瘤自杀基因增效中药成分的研究打下基础。方法DNA重组技术构建HSV1-TK cDNA与EGFP基因融合的真核细胞表达载体pTKGFP,用酶切鉴定并进行序列测定;polyFect转染液对鼠黑色素瘤细胞B16进行转染,荧光显微镜观察基因表达情况,MTT法检测转化细胞B16对GCV的敏感性。结果重组质粒pTKGFP经限制性酶切鉴定和DNA序列测定分析显示,TK基因已经成功与GFP基因连接,连接处无移码突变产生;荧光显微镜下观察显示,TK-GFP融合基因在B16中获得表达。其在细胞中的定位与文献资料一致,TKGFP主要集中于胞核区而GFP弥散分布于胞质中。TKGFP组细胞对GCV的敏感性大于对照组细胞,差异有显著性。结论构建了pTKGFP融合蛋白基因表达载体,并成功在B16中进行表达,所表达的融合蛋白具有TK活性和GFP的荧光活性,可用于后续性的体外与体内实验。

HSV1-TK自杀基因系统对小鼠肝癌细胞移植瘤的抑制效应

目的:构建表达单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV1-tk)的重组逆转录病毒,建立HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统并检测其对小鼠肝癌细胞H22移植瘤的抑制效应.方法:构建携带HSV1-tk基因的逆转录病毒载体pLXSN-tk,用PolyFectTransfection试剂介导重组逆转录病毒转染入包装细胞系PT67,通过G418筛选建立稳定产病毒的细胞株,将该重组逆转录病毒感染小鼠肝癌细胞H22,以G418筛选的抗性克隆(命名为H22/tk);将H22/tk细胞与未经基因修饰的H22细胞按1:4混合接种小鼠皮下,联合应用GCV,观察其抑瘤作用(n=19).结果:经酶切鉴定和DNA序列测定,证明HSV1-tk基因成功定向插入到pLXSN逆转录病毒载体中;重组病毒DNA转染包装细胞PT67,获取病毒滴度为4×107cfu/L的重组逆转录病毒培养液;感染小鼠肝癌细胞H22后再筛选出G418抗性克隆株H22/tk.H22/tk细胞与H22细胞混合所致荷瘤鼠在GCV治疗前,各组间肿瘤体积无显著性差异;GCV治疗后,与对照组相比,GCV治疗组肿瘤的生长明显受到抑制,到第8,10,12,14d,致瘤模型对照组的肿瘤体积分别为356±205,635±382,963±580,1509±1105mm3,而GCV治疗组分别为231±155(VS对照组,t=-2.25,P=0.03),413±252(vs对照组,t=-2.14,P=0.04),592±420(vs对照组,t=-2.38,P=0.02),939±847mm3(vs对照组,t=-1.92,P=0.06),GCV治疗组的肿瘤生长抑制率分别为35.0%,35.0%,38.5%,37.8%.结论:成功获取表达HSV1-tk基因的逆转录病毒,已建立显示出体内抑瘤活性的自杀基因治疗系统,为进一步研究中医药对自杀基因抗肿瘤的增效作用奠定基础.

山奈酚对人胃癌MGC-803细胞的生长抑制及诱导凋亡作用

目的:探讨山奈酚(kaempferol)对人胃癌MGC-803细胞的生长抑制作用,以及诱导细胞凋亡和对细胞周期的影响。方法:采用MTT法检测细胞存活率;DAPI染色法观察细胞的凋亡形态;彗星电泳技术和FCM检测不同浓度山奈酚对细胞中DNA的影响。结果:山奈酚体外能明显抑制人胃癌MGC-803细胞的增殖。用不同浓度(6.25、12.5、25、50和100μmol/L)的山奈酚处理MGC-803细胞72h后,细胞的生长抑制率分别为10.32%、13.95%、21.58%、35.18%和58.13%,各药物处理组与对照组比较,P值均<0.01,呈剂量效应关系。50和100μmol/L山奈酚分别作用细胞24、48、72和96h后,结果显示药物作用的时间越长,对细胞的抑制作用越强,呈时间效应关系。DAPI染色结果显示,不同浓度药物组的细胞均有明显的细胞凋亡特征。30、60和120μmol/L山奈酚作用于细胞72h后,彗星电泳检测结果显示细胞后面均呈现拖尾现象,细胞头部平均光密度值较阴性对照组降低,彗星尾距较阴性对照组增加,各药物组与对照组比较,P值均<0.01,且与药物浓度呈相关性。FCM检测结果显示,浓度为30、60和120μmol/L的山奈酚作用于细胞72h后,出现亚二倍体凋亡峰,细胞周期被阻滞于S期和G2/M期,各药物组凋亡率较阴性对照组均明显升高。结论:山奈酚能抑制人胃癌细胞MGC-803的增殖并诱导其凋亡。

