LncRNA NEAT1/miR-101-3p/RAC1在宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用及机制研究

目的 探讨lncRNA NEAT1在宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用机制。方法 采用RT-qPCR法检测宫颈腺癌细胞系HeLa、宫颈鳞癌细胞系SiHa和人子宫内膜上皮细胞系EM中lncRNA NEAT1的表达;干扰或过表达lncRNA NEAT1后,通过CCK-8和Transwell观察宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化,扫描电镜观察细胞侵袭性伪足的变化;采用双荧光素酶报告基因实验检测lncRNA NEAT1与miR-101-3p的靶向关系;通过免疫荧光、Transwell、CCK-8等方法检测lncRNA NEAT1/miR-101-3p/RAC1对SiHa和HeLa细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果 相比于EM细胞(0.99±0.04),宫颈癌SiHa(7.59±0.10,P<0.01)和HeLa(1.50±0.07,P<0.05)细胞中lncRNA NEAT1的表达明显升高。相比于sh-NC组,sh-NEAT1组(加入NEAT1敲低质粒)细胞增殖、迁移、侵袭及侵袭性伪足数量明显减少(P<0.05);相比于OE-NC组,OE-NEAT1组(加入NEAT1过表达质粒)SiHa、HeLa细胞增殖、迁移、侵袭及侵袭性伪足数量显著增加(P<0.05)。miR-101-3p与突变的NEAT1共转染后,相比于对照组(3.10±0.16)荧光素酶活性无显著变化(2.99±0.11,P>0.05),而与野生型NEAT1共转染后,相比于对照组(2.97±0.13)荧光素酶活性显著降低(1.15±0.05,P<0.01),提示lncRNA NEAT1与miR-101-3p靶向结合。RT-qPCR结果显示,与sh-NC组(SiHa,0.97±0.09;HeLa,1.07±0.06)相比,sh-NEAT1组miR-101-3p mRNA表达明显升高(SiHa,3.86±0.39;HeLa,2.62±0.51,P<0.01);与OE-NC组(SiHa,0.98±0.20;HeLa,1.05±0.18)相比,OE-NEAT1组miR-101-3p mRNA表达显著降低(SiHa,0.35±0.05;HeLa,0.14±0.03,P<0.05),提示lncRNA NEAT1与miR-101-3p的表达呈负相关。CCK-8、Transwell结果显示,siRNA-RAC1、miR-101-3p mimic使SiHa和HeLa细胞的增殖、迁移和侵袭受到抑制(P<0.05),上调lncRNA NEAT1可部分逆转以上现象,使细胞增殖、迁移和侵袭数目增加(P<0.05)。结论 宫颈癌细胞中lncRNA NEAT1的表达显著升高,它作为miR-101-3p的竞争性内源RNA(ceRNA),通过竞争性结合miR-101-3p并部分控制其对RAC1的调控,进而调节宫颈癌细胞侵袭性伪足的形成并诱导细胞增殖、迁移和侵袭。

宫颈癌源外泌体差异表达miRNA筛选及其关键靶基因的生物信息学分析

目的筛选宫颈癌细胞系(SiHa/HeLa)与正常宫颈上皮细胞系(H8)培养上清外泌体中miRNA表达差异,并通过生物信息分析确定靶基因。方法培养宫颈癌细胞系(SiHa/HeLa)与正常宫颈上皮细胞系(H8),收集细胞培养的上清液,超速离心法提取外泌体,透射电镜(TEM)观察外泌体的形态,蛋白质印迹实验鉴定外泌体标志蛋白。将提取的外泌体进行miRNA高通量测序,分别得出SiHa和H8外泌体中差异的miRNA,HeLa和H8外泌体中差异的miRNA,取二者交集。对于所得到的交集miRNA进行靶基因预测并进行基因本体(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。结果TEM观察到外泌体呈典型的杯状结构,大小30~200 nm,蛋白质印迹实验显示所提取样本有外泌体标志蛋白的表达。测序结果显示HeLa与H8源外泌体表达差异的miRNA有235个,SiHa与H8源外泌体表达差异的miRNA有249个,两种细胞系源外泌体中表达差异的miRNA有166个。GO生物功能分析显示,宫颈癌细胞外泌体miRNA的差异主要分布于细胞核、胞质、囊泡和细胞骨架等,蛋白质结合主要在金属离子结合、转移酶活性、核苷酸结合等环节发生作用,主要参与RNA聚合酶Ⅱ对转录的调控、DNA模板、磷酸化作用、细胞周期等生物功能。KEGG通路富集分析显示,宫颈癌相关通路与代谢途径、肿瘤的发病途径、轴突导向、PI3K-Akt、钙离子、Rap1、Ras等信号通路的调控相关。结论miR-335-5p、miR-660、miR-155-5p、miR-339-5p、miR-345-3p等miRNA在宫颈癌源外泌体中差异表达,这些差异表达的miRNA通过代谢途径、肿瘤的发病途径、轴突导向、PI3K-Akt、钙离子、Rap1、Ras等信号通路在宫颈癌的进展中发挥关键作用。