miR-20a海绵载体构建及在白血病细胞株Jurkat中的表达

本研究构建miR-20a基因的miRNA海绵载体,建立Jurkat-S稳定细胞株,为进一步研究的miR-20a功能及应用干扰技术治疗奠定基础。设计、合成1对含有2个重复针对miR-20a成熟序列第9-12碱基错配的序列,并带有酶切位点,退火后连接到pCDNA3.0-L表达载体上;载体双酶切后再与退火产物连接,重复4次后进行酶切及荧光素酶活性鉴定;亚克隆到慢病毒表达载体,与psPAX2、PMD2G共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度,感染Jurkat细胞,建立稳定细胞株;应用实时PCR和Western blot技术分别检测Jurkat-S稳定细胞中P21及E2F1 mRNA和蛋白的表达,并与对照组进行比较。结果表明,成功构建了针对miR-20a基因的海绵载体,病毒滴度为5×107TU/ml;建立了稳定转染的Jurkat-S细胞株。有效干扰验证显示,miR-20a海绵能明显上调P21及E2F1的mRNA及蛋白表达水平,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建miR-20a基因的miRNA海绵载体,建立稳定干扰miR-20a表达的Jurkat-S细胞株。

硫酸多粘菌素B对血液病中性粒细胞缺乏伴发热患者的临床疗效观察

目的:探究硫酸多粘菌素B对血液病中性粒细胞缺乏伴发热患者的临床疗效与安全性。方法:收集2019年10月-2020年9月在福建医科大学附属协和医院血液科住院的50例患者的临床资料,所有患者均接受联合或大剂量化疗或造血干细胞移植后出现中性粒细胞缺乏伴发热,经验性抗感染治疗疗效不佳,病原学检查阳性并根据药敏结果更改为硫酸多粘菌素B为主的方案进行抗感染治疗。结果:50例患者总共发生85例次感染,感染部位分别为肺部、血流、肠道、口腔、肛周、软组织以及鼻腔,致病菌以革兰阴性菌为主。根据病原学及药敏结果更改为硫酸多粘菌素B抗感染治疗,总有效率为68%,特别是用药>7 d有效率明显上升,自动出院及死亡患者分别占24%及8%。碳青霉烯类抗菌素使用时间在14 d内或是7 d内更改为硫酸多粘菌素B治疗的有效率分别为80%及70.6%,2周后再更改的患者有效率仅为33.3%;替加环素使用时间在14 d内或是7 d内更改为硫酸多粘菌素B治疗的有效率分别为80%及66.7%。硫酸多粘菌素B不良反应发生率低,多数轻微,仅1例患者出现横纹肌溶解。结论:硫酸多粘菌素B对于血液病中性粒细胞缺乏伴发热患者临床疗效好,且安全性高。

热休克蛋白90在多发性骨髓瘤患者中的表达及临床意义

目的:检测多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓标本中HSP90的表达情况,并探讨其临床意义。方法:利用免疫组化技术检测HSP90在76例MM患者及29例健康供者中的表达;收集临床资料,分析HSP90表达情况与临床指标的相关性。结果:MM患者骨髓标本中HSP90表达阳性患者数明显高于对照组;HSP90表达水平与患者的β2-微球蛋白水平及临床分期存在相关性,而与患者的年龄、性别、肌酐、血红蛋白、血钙、乳酸脱氢酶、骨髓中浆细胞比例及类型均无相关性;且与低表达者相比,高表达HSP90的MM患者生存期明显缩短。结论:MM患者中HSP90呈高表达,且与β2-微球蛋白水平及临床分期存在相关性,并与患者的生存期有关。

2-甲氧基雌二醇增强骨髓瘤细胞U266对硼替佐米敏感性的相关机制研究

本研究旨在探索2-甲氧基雌二醇(2-ME2)联合硼替佐米对人骨髓瘤细胞株U266的协同抑制增殖和诱导凋亡作用及其可能机制。2-ME2、硼替佐米单用以及二者联合分别处理U266细胞,用CCK8方法检测细胞增殖活力,caspase3/7活性法检测细胞凋亡,流式细胞术分析细胞周期的变化,荧光实时定量PCR检测P21、BAX、BCL-2等mRNA水平变化。结果表明:相比于2-ME2和硼替佐米单用,2-ME2联合硼替佐米处理U266细胞后,细胞增殖明显抑制(p<0.05),细胞凋亡增加(p<0.05),细胞周期阻滞于G1-S期;在mRNA水平,P21及BAX表达上调,BCL-2表达下调。结论:2-ME2联合硼替佐米能更有效地抑制U266细胞增殖和诱导凋亡,具有协同作用,其机制可能与其诱导P21及BAX表达上调有关。