薯蓣皂苷对人肾癌786-0细胞缝隙连接功能的影响

目的探讨薯蓣皂苷(Dioscin,Dio)对人肾癌786-0细胞缝隙连接(Gap junction,GJ)功能的影响及其作用机制。方法 MTT法测Dio对786-0细胞生长的影响,荧光显微镜观察及流式细胞术结合荧光示踪法分析GJ功能变化,RT-PCR和Western blot分析连接蛋白基因表达。结果 0～2.5μmol.L-1 Dio处理786-0细胞48h不影响其存活率;用0、0.1、0.5、1和2μmol.L-1 Dio处理细胞48 h后,荧光显微镜下观察,Dio能明显提高786-0细胞Calcein传递,流式细胞术分析对照组和实验组的绿色荧光细胞(G4)与双阴性受体细胞(G3)比值(G4/G3)分别是0.13±0.01、0.23±0.01、0.30±0.01、0.56±0.02和1.15±0.02,各实验组G4/G3值明显高于对照组(P<0.01);RT-PCR和Western blot分析结果显示,用0、0.1、0.5、1和2μmol.L-1 Dio处理细胞48 h对其Cx43、Cx32和Cx26表达无明显影响。结论体外较低浓度Dio能够有效促进786-0细胞GJ功能,且具有明显的剂量效应关系。但Dio促进GJ机制并不是通过上调Cx43、Cx32和Cx26蛋白表达途径。

山奈酚对大鼠肝癌细胞CBRH7919的增殖抑制及诱导凋亡作用

【目的】观察山奈酚对大鼠肝癌细胞CBRH7919增殖抑制、诱导凋亡和细胞周期的影响。【方法】选用CBRH7919肝癌细胞株,传代培养24 h后,加入不同浓度山奈酚处理,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞存活率,4,′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色观察细胞凋亡形态,彗星电泳技术和流式细胞术检测药物对细胞DNA的作用。【结果】山奈酚体外能抑制大鼠肝癌细胞CBRH7919的增殖,以6.25、12.5、25、50、100μmol/L浓度的山奈酚处理细胞72 h,对CBRH7919细胞的增殖抑制率显著升高,呈明显的剂量效应关系。用50、100μmol/L浓度的山奈酚作用于细胞24、48、72、96 h,对细胞的增殖抑制作用显著增强,呈明显的时间效应关系,即药物作用时间越长,抑制作用越强。DAPI染色显示不同浓度山奈酚组的细胞均有明显的细胞凋亡特征。彗星电泳显示30、60、120μmol/L浓度的山奈酚作用于细胞72 h后,细胞后面均呈现长度不等的拖尾,平均光密度值较空白对照组显著降低(P<0.01),彗星尾距较空白对照组显著增加(P<0.01),且两者改变与药物浓度相关。流式细胞仪检测结果显示30、60、120μmol/L浓度的山奈酚作用于细胞72 h出现亚二倍体凋亡峰,细胞周期被阻滞于S期,不同浓度山奈酚组凋亡率较空白对照组均明显增高。【结论】山奈酚可能通过抑制大鼠肝癌细胞CBRH7919的增殖及诱导其凋亡而产生抗肿瘤作用。

