中华绒螯蟹组蛋白H2A基因的克隆及其在精子发生中的定位

精子发生是指由精原细胞发育为成熟精子的过程。在大多数的物种中,此过程涉及到与DNA结合的碱性蛋白的变化。体细胞类型的组蛋白全部或者部分被过渡蛋白替代,随后又被碱性更强的鱼精蛋白替代,伴随蛋白的逐级替换,此类动物精子核为浓缩的,染色质包装紧密。中华绒螯蟹的精子染色质呈松散的结构,其具体机制尚不明确。本实验利用PCR技术克隆了中华绒螯蟹组蛋白H2A基因的编码区,制备了其多克隆抗体,通过免疫荧光检测了组蛋白H2A在精子发生中的变化特征。结果显示,中华绒螯蟹组蛋白H2A基因编码区为369bp,编码123个氨基酸,预测蛋白分子量为13.1ku。氨基酸序列比对发现,H2A与凡纳滨对虾和斑节对虾的同源性极高,均为99.19%。免疫荧光显示,H2A存在于中华绒螯蟹精子发生的整个过程,精原细胞和精母细胞的H2A在细胞核和细胞质均有表达,在精细胞和成熟的精子中的H2A主要存在于细胞核。中华绒螯蟹成熟精子核内组蛋白H2A的保留可能与其非浓缩核有一定关联。

中华绒螯蟹眼柄视神经节发育特征的初步研究

应用组织切片技术于光镜下研究了中华绒螯蟹不同阶段的眼柄神经节的发育特征及其神经分泌细胞。根据细胞的大小、形态以及细胞质染色的深浅,将眼柄神经分泌细胞分为4种类型;并讨论了这4种细胞在河蟹不同阶段的变化。

中华绒螯蟹蜕皮周期及蜕皮过程中肝胰腺消化酶活性的变化

采用Darch蜕皮周期分期方法,对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的蜕皮周期进行了划分,并初步探讨了中华绒螯蟹蜕皮过程中肝胰腺消化酶活性变化。根据第三颚足末端刚毛和表皮的形态学特征,可将中华绒螯蟹的蜕皮周期分为蜕皮后期(A-B期)、蜕皮间期(C期)、蜕皮前期(D期)和蜕皮期(E期),其中D期可进一步分为D0、D1、D3-43个亚期。在蜕皮过程中,肝胰腺淀粉酶和胰蛋白酶活性在蜕皮后A-B期开始升高,于蜕皮前早期D0阶段达最大(P<0.05),随后又逐渐降低,至蜕皮前晚期D3-4阶段降至最低(P<0.05);胃蛋白酶活力在蜕皮周期中于蜕皮前晚期D3-4阶段显著降低(P<0.05),其他阶段变化不明显(P>0.05)。结论认为,中华绒螯蟹蜕皮过程可分为C、D0、D1、D3-4、A-B 5个时期,蜕皮过程中肝胰腺淀粉酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶活性发生周期性变化。

中华绒螯蟹蜕皮过程中血淋巴主要生化成分的变化

利用生物化学及原子吸收方法测定了中华绒螯蟹蜕皮过程中血淋巴主要生化成分的变化。研究结果显示:在中华绒螯蟹蜕皮前期,血淋巴中总糖、总脂、总蛋白和4种无机离子(Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+)的含量都呈上升趋势。总糖含量在D0期达到高峰,Ca2+、Cu2+和Zn2+含量于D1期达到高峰,总脂和总蛋白含量于D3-4期达到高峰;蜕皮后,总糖、Ca2+、Mg2+含量升高,总脂、总蛋白和Cu2+、Zn2+含量开始降低。中华绒螯蟹蜕皮过程中血淋巴生化成分的变化与蜕皮周期密切相关。