慢病毒荧光素酶载体介导的miRNA靶向基因筛选系统的建立及应用

本研究旨在建立miRNA靶基因高通量筛选系统,筛选出能调控p21NAs,以便试验验证及探索这些miRNA的生物学功能及意义。利用分子克隆技术构建并鉴定2个慢病毒表达载体-pWPXL-Luc及pWPXL-Luc-P21-3'UTR,分别与包装载体psPAX-2及PDM2G共转染HEK 293T细胞;包装病毒颗粒,感染HEK 293细胞,获得稳定单表达荧光素酶及共表达荧光素酶与P21-3'UTR的细胞株,前者在后续实验中作为对照;采用荧光素酶检测试剂检测pWPXL-Luc病毒感染后的293细胞的荧光素酶活性。结果表明:包装出高滴度的病毒颗粒,成功建立稳定株,且在一定范围内稳定株细胞的荧光素酶活性与细胞数目成正比。结论:成功建立了miRNA靶基因高通量筛选系统;利用本筛选系统,成功筛选出靶向细胞周期调控基因P21(CIP1/WAF1)的miRNA。

320例多发性骨髓瘤校正血钙的临床意义

目的:分析多发性骨髓瘤患者校正血钙的临床意义。方法:检测320例初发多发性骨髓瘤患者的血钙水平,用同时采集静脉血所得血清白蛋白浓度进行校正,分析校正前后血钙浓度的差异。结果:320例多发性骨髓瘤患者血钙浓度为2.34±0.15 mmol/L,校正后血钙浓度为2.6±0.17 mmol/L,高钙血症患者由11.3%升至校正后的23.1%,低钙血症患者由42.8%下降至校正后的7.8%,血钙的正常患者例数增加。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期病人的血钙水平在经白蛋白校正前后均有显著性差异(P<0.05)。320例MM患者贫血发生率为80%,肾功能不全发生率为20.9%,骨髓瘤骨病发生率为68.8%,贫血、肾功能不全、骨髓瘤骨病患者血钙浓度均高于正常组,且校正后差异更显著。接受化疗的患者220例,中位PFS为15个月,中位OS为20个月,高钙血症患者PFS及OS缩短,校正后PFS及OS明显缩短,具有显著性差异(P<0.001)。结论:校正血钙能更敏感地反映疾病的严重程度,具有更好的预后判断作用。

40例慢性淋巴细胞白血病临床分析

本研究旨在分析慢性淋巴细胞白血病(CLL)的临床和实验室特点及其对预后的影响。对2004年1月至2010年12月收住本院的40例CLL患者进行了回顾性分析。结果表明,本病主要发生于老年男性,中位年龄66岁(42-80岁);25例(62.5%)可见典型CLL免疫表型,所有病例均表达CD19和CD5,表达CD38和Zap70的分别有7例(17.5%)和14例(35%);8例检测出IgVH基因突变,其中有4例为VH3家族;FISH检测出P53基因缺失6例,RB1缺失3例,12三体1例,正常核型5例;31例患者接受了含氟达拉滨的化疗,中位无进展生存(PFS)时间为48个月(95%CI:39-57个月),其中有27例(87.1%)获完全缓解(CR)+部分缓解(PR),而接受其他治疗方法的患者有9例,PFS仅为14个月(95%CI:10-18个月,P<0.001),只有3例(33.3%)获CR+PR。诊断时β2微球蛋白水平正常者,36个月的总生存率为78%(95%CI:69%-87%),明显高于β2微球蛋白水平异常者的总生存率47%(95%CI:35%-59%,P=0.004)。Zap70表达阳性的患者中有7例(50%)治疗后获CR+PR,疗效差于表达阴性者,后者中有23例(88.5%,P=0.006)治疗后获CR+PR。IgVH基因突变者,治疗后都获CR,无IgVH基因突变者,治疗后只有4例(66.7%)获CR。结论:CLL具有独特的临床特征和分子遗传学标记,如Zap70、CD38和IgVH基因突变,并与预后相关。氟达拉滨治疗方案能明显提高CLL患者的长期生存率。

