结直肠癌K-ras基因突变与Ras、EGFR、p53蛋白表达的相关性

目的探讨结直肠癌中K-ras基因突变对其自身及Ras、EGFR和p53蛋白表达的影响及意义。方法应用免疫组化SP法和实时荧光定量PCR Taqman-ARMS探针法,检测50例结直肠癌和20例正常肠黏膜组织中Ras、EGFR和p53蛋白的表达及K-ras基因的突变情况。结果结直肠癌中Ras、EGFR和p53蛋白表达水平明显高于正常肠黏膜(P<0.05);其K-ras基因突变率为44%,正常组织中未检出突变(P<0.05)。Ras蛋白阳性表达与肿瘤分化程度相关(P<0.05),与浸润深度、病理分期、淋巴结转移无关;EGFR蛋白表达与浸润深度相关(P<0.05),与分化程度、病理分期、淋巴结转移无关;p53蛋白表达与淋巴结转移、病理分期相关(P<0.05),与分化程度、浸润深度无关。结直肠癌组织中K-ras基因突变与Ras蛋白表达呈负相关性(P<0.05),与EGFR、p53蛋白表达无相关性;EGFR与Ras蛋白的表达具有正相关性(P<0.05)。结论 K-ras基因突变及Ras、EGFR、p53蛋白高表达均为结直肠癌发生的重要分子事件,与肿瘤分化、浸润及转移密切相关,对其进行联合检测有助于结直肠癌的预后评估及靶向治疗药物的选择。

大鼠尿酸性肾病肾小管上皮细胞凋亡、增殖、表型转化及转化生长因子β1表达关系

采用腺嘌呤灌胃法建立了大鼠实验性尿酸肾病动物模型,应用原位末端标记(TUNEL法)、免疫组化、原位杂交检测了6例正常及30例模型大鼠肾组织肾小管凋亡、增殖、表型转化现象及促纤维化细胞因子TGF-β1蛋白及基因表达状况.研究发现:尿酸性肾病发生发展过程中,肾小管上皮细胞存在明显的凋亡、增殖及表型转化现象.伴随着肾小管间质纤维化的形成,损伤肾小管凋亡、增殖、表型转化与转化生长因子β1(TGF-β1)表达呈增高趋势,且阳性表达细胞分布趋势一致:多位于尿酸盐沉积处损伤及再生的肾小管上皮细胞,可见凋亡、增殖、表型转化及转化生长因子β1表达在肾小管上皮细胞间伴随发生的现象.在病变晚期,肾小管明显萎缩及扩张,肾间质异物肉芽肿形成及弥漫纤维化,肾小管上皮细胞凋亡、增殖、表型转化及转化生长因子β1表达数量随残存肾小管上皮细胞的减少而呈下降趋势,但仍可见凋亡、增殖、表型转化及转化生长因子β1表达在肾小管上皮细胞间伴随发生的现象.这些结果均表明尿酸性肾病致肾小管间质纤维化过程中,肾小管上皮细胞凋亡、增殖、表型转化是损伤肾小管上皮细胞的重要病理变化形式,肾小管上皮细胞通过增殖,完成损伤肾小管的再生;通过细胞凋亡,清除坏死细胞并抑制肾小管上皮细胞的过度增殖;增殖的肾小管上皮细胞通过表型转化及TGFβ1表达,成为细胞外基质和促纤维化细胞因子的重要来源细胞,在肾小管间质纤维化中发挥了核心作用.