归脾汤对慢性心肌缺血大鼠氧化应激和凋亡作用的研究

目的:观察归脾汤对慢性心肌缺血大鼠氧化应激和凋亡的影响。方法:40只SD大鼠分为4组:正常对照组、模型组、归脾汤低剂量组、归脾汤高剂量组。除对照组外,其余各组经高脂饲料喂养和腹腔注射异丙肾上腺素建立慢性心肌缺血大鼠模型。归脾汤给药15 d后,苏木精-伊红(HE)染色观察心脏病理学形态变化,ELISA法检测心脏组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平,免疫组化检测活化的半胱天冬酶-3(Cleaved caspase-3)、BCL-Associated X(Bax)和B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的表达。结果:HE染色结果显示,与对照组相比,模型组大鼠心肌组织排列紊乱,伴炎性细胞浸润,心肌坏死。与模型组相比,归脾汤低、高剂量组大鼠心肌组织受损程度减轻。与对照组相比,模型组大鼠心脏中SOD和GSH-Px含量下降(P<0.05),CAT水平下降不显著(P>0.05),MDA含量升高(P<0.05)。与模型组相比,低、高剂量归脾汤组大鼠心脏中SOD和GSH-Px水平升高(P<0.05),MDA水平降低(P<0.05),低剂量归脾汤组大鼠心脏中CAT水平升高(P<0.05)。免疫组化染色结果显示与正常组大鼠相比,模型组大鼠心肌组织中Cleaved caspase-3和Bax表达增多(P<0.05)、Bcl-2表达降低(P<0.05),与模型组相比,低、高剂量归脾汤组大鼠心脏中Cleaved caspase-3和Bax的表达降低(P<0.05),Bcl-2表达增高(P<0.05)。结论:归脾汤可以减轻心肌缺血损伤,保护心肌,其机制可能与抑制氧化应激、降低细胞凋亡有关。

张家口坝上高背鲫鱼RAPD遗传多样性研究

采用RAPD技术从40个随机引物中筛选出17个引物对张家口坝上高背鲫鱼水泉淖群体的遗传多样性进行研究,结果共检测出71个位点,其中多态位点25个,多态位点比例(P)为35.2%,平均每个引物提供的标记为4.2个;利用NTsyspc2.1软件获得该水库野生鲫鱼群体20个个体间的遗传距离,个体间遗传距离(D)在0.007 2～0.140 7之间,平均为0.063 5;个体间遗传相似系数(S)在0.859 3～0.992 8之间,平均遗传相似系数为93.65%;研究表明,张家口坝上野生高背鲫鱼群体由于环境封闭,没有外来品种引起的杂交现象,基因纯和程度较高,种群内遗传多样性低。

归脾汤对大鼠心肌缺血的干预作用

目的:观察归脾汤(GPT)对心肌缺血大鼠的保护作用。方法:将40只SD大鼠随机分为5组(n=8):空白对照组(Control),模型组(Model)、归脾汤低剂量组(Gpt 7.52 g/kg)、归脾汤高剂量组(Gpt 15.04 g/kg),阳性对照药曲美他嗪组(Trimetazidine,2 mg/kg)。应用饲喂高脂饮食联合注射异丙肾上腺素(ISO)的方法建立大鼠心肌缺血模型,灌胃给药15 d后,各组再次腹腔注射ISO 3 d,随后大鼠进行心电图检测,取材,检测血液中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和葡萄糖(GLU)的变化,HE及Masson染色观察心肌病理改变,Western blot检测心肌组织中CollagenⅠ和CollagenⅢ的蛋白表达。结果:与正常对照组相比,模型组大鼠心电图出现S-T段下移,血清TC、AST、CK、LDH和GLU水平显著升高(P<0.05),心肌组织CollagenI和CollagenIII蛋白表达显著升高(P<0.05),心肌受损严重。TG,HDL-C,LDL-C和ALT变化不显著(P>0.05)。与模型组相比,归脾汤低、高剂量组和曲美他嗪能抑制心肌缺血大鼠心电图S-T段下移,降低血清中TC、AST、CK、LDH和GLU水平(P<0.05),降低心肌组织CollagenⅢ的表达(P<0.05),减轻心肌病理损伤程度,归脾汤高剂量组可显著降低CollagenⅠ的蛋白表达(P<0.05)。结论:归脾汤具有改善心脏功能,减轻心肌缺血损伤的作用,尤以高剂量效果更为显著。

