中国庚型肝炎病毒(HGV)全基因结构特点及其感染地理分布

分析和讨论了中国人庚型肝炎病毒（HGV）的基因结构特点及我国HGV感染的地理分布状况。中国庚型肝炎病毒株（HGVC964）基因全长9128个核苷酸，编码一个长度为2870个氨基酸残基的多聚前体蛋白。5’端有一个367bp的非翻译区，3’端非编码区为147个核苷酸。基因组中G＋C占59．9％。该株病毒与国外报道的三株HGV序列比较，核苷酸同源性为82．0％～86．2％，氨基酸同源性均大于90％。对我国部分地区的某些人群进行的分子流行病学研究表明，在我国北方、南方及广西少数民族地区也存在HGV感染。HCV自然感染者中，HGVRNA阳性率为6．7％；HC病人中，HGVRNA阳性率为9．6％；非甲一非戊型肝炎病人中，HGVRNA阳性率为5．0％。这表明，在我国HGV感染分布广泛，不同地理区带均有可能存在该型病毒感染。

安徽淮北地区人群HCV感染及HCV基因型分布调查

该地区农村自然人群、煤矿工人和职业献血者中抗－ＨＣＶ阳性率分别为１．４％、０．５％和４．８％。在ＨＣＶ感染者中男女之间差别无显著意义。ＨＣＶ感染者中多数具有明确的感染途径和来源。经输血和献血及使用血液制品是其主要的感染途径和来源。人群中ＨＣＶ基因型以Ⅱ型感染为主，占６３．９％。肝炎病人ＨＣＶ感染中混合感染所占比例比一般人群和职业献血者的混合感染比例高。

庚型肝炎病毒(HGV)NS5区部分基因的克隆和cDNA序列测定

用RT－PCR技术从一例献血员血清标本中扩增出HGV非结构区的部分基因片段，克隆后测定。cDNA序列。该序列与国外三株HGV的核苷酸同源性在90％以上；与GBV—A和GBV—B的同源性分别为44．7％和33．17％；与已发表的23个HCV全序列的相应序列比较，同源性均小于40％。结果表明，克隆的病毒株为HGV中国株。同时，用RT—PCR检测了河北固安和南京地区的115份HCV感染者标本．HGVRNA阳性率为3．47％。表明我国某些特殊人群中HGV感染率较高，是一个不容忽视的问题。

新疆吐鲁番农村自然人群HEV感染的血清流行病学调查

用ＥＬＩＳＡ间接法对吐鲁番农村自然人群ＨＥＶ感染进行血清流行病学调查。调查结果：抗－ＨＥＶＩｇＧ阳性率为１３．０％；不同性别、不同年龄的人群抗－ＨＥＶ阳性率无显著差别；显性感染与隐性感染之比为１：２．１７。

庚型肝炎的病原学及流行病学研究进展

庚型肝炎病毒是1995年被发现的一种新的人类致肝炎病毒。庚型肝炎的病原学和流行病学等方面的研究才刚刚起步。本文主要对庚型肝炎的病原学、流行病学及分子生物学研究进展作一概述。

LPS／D-GalN 诱导小鼠急性肝损伤模型的建立

目的建立脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)/D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-GalN)诱导小鼠急性肝损伤模型。方法 40只雌性C57BL/6小鼠用于观察8种不同LPS与D-GalN剂量配比联合刺激后小鼠存活时间,以确定模型建立的最佳剂量。使用腹腔注射最佳剂量染毒32只雌性C57BL/6小鼠,分别在0、1、4、8 h处死,每组8只,0 h注射相同剂量生理盐水作为对照。观察染毒后小鼠肝组织病理损伤,检测血清中ALT及炎症因子IL-6、MCP-1和TNF-α表达水平变化。结果通过观察小鼠存活时间,确定腹腔注射最佳染毒剂量为LPS(2.5 mg/kg)/D-GalN(0.3 g/kg);小鼠染毒后肝组织呈进程性病变,最终发展为肝脏弥漫性坏死,肝细胞核崩解。与对照组相比,血清ALT显著升高(P<0.001),IL-6、MCP-1、TNF-α均在1 h后达到最高水平(P<0.001),然后持续下降。结论成功建立LPS/D-GaIN诱导小鼠急性肝损伤模型,为探索急性肝损伤的致病机制以及药物干预治疗提供有效的动物模型。