小檗碱、吴茱萸碱和靛玉红对人胃癌细胞的作用比较

目的:探讨加味左金丸三种组成中药的主要单体成分小檗碱、吴茱萸碱和靛玉红对人胃癌细胞生长抑制、诱导凋亡和细胞周期的影响. 方法:人胃癌细胞株为低分化黏液腺癌MGC803细胞; 小檗碱、吴茱萸碱和靛玉红购自中国药品与生物制品检定所.苔盼蓝染色细胞计数法测定细胞存活率和凋亡率,流式细胞技术进行细胞周期、凋亡百分比分析,甲基绿-派诺宁联合染色法观测凋亡形态,琼脂糖凝胶电泳分析DNA损伤情况. 结果:96 h内小檗碱、吴茱萸碱各组细胞存活率不断下降,其中48 h存活率对照组为100.0±7.9%,小檗碱4 mg/L和8 mg/L组分别为72.9±6.2%(t=4.67, P<0.01)和17.4±4.8%(t=15.48,P<0.001),吴茱萸碱1 mg/L和5 mg/L组分别为37.8±5.7%(t=11.06, P<0.001)和10.7±11.1%(t=11.35,P<0.001);各组均与对照组比较(n=3);对生长的抑制作用呈时间、药物浓度依赖性.甲基绿-派诺宁原位染色,细胞表现出凋亡特征.小檗碱与吴茱萸碱组脱落的悬浮死细胞中有较高比例胞膜完整、抗拒苔盼蓝和酚红染色的凋亡细胞, 其中48 h凋亡率对照组为0.3±0.0%,小檗碱8 mg/L 组为65.2±9.5%(t=11.83,P<0.001);吴茱萸碱1 mg/L组为58.9±11.4%(t=8.90,P<0.001),而阿霉素组脱落死细胞不能抗拒苔盼蓝和酚红染色.流式细胞仪检测表明小檗碱与吴茱萸碱组均出现亚二倍体凋亡峰;细胞周期分别阻滞于G0—G1、G2期;凋亡百分比与对照组11.8±2.5比较,小檗碱4 mg/L组48 h 为18.9±2.7(t=3.34,P<0.05),72 h为23.9±3.3(t=5.06,P<0.01),吴茱萸碱1 mg/L组72 h 为16.6±1.6(t=2.80,P<0.05).琼脂糖凝胶电泳表明,小檗碱组DNA裂成大片段,吴茱萸碱组和阿霉素组DNA断裂呈涂抹状.靛玉红各组对细胞生长、凋亡无影响,DNA无损伤. 结论:小檗碱与吴茱萸碱均能诱导人胃癌细胞凋亡,且作用较阿霉素温和;靛玉红对胃癌细胞的体外作用不明显.

六味地黄丸含药血清对自杀基因治疗黑色素瘤增效作用的缝隙连接机制初探

目的探讨六味地黄丸含药血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统杀伤小鼠黑色素细胞瘤B16细胞增效作用的缝隙连接机制。方法制备六味地黄丸含药血清(分别为2.5%、5.0%、10.0%六味血清)及10.0%对照血清。采用RT-PCR法检测六味地黄丸含药血清对B16细胞株的缝隙链接蛋白(Cx)26和Cx43 mRNA的影响,Western blot法和间接免疫荧光法检测其对B16细胞Cx26和Cx43蛋白表达的影响;RT-PCR检测Cx26-309、Cx26-337、Cx26-367、Cx26-2098 SiRNA对Cx26的干扰效率,选用干扰效率最高的Cx26-2098 SiRNA干扰Cx26基因后观察六味地黄丸联合HSV-tk/GCV的旁观者效应;MTT法检测细胞间缝隙连接通讯功能(gap junctional intercellular communication,GJIC)抑制剂甘草次酸(GA)对六味地黄丸联合tk/GCV系统对B16细胞杀伤作用的影响,实验设为对照血清组,2.5%、5.0%、10.0%六味血清组(简称低、中、高剂量组)及对照血清联合GCV组,低、中、高剂量联合GCV组,低、中、高剂量联合GCV加GA组。GCV终浓度为20mol/L,GA终浓度为50mol/L。结果六味地黄丸含药血清能提高B16细胞中Cx43mRNA及蛋白的表达,且具有量效依赖关系;对Cx26 mRNA与蛋白的表达具有双向调节作用,低剂量时具有抑制作用而高剂量是能上调其表达;SiRNA干扰Cx26基因表达后,六味地黄丸联合自杀基因治疗的旁观者效应与没有干扰前比较无明显的变化;低、中、高剂量联合GCV组在GA阻断前细胞抑制率(48.75%、59.39%、69.28%)与阻断后细胞抑制率(29.14%、38.71%、58.13%)比较,显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论六味地黄丸含药血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统杀伤恶性黑色素瘤B16细胞的增效作用与缝隙连接机制有关,可能是通过提高Cx26和Cx43等缝隙连接蛋白表达而达到协同增效作用。