白血病人的gfi-1表达及慢病毒介导的gfi-1基因沉默对K562细胞增殖的影响

本研究旨在检测独立生长因子(Gfi-1)在白血病患者的表达水平并探讨慢病毒介导的gfi-1基因沉默对人白血病细胞株K562增殖的影响。采用荧光实时定量PCR及Westernblot方法检测初治白血病患者gfi-1的表达水平,分析其在各型白血病中的表达情况。设计、合成一对针对gfi-1 mRNA的shRNA序列,退火后连接到pLVTHM干扰载体上,与psPAX2、PDM2G共转HEK293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度,感染K562细胞,建立稳定株。应用实时定量PCR和Western blot方法检测K562细胞gfi-1及baxmRNA和蛋白的表达,并与对照组进行比较.结果表明:慢病毒介导的shgfi-1能明显降低gfi-1的mRNA及蛋白水平,而bax的mRNA及蛋白水平则都上调。CCK-8检测发现,与对照组相比,shgfi-1能明显抑制K562细胞的增殖。结论:gfi-1在初治白血病患者中的高表达可能参与白血病的发生发展。gfi-1特异的shRNA干扰可以有效地下调K562细胞gfi-1基因的表达,抑制K562细胞的增殖,gfi-1基因可能是白血病基因治疗的一个有效靶点。

Bmi-1 shRNA慢病毒表达载体的构建及稳转U266细胞株的建立

本研究构建Bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,建立U266-li稳定细胞株,为下一步Bmi-1的功能研究及应用RNAi技术治疗打下基础。设计、合成1对针对Bmi-1 mRNA的shRNA序列,退火后连接到pLVTHM干扰载体上,与psPAX2、PMD2G共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度,感染U266细胞,建立稳定细胞株;应用实时PCR和Western blot技术分别检测U266稳定细胞中Bmi-1及P14 mRNA和蛋白水平的表达,并与对照组进行比较。结果表明,成功构建了针对Bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,病毒滴度为5×107 TU/ml;建立稳定转染的U266细胞株。有效干扰验证显示,shBmi-1能明显降低Bmi-1的mRNA及蛋白水平,而P14的mRNA及蛋白水平则都上调,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建Bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,建立稳定干扰Bmi-1表达的U266细胞株。

1例伴12三体染色体核型异常的慢性淋巴细胞白血病转化为Richter综合症

本研究探讨慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者的临床特征、染色体核型与Richter综合症(RS)发生的关系。利用血清学检测、流式细胞术和间期荧光原位杂交技术等方法,随访观察1例RS患者发病时的临床特征、染色体核型、治疗方式及其反应和病情演化。结果表明,患者发病时呈现典型的CLL表现,即表达CD5、CD19、CD23,但FMC7、CD38和ZAP70表达阴性;Binet分期C期,伴12三体染色体核型异常,对标准方案FCR治疗反应差等特点。病程第5个月时患者出现非炎症性发热,淋巴结迅速增大和血清乳酸脱氢酶升高,经淋巴结病理活检证实向RS转化。结论:12三体是RS转化的高危因素之一,RS的发生还可能与CLL治疗方法有关。

初治白血病患者april mRNA的表达研究

本研究旨在检测27例确诊白血病患者april mRNA的表达水平,为april分子靶向治疗在白血病中的应用提供理论基础。采用实时荧光定量PCR方法检测初治白血病患者april mRNA的相对表达水平,分析其在各型白血病中的表达变化。结果表明:急性白血病(AL)患者april mRNA的表达高于正常对照组,差异有统计学意义(p<0.05);急性髓系白血病(AML)患者april mRNA的表达高于正常对照组,其差异有统计学意义(p<0.05),且april mRNA的表达水平与外周血白细胞计数(WBC≥20.0×109/L)呈正相关(p<0.05),与患者的髓外侵犯及CD34表达无明显相关性(p>0.05)。除外急性早幼粒细胞白血病(APL)病例,april mRNA的表达水平与AML患者的化疗敏感性呈负相关(p<0.05)。急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓系白血病(CML)患者april mRNA的表达与正常对照组相比,差异无统计学意义(p>0.05)。结论:AML患者存在着april mRNA的过表达。AML细胞产生的APRIL蛋白可能在AML细胞的异常增殖及化疗耐药中起着重要作用。