重组人血清白蛋白-干扰素α-2b 融合蛋白体外抗乙型肝炎病毒活性评价

目的检测重组人血清白蛋白-干扰素α-2b融合蛋白(HSA-IFNα-2b)体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的活性。方法构建含1.6倍HBV基因组及绿色荧光蛋白的重组腺病毒(AdGFP-HBV),感染人肝细胞系HepG2细胞,构建HBV复制细胞模型;ELISA法检测HBV乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和乙肝病毒e抗原(HBeAg)表达;MTT法检测HSA-IFNα-2b对HepG2细胞的毒性作用;定量PCR法检测细胞内HBV RNA的相对表达以及细胞上清中HBV DNA绝对表达水平;双报告基因法检测HSA-IFNα-2b对HBV增强子Ⅰ活性的影响。结果 AdGFP-HBV感染HepG2细胞后可以复制表达HBV。HSA-IFNα-2b 500 kU·L-1加入AdGFP-HBV感染的HepG2细胞,使HBsAg表达降低51.32%(P<0.01),HBeAg降低50.26%(P<0.01),而相同浓度的HSA-IFNα-2b并不抑制细胞的增殖。随HSA-IFNα-2b浓度增加,其对HBsAg表达的抑制作用逐渐升高,HSA-IFNα-2b对HBsAg表达的抑制率(Y)与其浓度(X)的回归方程是Y=21.11 lgX+11.91(r2=0.954),IC50为63.76 kU·L-1。HSA-IFNα-2b 500 kU·L-1使细胞中HBV RNA下降52.83%(P<0.01),培养上清中HBV DNA降低53.07%(P<0.01)。HSA-IFNα-2b 500 kU·L-1使HBV增强子Ⅰ活性下降40.04%(P<0.01)。结论构建了可用于药物评价的HBV复制细胞模型,HSA-IFNα-2b体外具有抗HBV活性。

急性重型肝炎患者肝组织中庚型肝炎病毒的检测

检测急性重量型肝炎患者肝组织中庚型肝炎病毒（ＨＧＶ） 的存在状况及探讨与发病的关系，采用免疫组化方法以抗－ ＨＧＶＮＳ５ 单克隆抗体对２６ 例急性重型肝炎患者尸检肝组织中的ＨＧＶ 等抗原进行了检测。结果显示２６ 例肝组织中检测出ＨＧＶ 阳性６ 例（２３ ．１ ％ ） 。ＨＧＶＮＳ５Ａｇ 阳性着色颗粒表达于残存的肝细胞浆内，阳性细胞呈片簇状分布于汇管区周围。６ 例中４例重叠有ＨＢＶ 或／ 和ＨＣＶ 感染，肝组织中ＨＢｓＡｇ 或／ 和ＨＣＶ ＮＳ３Ａｇ 检测阳性，另２ 例肝组织中仅见ＨＧＶ ＮＳ５ 抗原表达。ＨＧＶ 感染可能与一些急性重型肝炎发病有关。

肝组织中TTV DNA原位检测及临床病理分析

目的：探讨非甲－非庚型急慢性病毒性肝炎患者肝组织中ＴＴＶ（ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ－ｔｒａｎｓｍｉｔｅｄｖｉｒｕｓ，ＴＴＶ）ＤＮＡ表达与临床病理的关系。方法：采用地高辛素标记ＴＴＶＤＮＡ探针以原位杂交技术对１９例血清学病毒标记非甲～非戊型、免疫组化检测肝组织中ＨＧＶＮＳ５阴性的病毒性肝炎患者石蜡包埋肝组织进行了检测，并对其中７例相应血清进行了ＰＣＲ检测。结果：急慢性病毒性肝炎肝组织中ＴＴＶ基因的总检出率为３１５８％，其中急性轻型肝炎的检出率为３０８％（４／１３），慢性肝炎３３３３％（２／６）。ＴＴＶＤＮＡ表达于肝细胞核或胞浆内，以核型多见。在急性肝炎，ＴＴＶ阳性细胞弥漫分布于肝小叶内，慢性肝炎于汇管区附近较为密集。阳性病例除１例慢性肝炎外，均有转氨酶的升高，肝组织与血清中的ＴＴＶＤＮＡ检出结果大致相同。结论：在不明原因病毒性肝炎患者肝组织中ＴＴＶＤＮＡ的检出表明ＴＴＶ为一种新型的肝炎病毒，ＴＴＶ为一种嗜肝性病毒。

利用DREAM设计和同源重组进行一步定点突变

目的:建立基于DREAM设计和同源重组的简便、快速定点突变方法。方法:设计两条包含突变的反向PCR(inverse PCR)引物,使其5′端互补从而产生同源重组,同时使用DREAM设计方案在上述引物中引入限制性内切酶位点以便突变子筛选。用能扩增长片段的高保真耐热DNA聚合酶扩增全长的质粒DNA,直接转化大肠杆菌。转化到细菌中的全长质粒DNA PCR产物可利用其末端同源序列发生同源重组而环化。利用引入的酶切位点方便地进行突变子的筛选。结果:用该方法成功地对长度大于7kb的质粒进行了定点突变。结论:本定点突变无需任何突变试剂盒和特殊的试剂,只需一步反应即可完成;利用DREAM设计使克隆筛选简便可靠,高保真耐热DNA聚合酶可保证多数突变子克隆不发生意外突变,而该酶扩增长片段的能力使该方法适合于大多数质粒不经亚克隆直接突变。