吴茱萸碱对人肝癌细胞HepG2的生长抑制及诱导凋亡作用

目的探讨吴茱萸碱对人肝癌细胞HepG2的生长抑制、诱导凋亡和对细胞周期的影响。方法体外试验MIT法测存活率,DAPI染色观察细胞凋亡形态,流式细胞术、彗星电泳技术分析药物对DNA作用。结果吴茱萸碱能抑制人肝癌细胞HepG2的生长。用64、16、4、1、0.25μmol.L-1浓度的吴茱萸碱处理HepG2细胞72 h的抑制率分别为74.0%、69.0%、60.5%、44.0%、16.4%。DAPI染色后吴茱萸碱组癌细胞均表现出较为典型的细胞凋亡特征。流式细胞仪检测1μmol.L-1吴茱萸碱作用24和36 h出现亚二倍体凋亡峰,细胞周期阻滞于G2/M期。凋亡率对照组为4%,1μmol.L-1吴茱萸碱作用12、24、36 h的凋亡率分别为4.4%、18.0%、30.3%。彗星电泳显示1μmol.L-1吴茱萸碱作用24和48 h后,细胞后面形成长的拖尾,平均光密度值较阴性对照组降低,彗星尾距较阴性对照组增加,且二者的改变与作用时间相关。结论吴茱萸碱能抑制人肝癌细胞HepG2的生长及诱导其凋亡。

参附注射液、高乌甲素注射液诱导白血病细胞株HL-60分化、凋亡的研究

【目的】观察参附注射液及高乌甲素注射液诱导白血病细胞株HL-60分化、凋亡的作用,初步验证温阳法治疗肿瘤的理论。【方法】采用人类急性白血病细胞株HL-60为模型,设参附注射液组(终浓度分别为12.5、25、50、100μL/mL),高乌甲素组(终浓度分别为25、50、100μL/mL),亚砷酸钠对照组(终浓度分别为0.25、2、15μmol/L)及阴性对照组;检测细胞增殖、细胞形态、硝基四氮唑蓝(NBT)还原能力、细胞周期分布、凋亡率等指标。【结果】参附注射液作用后HL-60细胞增殖受抑制,高乌甲素注射液对HL-60的生长无抑制作用;经药物处理60 h后HL-60细胞均出现程度不同以凋亡为主的形态改变;低浓度参附注射液(12.5μL/mL)、高乌甲素注射液(50μL/mL)作用60 h后HL-60细胞NBT还原能力增强,而其他浓度组NBT还原能力反未增强;药物处理60 h后,100μL/mL高乌甲素液及25.50μL/mL参附液流式细胞仪检测直方图上呈现亚二倍体凋亡峰,凋亡率呈不同程度增高。【结论】参附注射液、高乌甲素注射液对人类急性白血病细胞株HL-60具有不同程度的诱导分化和凋亡的双重作用,为温阳法治疗肿瘤提供了一定的理论依据。