初诊白血病患者溶血磷脂酸酰基转移酶基因表达研究

本研究旨在检测白血病患者溶血磷脂酸酰基转移酶-β(lysophosphatidic acid acyltransferase β,lpaat β)mRNA的表达水平,为lpaatβ靶向治疗在白血病中的应用提供理论基础。采用实时荧光定量PCR方法检测初治白血病患者lpaatβ mRNA的相对表达水平,分析其在各型白血病中的表达情况。结果,急性白血病(AL)患者lpaatβ mRNA的表达高于正常对照组,差异有统计学意义(p<0.05);急性髓系白血病(AML)患者lpaatβ mRNA的表达高于正常对照组,差异有统计学意义(p<0.05),且lpaatβ mRNA的表达水平与外周血白细胞计数(WBC≥20.0×109/L)、白血病细胞CD34表达呈正相关(p<0.05),与患者的髓外侵犯无明显相关性(p>0.05)。除外急性早幼粒细胞白血病(APL)病例之外,lpaatβ mRNA的表达水平与AML患者的化疗敏感性呈负相关(p<0.05)。慢性髓系白血病(CML)患者lpaatβ mRNA的表达高于正常对照组,差异有统计学意义(p<0.05)。急性淋巴细胞白血病(ALL)患者lpaatβ mRNA的表达与正常对照组相比,差异无统计学意义(p>0.05)。结论:AML、CML患者均存在着lpaatβ基因的超高表达。AML细胞产生的lpaatβ可能在AML细胞的异常增殖及化疗耐药中起着重要作用。

Bmi-1及p14在结外NK/T细胞淋巴瘤中的表达及临床意义

目的:本研究旨在探讨Bmi-1及p14蛋白在结外NK/T细胞淋巴瘤(ENKTCL)中的表达情况及其临床意义。方法::采用免疫组织化学Maxvision法检测21例ENKTCL组织标本及11例正常淋巴结组织标本中Bmi-1及P14的表达水平并进行分析比较。结果:ENKTCL组织中Bmi-1表达显著高于对照组,且与患者的临床分期有相关性(P<0.05),而与患者的年龄、性别、外周血LDH、B症状及国际预后指数评分(IPI)均无相关性(P>0.05);相反在ENKTCL组织中P14的表达则低于对照组,且与患者的年龄、性别、临床分期、外周血LDH、B症状及国际预后指数评分(IPI)均无相关性(P>0.05)。在ENKTCL组织中Bmi-1及P14二者之间有负相关关系(r=-0.472,P=0.031)。结论:Bmi-1在ENKTCL组织中过表达,其对P14的负向调控可能在ENKTCL的发生及发展中发挥作用。

硼替佐米对淋巴瘤细胞系CA46的作用及机制研究

本研究探讨硼替佐米(bortezomib,BZM)对淋巴瘤细胞系CA46的作用及相关机制。采用MTT法观察BZM对CA46细胞增殖的作用,流式细胞术分析BZM对CA46细胞凋亡的影响,Western blot法检测经BZM作用的CA46细胞procaspase-3、BCL-2蛋白表达水平。结果表明,BZM能明显抑制CA46细胞增殖,24小时和48小时的半数抑制浓度(IC50)分别为53.19,19.68nmol/L;BZM能诱导CA46细胞凋亡,且呈现剂量和时间依赖性;20nmol/LBZM处理CA46细胞不同时间后procaspase-3、BCL-2蛋白表达呈时间依赖性降低。结论:BZM可以抑制CA46细胞增殖,诱导其凋亡,其机制可能涉及了BCL-2表达下调及caspase-3的活化。

CPGL-B对肝癌细胞增殖的影响

目的研究CPGL-B抑制肝癌增殖的分子机制。方法将CPGL-B克隆入慢病毒载体,转染293T细胞包装病毒。之后感染肝癌细胞系,通过CCK-8染色和克隆形成的方法检测细胞增殖的变化,用PI染色的方法检测细胞周期的变化;用western印迹方法检测p21的表达。结果CPGL-B可抑制肝癌细胞的增殖和克隆形成能力,并使细胞阻滞在G1期,上调p21的蛋白水平。结论CPGL-B能够抑制肝癌的增殖,抑制肝癌细胞从G1到S期的转化,这种作用可能是通过上调p21介导的。