三七总皂苷对高脂血症金黄地鼠降脂作用的研究

目的:研究三七总皂苷对高脂血症金黄地鼠的降血脂作用。方法:采用金黄地鼠给予高脂饲料4周建立高血脂动物模型,随机分为正常组,高血脂模型组,血塞通组,12周后:检测血清中总胆固醇(TC),甘油三酯(TG),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量;检测血清超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)和游离脂肪酸(NEFA)的含量;HE染色观察肝脏的病理学变化。结果:与正常对照组相比,模型组金黄地鼠血清TC、TG、LDL-C含量显著升高,经过给药治疗后,与模型组相比,治疗组TC、TG、LDL-C、MDA、NEFA含量显著下降,SOD活性与模型组相比并未显著差异。肝脏组织HE染色显示,模型组肝细胞肿胀、坏死,有炎性细胞浸润,经给药治疗后有所好转。结论:三七总皂苷可降低高血脂地鼠的血脂水平,具有保肝功效,可能与其增强肌体抗脂质氧化能力有关。

三七总皂苷对高血脂金黄地鼠脏器的影响

目的:研究三七总皂苷对高血脂金黄地鼠脏器的影响。方法:将金黄地鼠随机分为正常组、造模组,造模组饲喂高脂饲料4周造模成功后,将其分为三七总皂苷组、模型组,12周后,处死地鼠,取其肝脏进行VG染色,取心脏进行HE染色,取肾脏进行HE和Masson染色。结果:HE染色显示三七总皂苷组地鼠心脏的心肌细胞、肾脏的肾小球结构较模型组的损伤均有不同程度的改善;VG染色显示经三七总皂苷治疗后,肝脏小叶内的胶原纤维数量有所减少;Masson染色显示三七总皂苷组地鼠肾脏的纤维化程度与模型组相比有所减轻。结论:三七总皂苷可以适当改善高血脂模型组地鼠心脏、肝脏和肾脏的形态学损伤程度。

丹参有效成份配伍对ApoE^(-/-)小鼠心脏的保护作用及TLR4/NF-κB通路的影响

目的研究丹参4种主要的水溶性成分丹参素(DSS)、丹酚酸(Sal)-A、Sal-B和原儿茶醛(PAL)的有效配伍组合(SABP)对ApoE基因敲除(ApoE^(-/-))小鼠心脏的保护作用及其机制。方法6周龄雄性的ApoE^(-/-)小鼠被随机分为:模型(Model)组、SABP组、阳性药瑞舒伐他汀(RC)组。雄性的C57BL/6J小鼠作为正常对照(Control)组。所有的小鼠正常饮食。RC组每天腹腔注射0.4 mg/kg的RC,SABP组每天腹腔注射丹参4种水溶性成分的有效组合(DSS:5 mg/kg,Sal-A:0.233 mg/kg,Sal-B:10.000 mg/kg,PAL:17.000 mg/kg)。Control组和Model组每天腹腔注射等剂量的生理盐水。8 w后,通过全自动生化分析仪检测血清脂类水平,苏木素-伊红(HE)染色观察心脏的形态学变化。免疫组化和Western印迹检测心脏组织中Toll样受体(TLR)4、转化生长因子β激活激酶(TAK)1、核转录因子(NF)-κB、白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α蛋白表达的变化。结果SABP可以有效地降低血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平,改善心脏损伤,减少心脏中TLR4、TAK1、IL-6和TNF-α蛋白表达,抑制NF-κB的磷酸化。结论SABP对ApoE^(-/-)小鼠心脏具有保护作用,其机制可能与TLR4/NF-κB信号通路有关。