人乳头瘤病毒基因分型在宫颈鳞癌及癌前病变的分布规律及临床意义

为探讨人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)基因分型在宫颈鳞癌及癌前病变中的分布规律及其与宫颈鳞癌发生发展的关系,应用PCR-反向点杂交技术对109例宫颈病变患者(宫颈鳞癌40例、CIN69例)进行HPV感染基因分型测定.结果显示,109例标本中HPV阳性检出率为100%,最常见HPV基因型为HPV16型;随着病变程度增加HPV单一感染比例逐渐升高,多重感染比例逐渐下降,单一感染以高危型HPV16型感染为主;HPV16型在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、SCC中阳性率分别为30.77%(8/26)、59.09%(13/22)、90.48%(19/21)、90%(36/40),阳性率呈依次上升趋势.宫颈鳞癌及癌前病变与HPV感染直接相关,宫颈癌癌前病变是高、低危HPV共同作用的结果;高危型HPV持续感染是高级别子宫病变及癌变发生的必要条件;HPV16型病毒感染是国人子宫颈鳞癌形成的主要原因.

胃幽门螺杆菌感染与慢性胃炎病理变化的相关性分析

目的研究胃幽门螺杆菌感染与慢性胃炎的组织类型、炎症活动程度、淋巴滤泡形成、肠化等病理变化的关系。方法对我院2012年至2013年期间行胃镜检查的435例患者标本制成石蜡切片,显微镜下观察慢性胃炎的组织类型、炎症活动度、固有层淋巴滤泡形成、肠化等病理变化,同时提取DNA,用实时荧光定量PCR方法检测有无HP感染。结果 435例患者标本中,HP阳性为137例,阳性率为31.5%;其中慢性萎缩性胃炎HP阳性率为40.5%,明显高于HP阳性率为19.1%的慢性浅表性胃炎,两者比较差异有统计学意义(P<0.05);HP阳性率随炎症活动度无、轻度、中度、重度依次增高,差异有统计学意义(P<0.05);固有层淋巴滤泡形成时HP阳性率明显高于无淋巴滤泡形成的标本,差异有统计学意义(P<0.05);肠上皮化生的有无与HP感染率无明显相关性(P>0.05)。结论HP的感染与慢性胃炎的组织类型、炎症活动程度、淋巴滤泡形成等病理变化存在相关关系,当存在上述病理改变时,应高度警惕HP感染,及时进行检测和治疗。

老年性EB病毒阳性的弥漫性大B细胞淋巴瘤1例

患者男性，75岁，发现全身多处浅表淋巴结肿大半年余。查体：颌下、锁骨上，双侧腋窝下及左腹股沟可触及数个肿大淋巴结，最大者2cm×3cm，活动度可，无发红、触痛。行左锁骨上淋巴结活检。

AP-1及其相关基因uPA、uPAR在肺癌中的表达及其意义

研究AP-1及其相关基因uPA、uPAR在人肺癌中的表达及其与肺癌临床病理特征的关系.通过免疫组织化学方法检测101例肺癌组织及7例正常肺组织中AP-1、uPA、uPAR的表达情况,利用CMIAS2000型多功能真彩病理图像分析系统测量计算各病例中c-jun、c-fos、uPA、uPAR蛋白阳性细胞的平均光密度(DAO)和积分光密度(DIO).c-jun、c-fos在肺癌组织中表达的阳性率及其共表达率均显著高于正常肺组织;二者在NSCLC的表达显著强于SCLC;不同组织学类型肺癌中二者表达具有显著性差异,腺癌中表达最强,小细胞肺癌中表达最弱;c-jun、c-fos与肺癌分级、合并分期、淋巴结转移均呈显著正相关.uPA、uPAR与肺癌淋巴结转移密切相关,与合并分期呈显著正相关;uPAR与肺癌分级呈显著正相关;各指标之间均存在显著正相关关系.研究结果表明uPA、uPAR参与了肺癌侵袭转移,AP-1信号传导通路在该过程中起了重要调节作用.