miRNA Sponge介导的miR-17和miR-20a基因沉默的抗白血病作用机制

本研究旨在检测急性白血病患者中miR-17和miR-20a前体的表达水平,并探讨miRNA Sponge介导的miR-17和miR-20a沉默的抗白血病作用机制。采用荧光实时定量PCR方法检测初治急性白血病患者及8种白血病细胞株中miR-17和miR-20a前体的表达水平,分析其在各型白血病中的表达情况。利用前期构建的针对miR-17和miR-20a基因的miRNA Sponge慢病毒表达载体,感染高表达miR-17和miR-20a的Jurkat细胞株;用CCK-8方法及流式细胞术分别检测miR-17和miR-20a沉默对Jurkat细胞增殖能力及细胞周期的影响。结果表明:初治急性白血病患者中miR-17和miR-20a前体的表达明显高于正常对照(P<0.05);且与急性髓系白血病患者相比,急性淋巴细胞白血病患者中的表达量更高;然而二者表达量与患者外周血高白细胞计数无明显相关性(P>0.05)。miR-17和miR-20a沉默能抑制Jurkat细胞的增殖,使细胞周期阻滞于G1—S期,同时促进细胞的凋亡。结论:急性白血病患者中miR-17和miR-20a呈过表达,可能参与白血病的发生、发展;高表达的miR-17和miR-20a可通过在转录后抑制P21和E2F1表达,从而促进细胞增殖及细胞周期G1—S期转换,抑制细胞凋亡。

MicroRNA-15a抑制骨髓瘤细胞生长及其机制研究

目的:研究microRNA-15a(miR-15a)在多发性骨髓瘤(MM)细胞生长中的作用及可能机制。方法:慢病毒颗粒感染MM细胞株U266和RPMI8226,流式细胞术(FCM)分选获得稳定转染MM细胞株。CCK-8法检测miR-15a高表达前后MM细胞的增殖情况;AO/EB染色、Hoechst 33258荧光染色法及FCM检测miR-15a高表达前后MM细胞凋亡的情况;FCM检测miR-15a高表达前后MM细胞周期的情况;real-time PCR方法检测miR-15a高表达前后MM细胞miR-15a、BMI-1及BCL-2 mRNA的表达;Western blot方法检测miR-15a高表达前后MM细胞BMI-1蛋白表达。结果:获得高表达miR-15a的MM稳定转染细胞株。CCK-8结果显示miR-15a高表达可抑制M M细胞(U266和RPM I8226)的增殖;AO/EB、Hoechst 33258染色和FCM结果显示,miR-15a高表达可显著诱导MM细胞(U266和RPM I8226)的凋亡,U266和RPM I8226细胞高表达组与对照组细胞凋亡率分别为:90.52%vs37.08%,59.40%vs 44.17%;同时,miR-15a高表达可诱导MM细胞(U266和RPM I8226)G1期阻滞,G1期细胞分别为(41.50±0.64)%、(45.31±0.77)%。real-time PCR结果显示,在高表达miR-15a抑制骨髓瘤细胞生长的过程中BCL-2 mRNA表达显著降低,BMI-1 mRNA表达则没有改变,但是Western blot结果却显示BMI-1蛋白表达出现显著降低。结论:miR-15a高表达通过诱导骨髓瘤细胞周期阻滞和凋亡抑制骨髓瘤细胞生长,其机制涉及miR-15a在转录后水平对BMI-1、BCL-2基因的负调控。

结外NK/T细胞淋巴瘤组织中MCL-1和microRNA-29a的表达

本研究旨在探讨结外NK/T细胞淋巴瘤(ENKTCL)组织中MCL-1和microRNA-29a(miR-29a)的表达水平及其相关性。采用免疫组织化学Maxvision法和实时荧光定量PCR法分别检测20例ENKTCL和10例增生性淋巴结炎组织中MCL-1蛋白和miR-29a表达水平并进行分析与比较。结果表明:ENKTCL组MCL-1表达显著高于增生性淋巴结炎组,但MCL-1过表达与患者的年龄、性别、Ann Arbor分期、国际预后指数评分无关。相关性分析显示:ENKTCL组织中miR-29a表达与MCL-1表达呈显著负相关(r=-0.59,P=0.016)。结论:miR-29a可能通过靶向调控MCL-1基因表达参与了ENKTCL的发生发展。

房屋建筑施工中现浇梁板模板的施工

建筑业随着经济的发展也在一步步的发展当中,这些年我国城市化的进程不断加快,范围也在慢慢的扩大,在房屋建筑施工方面就出现了现浇梁板模版,并且使用的越来越频繁,同时人们也对房屋建设施工的要求进一步提高。文章就我国房屋建设施工中的现浇梁板模板进行分析,论述了我国现在现浇模板的施工现状及一些问题的解决措施。

工程项目的ISO9000标准管理问题的研讨

通过笔者几年来对项目部管理体系的审核经验 ,就工程项目管理执行ISO90 0 0体系的若干要素 ,进行分析、讨论 ,阐述工程项目贯彻标准工作所要做好的几个问题 .