三七总皂苷对金黄地鼠PCSK9-LDLR表达及血脂水平的影响

目的:探讨三七总皂苷(PNS)对金黄地鼠实验性高脂血症的调节机制。方法:30只金黄地鼠随机分为正常组、模型组和PNS组3组,每组10只。正常组地鼠饲喂普通饲料,其余2组地鼠饲喂高脂饲料;4周后高血脂症模型已经建成,PNS组腹腔注射血塞通注射液(50 mg/kg),正常组和模型组给予同体积生理盐水。给药12周后,处死地鼠,收集血液,全自动生化分析仪检测血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平;取肝组织,采用real-time PCR、免疫组织化学和Western blot检测肝脏前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)和低密度脂蛋白受体(LDLR)在mRNA和蛋白水平的表达。结果:成功建立高脂血症地鼠模型。与正常对照组相比,高脂模型组地鼠血清TC、TG、LDL-C和ALT水平显著增高(P<0.05),PNS干预组地鼠TC、TG、LDL-C和ALT水平显著下降(P<0.05),各组地鼠血清中HDL-C和AST水平无显著变化(P>0.05)。与对照组相比,高脂模型组地鼠肝脏中PCSK9的mRNA及蛋白水平显著升高(P<0.05),LDLR的mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与高脂模型组相比,PNS组地鼠肝脏组织PCSK9的蛋白表达水平显著降低,LDLR的蛋白表达水平显著升高(P<0.05),PCSK9和LDLR mRNA变化不明显。结论:PNS对高脂血症金黄地鼠具有显著降脂作用,其机制可能与调节PCSK9-LDLR信号通路有关。

雏菊叶龙胆酮通过调节Nrf2/HO-1和caspase-3通路减轻阿霉素诱导的H9c2心肌细胞损伤

目的:探究雏菊叶龙胆酮(bellidifolin)对阿霉素(adriamycin;又称多柔比星,doxorubicin, DOX)诱导的H9c2心肌细胞损伤的作用及机制。方法:培养大鼠H9c2心肌细胞,采用CCK-8法筛选出DOX和雏菊叶龙胆酮的作用浓度和时间。将H9c2细胞随机分为正常对照组、DOX组和DOX+雏菊叶龙胆酮组进行相应处理,TUNEL染色检测细胞凋亡,Western blot检测Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1)、核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)、血红素氧合酶1(heme oxygenase-1, HO-1)、谷氨酰半胱氨酸连接酶修饰亚基(glutamate cysteine ligase modifier subunit, GCLM)、NAD(P)H醌氧化还原酶1[NAD(P)Hquinone oxidoreductase 1, NQO1]、Bax和caspase-3蛋白的表达。结果:0.5~40μmol/L DOX处理H9c2细胞24 h,细胞活力呈剂量依赖性下降(P<0.05)。其中5μmol/L DOX处理24 h使细胞活力下降到59%。50μmol/L雏菊叶龙胆酮预处理H9c2细胞10 h可显著提高DOX诱导的细胞活力(P<0.05)。与对照组相比,DOX组H9c2细胞中Keap1、Nrf2、HO-1、GCLM和NQO1蛋白表达及Bcl-2/Bax比值显著下降(P<0.05),而caspase-3蛋白表达显著升高(P<0.05),细胞凋亡比例增多(P<0.05);雏菊叶龙胆酮预处理可以显著提高DOX处理的H9c2细胞中Keap1、Nrf2、HO-1、GCLM和NQO1蛋白表达及Bcl-2/Bax比值(P<0.05),降低caspase-3蛋白表达并减少细胞凋亡(P<0.05)。结论:雏菊叶龙胆酮可能通过激活Nrf2/HO-1通路、抑制caspase-3通路来减轻DOX诱导的H9c2心肌细胞损伤。