基于TaqMan探针的幽门螺杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的探讨基于TaqMan探针的幽门螺杆菌23SrDNA基因片段的实时荧光定量PCR检测的有效方法。方法根据幽门螺杆菌23SrDNA序列设计引物和探针,构建质粒标准品,建立实时荧光定量PCR体系并进行方法学评价,并对2012年5月至10月收集的100份临床样本进行检测同时应用免疫组化及银染方法进行比较分析。结果建立了检测23SrDNA的实时荧光定量PCR方法:107-102copies/ul范围内均有"S"型扩增曲线,最低检测浓度为102copies/ul,标准曲线相关系数为1。对临床其它消化道病原体不出现特异性的扩增曲线。对100份样本进行检测,实时荧光定量PCR能检出31份阳性,而免疫组化方法能检出25份阳性,银染方法能检出28份阳性。结论实时荧光定量PCR方法可成功检测幽门螺杆菌,且该方法具有灵敏度和特异性高及重复性好等优点。

siRNA介导的HPV16E6/E7基因沉默对宫颈癌SiHa增殖及凋亡的影响

目的探讨小干扰RNA(siRNA)介导的人乳头状瘤病毒16型(HPV16)E6/E7基因沉默对宫颈癌Si Ha细胞增殖及凋亡的影响。方法设计靶向HPV16 E6/E7基因启动子区的siRNA序列,构建质粒转染Si Ha细胞,筛选稳定沉默E6/E7基因的细胞系。用QT-PCR和RT-PCR检测细胞E6/E7基因mRNA的变化、Western blot检测细胞E6/E7蛋白变化;利用MTT、RT-PCR、免疫组化法检测细胞增殖情况,Tunel检测细胞的凋亡情况。结果成功构建E6/E7基因稳定沉默的细胞株,其mRNA与蛋白沉降效率明显。MTT及Ki-67表达显示细胞增殖活性降低;Tunel显示沉默细胞凋亡增加。结论 siRNA技术可以成功诱导HPV16型E6/E7基因沉默,从而影响癌细胞的生长、增殖和凋亡。

钙黏附蛋白和连环蛋白在非小细胞肺癌中的表达及意义

目的探讨上皮钙黏附蛋白(E-cadherin)、神经型钙黏附蛋白(N-cadherin)、α-连环蛋白(α-catenin)、β-连环蛋白(β-catenin)在非小细胞肺癌(NSCLC)中表达的意义。方法采用免疫组化方法结合计算机图像分析技术,检测E-cadherin、N-cadherin、α-catenin、β-catenin及Ki-67在139例NSCLC组织、43例癌旁组织和39例正常肺组织中的表达水平和β-catenin在细胞中的分布变化。结果①NSCLC与正常肺组织相比,E-cadherin和α-catenin表达量显著降低(P<0.01),β-catenin表达量显著升高(P<0.01);NSCLC与癌旁肺组织相比,E-cadherin和α-catenin表达量明显降低(P<0.05);癌旁肺组织与正常肺组织相比,β-catenin表达量明显升高(P<0.05)。②E-cadherin、α-catenin的表达与NSCLC的分化程度相关,随着分化程度的降低,表达减弱(P<0.05);低分化与高、中分化NSCLC相比,N-cadherin(P<0.01)、β-catenin(P<0.05)表达量明显升高。③随着NSCLC分化程度的降低,β-catenin核表达水平显著升高(P<0.01);在有淋巴结转移(P<0.05)和具有较高增殖能力的NSCLC组织(P<0.01)中,β-catenin核表达水平显著升高。结论①E-cadherin、α-catenin表达下调与NSCLC细胞分化程度直接相关。②钙黏附蛋白表型转化与NSCLC细胞的分化程度密切相关。③β-catenin降解抑制与NSCLC的发生有密切关系。④β-catenin核表达与NSCLC的分化、增殖、转移具有密切关系。

伴巨细胞纤维母细胞瘤样结构的黏液型隆突性皮肤纤维肉瘤1报道

隆突性皮肤纤维肉瘤（dermatofibrosarcoma protuberans,DFSP）是一种源于真皮的低度恶性软组织肿瘤。DFSP以中青年多见,发病高峰年龄20～60岁;组织学亚型多样,其中伴巨细胞纤维母细胞瘤样结构的黏液型DFSP非常罕见。