六味地黄丸对小鼠移植性肝癌自杀基因治疗的增效作用

【目的】观察六味地黄丸对小鼠皮下移植性肝细胞癌自杀基因治疗的增效作用,探讨建立中西医结合肿瘤自杀基因联合治疗方案的可行性。【方法】培养病毒包装细胞PT67/tk,病毒上清感染肝细胞癌细胞株H22后用G418筛选2周,获得抗性细胞克隆,命名为H22/tk并进行体外丙氧鸟苷(GCV)杀伤试验;证明杀伤活性后,将H22/tk与野生型H22按1∶4的比例混合后接种于昆明种小鼠皮下组织内造模,分为模型对照组、自杀基因治疗组、六味地黄丸治疗组和联合治疗组(N=20),并设正常对照组(N=10);六味地黄丸治疗从接种第2天起共15 d,GCV治疗从接种第6天起共11 d,观察疗效。【结果】体外实验中GCV对H22/tk肿瘤细胞具有明显的杀伤效应,表明体外病毒感染肝癌细胞成功,病毒携带的外源性自杀基因已表达且具有生物学活性。体内实验中于接种肿瘤细胞后第6天各组能触摸到肿瘤,成瘤率100%。自杀基因联合六味地黄丸治疗对小鼠移植性肝细胞癌生长速度具有明显抑制作用,以瘤块质量计算,其抑瘤率为63.0%(P<0.05);而单纯六味地黄丸治疗和单纯自杀基因治疗抑瘤率分别为46.3%和37.4%,但两者与模型组比较差异均无显著性意义。病理检查:各治疗组肉眼可见肿瘤体积均较模型对照组肿瘤体积小,以联合治疗组更明显。镜下可见各治疗组肿瘤细胞密度相对较低,肿瘤周围有较多纤维结缔组织增生及炎症细胞浸润,联合治疗组更明显,各组间差别以炎症细胞浸润最突出。【结论】六味地黄丸对小鼠移植性肝癌自杀基因治疗具有一定的增效作用,其疗效优于单纯自杀基因疗法或单纯六味地黄丸治疗。

六味地黄丸含药血清调控黑色素瘤B16细胞株缝隙连接蛋白表达的作用

【目的】观察六味地黄丸含药血清调控小鼠黑色素瘤B16细胞株缝隙连接蛋白(Cx)表达的作用。【方法】采用SD大鼠灌胃8 d制备六味地黄丸含药血清(药物剂量为32 g.kg-1.d-1)和对照血清(灌胃等容积生理盐水);选择对B16细胞生长和形态影响不大的血清浓度(体积分数为10%)作为大鼠血清的工作浓度;采用Western blot技术和间接免疫荧光法及流式荧光法检测六味地黄丸含药血清对黑色素瘤B16细胞株缝隙连接蛋白(Cx26/30/32)表达的影响。【结果】Western blot检测显示空白组(无鼠血清)3种Cx几乎不表达,而对照血清和六味地黄丸各浓度含药血清均能提高Cx蛋白的表达,但含药血清的作用更为明显且有显著的量效关系;间接它被荧光法和流式荧光法检测显示类似的结果:对照血清组和中、高剂量含药血清组的Cx蛋白荧光强度均较空白组显著增加(P<0.01),但与对照血清组比较,只有高剂量含药血清组荧光强度显著增加(P>0.05),低剂量含药血清组Cx蛋白表达反而下降(P<0.01)。【结论】六味地黄丸含药血清具有调控小鼠黑色素瘤B16细胞株缝隙连接蛋白表达的作用。

六味地黄丸入血成分增效自杀基因杀伤肝癌细胞的缝隙连接机制

【目的】探讨六味地黄丸主要入血成分处理的淋巴上清对大鼠肝癌细胞CBRH7919缝隙连接功能的影响,以期阐明其增强自杀基因疗法杀伤肝癌细胞效应的作用机制。【方法】取大鼠脾淋巴细胞,加入六味地黄丸的5种主要入血成分,体外培养后取含药淋巴上清,采用流式细胞术结合荧光示踪法分析其对细胞缝隙连接通讯功能(GJIC)的影响;利用Western blot法检测含药淋巴上清对大鼠肝癌CBRH7919细胞Cx43蛋白表达的影响;利用GJ阻滞剂甘草次酸(GA)观察阻滞GJIC后,含药淋巴细胞上清联合tk/GCV系统对细胞杀伤作用的影响。【结果】流式细胞术结合荧光示踪法结果表明,占培养液15%(体积分数)的含药淋巴上清能促进大鼠肝癌CBRH7919细胞的GJIC功能;Western blot法结果显示,含药淋巴细胞上清能提高大鼠肝癌CBRH7919细胞Cx43蛋白的表达水平;GA阻断GJIC功能后,含药淋巴细胞上清联合tk/GCV系统对细胞杀伤作用降低。【结论】六味地黄丸入血成分处理的淋巴上清可通过缝隙连接机制发挥对自杀基因杀伤大鼠肝癌细胞的增效作用。

