纳米孔三代测序技术在禽流感病毒全基因组测序中的应用

纳米孔(Nanopore)测序技术是一项新兴三代测序技术,具有巨大应用前景,然而在动物病原领域中的应用还处于起步阶段。为探究该技术在禽流感病毒(AIV)全基因组测序中的应用,本研究对采自农贸市场的2份AIV阳性鸡咽喉拭子样品(分别命名为AIV1和AIV2)进行RNA提取,利用AIV通用引物靶向扩增其全基因组,扩增产物经末端修复、3'末端加A碱基、条形码连接和添加测序接头等步骤,完成测序文库制备。经GridION×5Mk1测序仪测序获得7.16G数据,所获得的测序数据经数据质控、过滤去除低质量reads、比对拼接得到AIV全基因组序列,整个试验流程在13 h内完成。同时,采用一代测序方法验证Nanopore测序结果的准确性。测序数据质控结果显示所有读长(reads)的质量分数均大于10,AIV1产生404474条reads,平均reads为996.7 bp,平均reads质量分数为13.8,AIV2产生76589条reads,平均reads质量分数为13.5,平均reads为1095 bp,表明测序数据质量较高;利用Samtools软件统计AIV 8个基因节段的覆盖率和各基因节段位点的测序深度,结果显示AIV1全基因组的覆盖率达100%,平均测序深度为34473×,AIV2全基因组的覆盖率达100%,平均测序深度为7470×,表明拼接结果可靠性高;所得测序结果与一代测序结果通过Geneious Prime软件对比,结果显示,二者的一致性达98.78%~100%,其中AIV1有7个基因节段测序结果的一致性为100%,AIV2有5个基因节段测序结果的一致性为100%,一致性最低的MP基因的一致性也达98.78%,表明本研究的测序方法准确性良好。本研究成功实现Nanopore三代测序技术在AIV全基因组测序中的应用,通过优化扩增条件和数据处理为AIV全基因组的测序提供了一种新方法,在新发突发禽流感疫情应急检测中将发挥重要作用。

基于Nanopore测序技术的非洲猪瘟病毒全基因组测序方法建立

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种高度传染性和致死性疫病,近年来给我国生猪产业的健康发展造成了沉重打击。ASFV庞大的基因组导致人们难以及时掌握流行毒株的全基因组序列。本研究旨在利用Nanopore三代测序技术建立一种简便可靠的ASFV全基因组测序方法。设计覆盖ASFV全基因组的31对引物并分为4个引物池对样本进行扩增,通过Nanopore测序技术对扩增产物进行测序,进一步优化相关生物信息学分析方法,最终成功建立了ASFV全基因组测序方法。应用该方法成功从某环境拭子样本中获取一株全长为189 416 bp的ASFV全基因组测序。经一代测序验证表明,在B646L、EP402R、E183L、MGF_360-12L、MGF_505-3R和I177L等关键基因及部分变异位点上,本方法结果与一代测序结果一致性100%;在全基因组水平上,本方法结果与二代测序结果一致性为99.94%。此外,在这项研究中,采用Nanopore测序技术发现了NP1450L基因与NP419L基因间区存在56 bp的重复序列插入(通过一代测序技术进行了验证),但是二代测序未能发现这一显著的变异特征。本研究成功建立了基于Nanopore技术的ASFV全基因组测序方法,该方法具有良好的简便性和可靠性,为当前ASF的防控和分子流行病学研究提供了一个重要手段。

基于Nanopore测序技术分析广东地区1株PRRSV-2的基因组特征

为促进Nanopore测序技术在美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-2)全基因组测序中的应用并进一步了解当前广东地区PRRSV-2全基因组特征,本试验从广东地区某屠宰场采集1份PRRSV-2阳性样本,提取核酸进行靶向扩增,对扩增产物进行文库构建和测序,使用Samtools和Medaka等软件对测序数据进行生物信息学分析和拼接,得到样本的全基因组序列。选取5′端1~4 500核苷酸位点和开放阅读框5(ORF5)基因进行一代测序验证,评估本试验的准确性。进一步使用MEGA 11软件对所得的序列进行全基因组遗传进化分析、核苷酸相似性分析和NSP2蛋白氨基酸变异分析;使用RDP4软件和SimPlot软件进行重组分析。结果显示,本试验完成1份PRRSV-2阳性样本的全基因组测序,序列命名为GDYJ0718-7。2Samtools软件分析结果显示,本试验的平均测序深度为1 838×,覆盖PRRSV-2所有编码区。本试验Nanopore测序结果与一代测序结果一致性为100%。全基因组遗传进化分析结果显示,GDYJ0718-7属于QYYZ-like毒株,与参考株QYYZ(JQ308798)的核苷酸相似性仅为86.3%。NSP2蛋白氨基酸变异分析结果显示,GDYJ0718-7呈现1 aa+36 aa+29 aa的独特缺失模式。重组分析发现,GDYJ0718-7可能由QYYZ-like毒株和JXA1-like毒株重组形成。本试验通过Nanopore测序技术发现了广东地区QYYZ-like毒株变异的复杂性和新特点,为PRRSV-2的防控提供了技术和分子信息支持。

规模化猪场猪细小病毒的检测及遗传进化分析

为了解广东某规模化猪场猪细小病毒病的感染情况和免疫现状,应用PCR方法对该企业2019年收集的疑似PPV感染的15份流产胎儿的病料组织进行PPV病原检测,对阳性样品进行VP2基因序列分析,同时应用ELISA方法对651份血清样品进行PPV抗体检测。结果显示,PPV病原阳性率为13.34%,同源性分析显示,PPV GD-1株、GD-2株和PPV参考毒株VP2基因核苷酸同源性为97.6%~99.4%;进化树分析显示,PPV GD-1株、GD-2株与3个德国代表株15a株、21a株、27a株亲缘关系最为亲近,处于同一进化分支中。PPV抗体检测结果显示,血清样品抗体总阳性率达89.09%,各年龄阶段猪群抗体阳性率差别较大,阳性率在28.57%~100%之间,其中种公猪和种母猪PPV抗体水平阳性率最高达100%,其次是育肥猪和后备猪分别为97.65%、85.37%,而产房仔猪的抗体阳性率是五个阶段猪群中最低的,仅为28.57%。不同年龄段猪PPV抗体平均值也有所差异,抗体平均值从高至低依次是育肥猪、后备猪、种母猪。产房仔猪PPV母源抗体水平下降速度快,在保育猪到育肥猪这个阶段PPV抗体水平明显上升。结果表明,猪细小病毒VP2基因尽管比较保守,无明显变异,但产房仔猪PPV母源抗体下降快,保育育肥阶段存在PPV的感染风险,所以规模化猪场应重视后备猪猪细小病毒病的免疫防控。