伴明显髓外造血的脾窦岸细胞血管瘤1例报道

脾窦岸细胞血管瘤是一种认识不久的少见脾血管性肿瘤。自1991年Falk等首先报道以来，国内外共报道50余例。我们于外检中发现1例伴明显髓外造血的脾窦岸细胞血管瘤，现结合文献进行探讨。

甲状腺乳头状癌B-raf基因突变及cyclinD1、p16蛋白表达的相关性及临床病理意义

目的研究甲状腺乳头状癌中B-raf基因突变率及cyclinD1、p16蛋白表达水平,探讨关键信号分子基因突变对相关细胞周期调控因子表达的影响及意义。方法分别应用免疫组化SP法及实时荧光定量PCR法检测100例甲状腺乳头状癌和20例甲状腺良性病变中cyclinD1、p16蛋白的表达及B-raf基因的突变情况。结果甲状腺癌中cyclinD1、p16蛋白表达明显高于良性(P<0.05);其B-raf基因突变率为72%,良性病变组织中未检出突变(P<0.05)。Raf基因突变与患者发病年龄、淋巴结转移及包膜侵犯相关(P<0.05);cyclinD1蛋白阳性与患者年龄、淋巴结转移及B-raf突变相关(P<0.05)。p16蛋白表达仅与患者年龄相关(P<0.05),而与其他指标均无关。甲状腺乳头状癌组织中cyclinD1与p16蛋白的表达具有负相关性(P<0.05)。结论 B-raf基因突变及cyclinD1、p16蛋白高表达均为甲状腺乳头状癌发生的重要分子事件,与肿瘤浸润及转移密切相关,对其进行联合检测有助于甲状腺乳头状癌的预后评估及早期诊断。

DNMT1表达降低对结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的研究降低DNMT1表达对结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响。方法应用反转录实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测DNMT1在结直肠癌细胞株HCT-8和正常肠上皮细胞株NCM460的表达水平。通过LV-hDNMT1-shRNA慢病毒转染结直肠癌细胞株HCT-8,下调DNMT1在结直肠癌细胞系中表达;细胞功能学实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力;qRT-PCR、Western blot和亚硫酸氢盐甲基化特异性PCR(MSP)方法检测各组细胞中增殖、迁移和侵袭相关指标基因表达水平和甲基化水平。结果结直肠癌细胞HCT-8 DNMT1 mRNA表达水平略高于NCM460。降低HCT-8细胞DNMT1表达,细胞增殖、迁移和侵袭能力增强,Ki-67表达增加,MMP9基因甲基化程度降低其基因表达水平增加、TIMP3基因甲基化程度升高其基因表达降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论DNMT1表达降低可促进结直肠癌细胞的HCT-8增殖、迁移和侵袭,其机制可能通过调控MMP9、TIMP3基因甲基化水平影响其蛋白表达,进而对肿瘤细胞侵袭转移产生影响。

术中诊断牙龈炎性肌纤维母细胞瘤1例

病例男，64岁，因发现左下颌后牙牙龈肿物1年就诊。患者1年前发现左下后牙牙龈黄豆大肿物，肿物生长缓慢，无疼痛感；近2W刷牙时左侧出血明显，1W来自觉左下颌区轻度疼痛。专科检查示：左侧下颌第一、第二磨牙牙龈处可见肿物膨胀性生长，大小约3．0cm×2．5cm，质较软，活动胜较差，肿物呈菜花状外突性生长，为大小不等的肉芽粒状，表面局部糜烂出血，轻度触痛，边界不清楚，肉眼观肿物浸润至膜龈联合处。