自杀基因系统联合六味地黄丸对肝癌细胞杀伤的协同作用

【目的】观察六味地黄丸含药血清协同HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统杀伤大鼠肝癌CBRH7919细胞的作用,探讨建立自杀基因联合中药方药的肿瘤基因治疗联合方案的可行性。【方法】构建HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统,确定丙氧鸟苷(GCV)工作浓度(39.2μmol/L);选用SD大鼠灌胃制备六味地黄丸含药血清和空白血清,并观察含药血清和空白血清对肿瘤细胞生长的影响。设空白对照组、GCV对照组、自杀基因治疗对照组,以上3组均为无大鼠血清的对照组。空白血清组、GCV加空白血清组、自杀基因系统加空白血清组、含药血清组、GCV加含药血清组、自杀基因系统联合含药血清组中,所有大鼠的空白血清和含药血清再分为体积分数5%和7.5%2种浓度,每组设6个复孔。将大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk+和CBRH7919/tk-混合,使tk+细胞的比例分别占0%、5%、10%,按3×103个/孔细胞分别接种到96孔板,用完全培养基培养细胞24h后,相应加入体积分数5%或7.5%的大鼠空白血清和含药血清,孵育12h,加入GCV,培养60h,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞存活率,用Q值(实测药效与理论药效的比值)分析自杀基因系统与含药血清联合的相互作用是否具有协同性(0.85≤Q<1.15为相加作用,Q≥1.15为协同作用)。【结果】空白血清和含药血清浓度在体积分数20%以下时未显示明显细胞毒性;血清浓度为体积分数5%和7.5%时,自杀基因系统联合含药血清组与单独含药血清组及自杀基因系统加空白血清组比较,联合组对肿瘤细胞的杀伤作用均强于其他非联合组,细胞存活率均有显著性差异(P<0.01),而且自杀基因系统联合含药血清的作用具有明显的协同性(Q>1.15)。【结论】HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统联合六味地黄丸对杀伤肿瘤细胞具有协同增效作用。

逆转录病毒载体介导HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建

[目的]探讨自杀基因抗肿瘤系统构建的方法.[方法]用DNA重组技术将单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV1 tk)定向克隆入逆转录病毒载体pLXSN,并用限制性内切酶进行酶切及测序鉴定;用PolyFect Transfection试剂介导重组逆转录病毒转染入包装细胞系PT67,通过G418筛选建立稳定产病毒的细胞株,将病毒感染人胃癌细胞,检测HSV1 tk自杀基因治疗系统在体外的抗肿瘤效应.[结果]经酶切鉴定和DNA序列测定,证明HSV1 tk基因成功定向插入到pLXSN载体中;重组病毒DNA转染包装细胞,筛选出对G418具稳定抗性的克隆PT67/tk,扩大培养,获取病毒滴度为4×104cfu/mL的重组逆转录病毒培养液;感染胃癌细胞SGC 7901后再筛选出G418抗性克隆株SGC 7901/tk.丙氧鸟苷(GCV)对SGC 7901/tk有明显杀伤作用,对SGC 7901无明显毒性,证明该病毒表达HSV1 tk基因,表达产物具有生物活性.[结论]将HSV1 tk定向克隆入逆转录病毒载体的方法可成功获取表达HSV1 tk基因的逆转录病毒,成功建立了肿瘤自杀基因治疗系统,这将为进一步研究中医药对自杀基因抗肿瘤的增效作用奠定基础.