尖叶假龙胆通过调控TGF-β1/Smad7信号抑制ISO诱导的大鼠心肌纤维化的研究

目的:研究尖叶假龙胆抑制异丙肾上腺素(ISO)诱导的大鼠心肌纤维化的作用及作用机制。方法:雄性SD大鼠皮下注射ISO(5 mg/kg·d^-1),连续注射7 d,制备心肌纤维化模型,给予尖叶假龙胆(0.3 mg/kg和0.6 mg/kg)灌胃21 d,采用HE和Masson染色观察心脏组织形态学和病理学改变,心电图观察心功能改变,免疫组织化学染色分析心脏组织中转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad7蛋白表达变化,酶联免疫法测定血清C反应蛋白(CRP)、TGF-β1水平,放射免疫法检测血清Ⅰ型前胶原羧基端肽(PⅠCP)、Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢN P)含量。结果:尖叶假龙胆可改善ISO所致的心脏功能和结构紊乱,减少心脏组织胶原纤维沉积,降低心脏组织TGF-β1表达,增加Smad7表达,减少血清TGF-β1水平,降低血清中PⅢN P水平。结论:尖叶假龙胆通过调控TGF-β/Smad7信号通路抑制ISO诱导的大鼠心肌纤维化。

归脾汤对心肌缺血大鼠ERK1/2和p38 MAPK表达的影响

目的:探究归脾汤对心肌缺血大鼠的治疗作用及机制。方法:50只SD大鼠随机分为正常组、模型组、归脾汤低、高剂量组(7.52、15.04 g·kg^(-1))、曲美他嗪组(0.002 g·kg^(-1))。通过灌胃维生素D3、高脂饮食和注射异丙肾上腺素的方法建立心肌缺血大鼠模型,药物治疗15 d后,心电图分析其心肌损伤程度;全自动生化分析仪检测血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的变化;苏木素-伊红(HE)和马松(Masson)染色观察心肌组织病理改变;原位末端标记(TUNEL)染色检测心肌细胞凋亡;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠心脏中细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)、Bcl-2、剪切胱天蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠心电图S-T段下降、血清中TC、TG和LDL-C水平明显升高(P<0.05),心肌组织排列紊乱,心肌细胞凋亡比例增多,心脏中cleaved Caspase-3、Bax、p-p38 MAPK蛋白明显升高(P<0.05),Bcl-2明显降低(P<0.05);与模型组比较,归脾汤低、高剂量组和曲美他嗪组S-T段下移有所恢复,TC、TG和LDL-C水平降低,心脏中cleaved Caspase-3和Bax蛋白表达下降,p-p38 MAPK和p-ERK1/2蛋白表达明显升高(P<0.05),心肌组织损伤程度减轻,心肌细胞凋亡比例减少。归脾汤低剂量组Bcl-2表达明显升高(P<0.05);ERK1/2和p38 MAPK蛋白在各组间差异无统计学意义。结论:归脾汤可能通过激活ERK1/2和p38 MAPK的表达,抑制心肌细胞凋亡,减轻大鼠心肌缺血损伤。

中华绒螯蟹组蛋白H3基因保守序列的克隆、表达及抗体制备

为了研究组蛋白H3在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)精子发生中的动态特征,采用PCR技术扩增中华绒螯蟹H3基因编码区的DNA片段,将其重组至含有6个His标签序列的原核表达质粒pET-30a(+)上,转化入大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)感受态细胞中,以0.2 mmol/L的异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生pET-30a-H3重组蛋白。SDS-PAGE表明,重组菌成功表达出了分子量约为21 ku的目标蛋白质,融合蛋白以上清和包涵体的形式存在。采用镍柱亲和层析的方法纯化目的蛋白,免疫新西兰大白兔(Oryctolagus cuniculus),制备兔抗血清。Western blot结果表明,制备的多克隆抗体具有较好的特异性。至此,成功地克隆了中华绒螯蟹H3编码区基因并制备了多克隆抗体,为进一步研究其在精子发生中的动态特征提供了基础。

十足目甲壳动物非浓缩精子发生过程中组蛋白动态研究进展

精子发生是一个受到高度调控的发育过程.在精子形成过程中,组蛋白和鱼精蛋白参与的替换过程对于精子核单倍体基因组的重包装具有重要作用.十足目甲壳动物精子具有非浓缩核的特征,目前多项研究已经证明,十足目甲壳动物精子细胞核或顶体结构中存在部分组蛋白及修饰的组蛋白.本综述总结了十足目甲壳动物精子发生过程中组蛋白的动态特征,有助于阐释非浓缩核染色质结构包装调控的机制.