子宫颈上皮内瘤变及鳞状细胞癌组织cyclin D1表达特征及其与HPV16 E7表达的相关性分析

目的探讨cyclinD1在宫颈上皮内瘤变及鳞状细胞癌中的表达及其与HPV16E7基因表达的相关性。方法SiHa、Hcc94细胞均为宫颈上皮来源的鳞癌细胞，其中Hcc94细胞的E6／E7基因缺失。采用即时荧光定量PCR、免疫组织化学法检测cyclinD1在子宫颈上皮内瘤变（CIN）及鳞状细胞癌组织中基因及蛋白的表达情况；采用逆转录PCR（RT—PCR）、Westernblot、免疫组织化学方法检测cyclinD1在不同E7表达状态的鳞状细胞癌细胞系的表达情况；设计靶向HPV16E7基因启动子区的siRNA序列，构建质粒转染SiHa细胞，筛选稳定沉默E7基因的细胞系命名为cm-16细胞株；将空质粒转染SiHa细胞，获得空质粒细胞系命名为B3细胞株。用RT—PCR和Westernblot检测E7沉默cm-16细胞cyclinD1基因及蛋白表达情况。结果cyclinD1仅在正常宫颈鳞状上皮副基底细胞中表达，在CIN1、CIN2、CIN3表达降低，在HPV阳性的宫颈鳞状细胞癌中阴性或少量点灶状表达；cyclinD1在E7阳性SiHa细胞中的表达水平较cm-16及Hcc94细胞减低（均P〈0．05）。结论E7高表达的子宫颈癌组织及细胞中cyclinDI低表达，HPVE7基因抑制子宫颈癌cyclinD1表达。

尿激酶型纤溶酶原激活剂及其受体在肺癌中表达的定量研究及其意义

目的研究尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)及其受体(uPAR)在人肺癌中的表达及其与肺癌临床病理特征的关系。方法通过免疫组织化学方法检测101例肺癌组织及7例正常肺组织中uPA、uPAR的表达情况,利用CMIAS2000型多功能真彩病理图像分析系统测量计算各病例中uPA、uPAR蛋白阳性细胞的平均光密度(AOD)和积分光密度(IOD)。结果 uPA、uPAR在肺癌组织中表达的阳性率高于正常肺组织,二者在非小细胞肺癌(NSCLC)的表达强于小细胞肺癌(SCLC)但均不具有显著性差异;二者在不同组织学类型、不同分期肺癌中的表达均不具有显著性差异;uPAR与肺癌分级呈显著正相关;uPA、uPAR与肺癌淋巴结转移密切相关,与合并分期显著正相关;二者之间均存在显著正相关关系。结论 uPA、uPAR参与肺癌侵袭转移,且二者具有协同作用。