六味地黄丸对自杀基因系统治疗黑色素瘤的增效作用

【目的】研究六味地黄丸对HSV1-tk/GCV自杀基因系统治疗黑色素瘤的增效作用,以期探讨建立中西医结合肿瘤自杀基因联合治疗方案的可行性。【方法】培养病毒包装细胞PT67/tk,病毒上清感染黑色素瘤细胞株B16,G418筛选2周,获得抗性细胞克隆,命名为B16/tk并进行体外GCV杀伤试验;证明具有杀伤活性后,将B16/tk与野生型B16按1∶4的比例混合后接种于C57BL/6J小鼠右腋下皮下组织内,以复制小鼠移植性黑色素瘤模型。将复制模型的小鼠分为模型对照组、六味地黄丸组、自杀基因tk/GCV治疗组和联合治疗组(N=11),六味地黄丸从接种第2天起治疗25 d,tk/GCV从接种第7天起治疗20 d,另设正常对照组观察疗效。【结果】体外杀伤实验显示,GCV对B16/tk肿瘤细胞具有明显的杀伤效应,而对野生型B16肿瘤细胞无明显的杀伤作用,表明体外病毒感染黑色素瘤细胞成功,病毒携带的外源性自杀基因已表达且具有生物学活性。联合治疗(自杀基因联合六味地黄丸)对小鼠移植性黑色素瘤生长具有明显抑制作用,联合治疗组肿瘤质量与模型对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05),其抑瘤率达到87.1%;而单纯自杀基因组和六味地黄丸组肿瘤质量与模型对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),抑瘤率分别为62.8%和54.4%。病理检查结果显示,肉眼见治疗组肿瘤体积减小,以联合治疗组更明显。光镜下见治疗组肿瘤细胞密度相对较低,肿瘤周围有较多纤维结缔组织增生及炎症细胞浸润,其中联合治疗组更明显。结果表明:自杀基因联合六味地黄丸治疗对小鼠移植性黑色素瘤生长具有抑制作用,其疗效优于单纯自杀基因治疗或单纯六味地黄丸治疗。【结论】六味地黄丸可能通过自杀基因疗法旁杀伤效应的免疫机制或其他机制对肿瘤自杀基因疗法起到增效作用。该研究工作初步证明了建立自杀基因联合中医药疗法的中西医结合肿瘤基因治疗方案具有可行性。

自杀基因联合中医药疗法治疗肿瘤的设想

自杀基因疗法是一种具有良好应用前景的肿瘤治疗新措施。但如何有效地提高疗效是目前仍须解决的关键问题。由于免疫机制在自杀基因疗法旁杀伤效应中的重要作用,激活荷瘤机体的免疫功能,改善自杀基因抗肿瘤作用的炎症免疫微环境,是提高肿瘤自杀基因疗法疗效的主要策略。中医中药在调节机体免疫状态方面具有肯定的作用,与其他方法比较具有明显优势。因而,将自杀基因疗法与中医中药联合应用,有可能起到提高肿瘤自杀基因疗法疗效,防止肿瘤复发的作用。提出了自杀基因联合中医药疗法治疗肿瘤的新设想,为肿瘤基因治疗提供了一种新的思路和模式。

参附注射液和高乌甲素对小鼠肝癌细胞H22生长抑制及诱导凋亡作用

目的研究比较高乌甲素注射液和参附注射液对小鼠肝癌细胞株生长抑制及凋亡诱导作用。方法苔盼蓝计数,四甲基偶氮唑盐(MTT)法,流式细胞仪技术分析药物对细胞周期和凋亡指数的影响,琼脂糖电泳技术分析药物对DNA作用。结果氢溴酸高乌甲素注射液对H22作用、细胞数量与形态无明显影响;参附注射液可明显抑制小鼠肝癌H22的生长,细胞表现典型的凋亡形态,在浓度为50 mL/L时,出现明显的凋亡峰;琼脂糖凝胶电泳检测出现DNA ladder。结论参附注射液体外能抑制小鼠肝癌H22细胞株的增殖和诱导细胞凋亡,高乌甲素注射液体外对H22细胞的生长、凋亡没有影响。