三阴性乳腺癌细胞对磷脂酰肌醇3激酶抑制剂产生抗药性的分子机制

目的 探讨三阴性乳腺癌（TNBC）细胞对磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制剂产生抗药性的分子机制。方法 运用脂质体2000试剂盒将siFZD7、siWANT5B或siGSK3转染TNBC细胞HCC70，Western blot法测定WNT/β-连环蛋白（WNT/β-catenin）和磷脂酰肌醇3激酶/苏氨酸激酶/雷帕霉素靶蛋白（PI3K/AKT/mTOR）信号通路关键蛋白的表达。将PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂作用TNBC细胞HCC70、雌激素受体（ER）阳性乳腺癌细胞MCF-7和人表皮生长因子受体2（HER2）阳性乳腺癌细胞SK-BR3，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖抑制率，并计算半数抑制浓度（IC50）；Western blot和荧光素酶报告基因实验检测WNT/β-catenin和PI3K/AKT/mTOR信号通路的活性变化对乳腺癌细胞增殖的影响；免疫荧光实验检测β-catenin蛋白核转位。将BKM120处理的乳腺癌细胞皮下注入裸鼠体内，观察其致瘤能力，采用免疫组化法检测肿瘤组织中磷酸化肺耐药相关蛋白6（p-LRP6）、磷酸化eIF4E结合蛋白1（p-4EBP1）和β-catenin蛋白的表达。结果 siRNA转染的HCC70细胞中，卷曲蛋白7（FZD7）、细胞外因子5B （WANT5B）、糖原合成酶激酶3（GSK3）表达显著降低，WNT/β-catenin活性升高，PI3K/AKT/mTOR活性降低。PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂能抑制MCF-7和SK-BR3细胞的增殖，GDC-094、BKM120、XL147、perifosine、everolimus、BEZ235对MCF-7细胞的IC50分别为0.46 mmol/L、1.44 mmol/L、4.34 mmol/L、11.35 μmol/L、53.71 μmol/L和12.87 μmol/L，对SK-BR3细胞的IC50分别为0.63 mmol/L、0.58 mmol/L、3.74 mmol/L、13.22 μmol/L、60.00 μmol/L和11.38 μmol/L。荧光素酶报告基因检测显示，经BKM120处理后，HCC70、MCF-7和SK-BR3细胞中的荧光素酶活性分别为1.75±0.05、1.13±0.02和0.43±0.01，对照组的荧光素酶活性为1.00±0.02，HCC70、SK-BR3细胞中的荧光素酶活性与对照组差异有统计学意义（P〈0.05）。BKM120能抑制mTOR的活性，提高WNT/β-catenin活性能解除BKM120对mTOR活性的抑制。BKM120能抑制MCF-7和SK-BR3细胞的体内致瘤能力，但对HCC70细胞的致瘤能力无影响。免疫组化检测显示，BKM120处理的HCC70细胞接种于裸鼠后，肿瘤组织中β-catenin蛋白发生核转位，p-LRP6蛋白表达增加，p-4EBP1蛋白表达无变化；BKM120处理的MCF-7细胞接种于裸鼠后，肿瘤组织中β-catenin蛋白未发生核转位，p-LRP6和p-4EBP1蛋白表达降低。结论 HCC70细胞对PI3K抑制剂具有抗药性，WNT/β-catenin信号通路可调节PI3K/AKT/mTOR信号通路，从而诱导TNBC细胞对PI3K抑制剂的抗药性。

cyclinD1过表达对子宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞增殖及上皮间质转化的影响

目的 探讨cyclin D1过表达对子宫颈鳞癌SiHa细胞增殖、分化的影响及其他信号分子的变化情况.方法 采用PCR法扩增cyclin D1基因全长,构建cyclin D1-pcDNA3.1质粒转染人乳头状瘤病毒16阳性的SiHa细胞,筛选cyclin D1稳定过表达细胞株.采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法和Western blot分别检测转染细胞cyclin D1 mRNA和蛋白表达.采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法绘制细胞生长曲线,采用RT-PCR法和Western blot检测转染细胞CK7、E-cadherin、波形蛋白、Snail基因的mRNA和蛋白表达;采用RT-PCR法检测增殖分化相关基因CDK4、CDK2、p21、p27、cyclin E、Rb、E2F、E6/E7、Ki-67基因的mRNA表达水平.对细胞同步化处理,用RT-PCR法检测细胞周期不同时间点cyclin D1及p21基因的mRNA表达情况.结果 成功构建cyclin D1稳定过表达的G-3细胞株.生长曲线及Ki-67 mRNA升高（P〈0.05）提示G-3细胞增殖速度加快,G-3细胞中波形蛋白、Snail基因和蛋白表达明显增加（均P〈0.05）,E-cadherin、CK7基因和蛋白表达明显降低,提示转染细胞发生了上皮间质转化.cyclin D1过表达后,CDK4、CDK2、p21、p27、cyclin E表达增加,Rb、E2F、E6/E7、p16表达无明显改变,p21与cyclin D1表达趋势基本一致,在细胞周期不同时间点表达存在波动性.结论 转染诱导cyclin D1过表达可促进SiHa细胞增殖和上皮间质转化,这一过程中伴随着CDK4、CDK2、p21、p27、cyclin E基因表达的上调.cyclin D1过表达时,p21表达量也增高,可能通过影响波形蛋白表达参与了对SiHa细胞上皮间质转化的调控.