甲型流感病毒H1N1 HA蛋白在果蝇S2细胞中的表达及免疫原性研究

目的在果蝇S2细胞表达甲型流感H1N1HA并分析其免疫原性。方法根据GenBank发表的甲型流感病毒(H1N1)HA基因序列,经过密码子优化,全基因合成编码HA的基因,并于其N端引入特定的空间折叠序列,定向连接至表达载体pMT/Bip/V5-His A,构建重组表达载体pMT-HA。酶切鉴定正确后,用脂质体转染法与辅助质粒pCoHygro共转染果蝇S2细胞,潮霉素加压筛选稳定细胞系,在无血清培养基中以硫酸铜溶液诱导表达,SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定,经镍柱纯化后免疫小鼠,ELISA检测其诱导的特异性抗体水平。结果获得了稳定表达HA的S2细胞株,目的蛋白以分泌形式表达于上清,并形成三聚体,可以被H1N1HA抗体识别;免疫小鼠后可诱导机体产生抗HA特异性抗体。结论获得了纯化的三聚体形式表达的HA蛋白,并具有较好的免疫原性,具有很好的疫苗应用前景。

用RT-PCR诊断Ⅰ型鸭肝炎病毒

取北京郊区某鸭场的病鸭肝脏制备病料,接种12日龄鸭胚尿囊腔及2日龄健康雏鸭,应用RT-PCR方法对病鸭的肝脏悬液及鸭胚尿囊液进行检测并测序,确定所分离的病毒为Ⅰ型鸭肝炎病毒.

鸭肝炎病毒现场分离株单克隆抗体的研制

为有效防治鸭肝炎,建立特异性强、敏感性高、简便快速的DHV检测方法,对分离的DHV进行纯化,并制备单克隆抗体。鸭胚尿囊液中的DHV经冻融、氯仿反复处理、PEG浓缩和超速离心纯化后,免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术,通过间接ELISA法筛选及多次亚克隆,成功获得8株阳性杂交瘤细胞,分别命名为DHV-1、DHV-6、DHV-7、DHV-8、DHV-9、DHV-10、DHV-11和DHV-12,并制备出腹水。8株单抗腹水经ELISA法检测,DHV-7、DHV-8的效价为1∶2 000;DHV-6、DHV-10的效价为1∶8 000;DHV-1、DHV-9、DHV-11和DHV-12的效价为(1∶32 000)^(1∶512 000)。抗体亚类鉴定,DHV-6、DHV-7、DHV-8、DHV-10为IgG1;DHV-1、DHV-12为IgG2a;DHV-2、DHV-9、DHV-11为IgG2b。上述抗体均为k链。特异性鉴定表明,上述单克隆抗体只能与从尿囊液中纯化的DHV病毒包板反应,与非DHV抗原无反应。鸭胚中和试验及雏鸭保护试验结果表明,DHV-6、DHV-7、DHV-9、DHV-10具有较好的中和活性,并对雏鸭有不同程度的保护作用。

10株鹦鹉热衣原体菌株主要外膜蛋白基因的比较性研究

目的 进行比较性研究了 10株鹦鹉热衣原体菌株 ,分析其主要外膜蛋白 (MOMP)基因的限制性内切酶图谱和基因同源性。方法 接种鸡胚卵黄囊对菌株进行培养 ,收集培养物 ,通过聚合酶链式反应 ,扩增了 10株Cps的主要外膜蛋白基因 ,获得 10 5 8bp的片段 ,根据限制性片段长度多态性 (RFLPs)技术 ,利用AluⅠ酶切此片段 ,获得其限制性图谱。将此片段连入 pGEMT载体 ,进行基因测序。 结果 有 5株菌的MOMP基因完全相同 ,将它们与其它 5株比较 ,仅有个别碱基不同。

原位杂交法检测非甲─非庚型肝炎患者肝组积中新型肝炎病毒DNA

目的证实在非甲-非庚型病毒性肝炎患者肝组织中一种新型肝炎病毒（transfusion－transmittedvirus，TTV）的存在．方法采用地高辛素标记TTVDNA探针以原位杂交技术对51例血清学病毒标记非甲-非戊型、免疫组化检测肝组织中HGVNSS阴性的病毒性肝炎患者石蜡包埋肝组织进行了检测．结果各型病毒性肝炎肝组织中TTV基因的总检出率为27．5％，其中急性轻型肝炎的检出率为30．8％（4／13），急性重型肝炎（1／8，12．5％），亚急性重型肝炎（3／7，42．9％），慢性肝炎（2／6，33．3％），活动性肝硬变（2／9，22．2％），慢性重型肝炎（1／4，25％），原发性肝癌（1／4，25％）TTVDNA表达于肝细胞核或胞浆内，以核型多见．在急性肝炎，TTV阳性细胞弥漫分布于肝小叶内，慢性肝炎于汇管区附近较为密集，而在肝硬变病例，阳性细胞在假小叶内多呈片簇状不规则分布结论在不明原因病毒性肝炎患者血清及肝组织中TTVDNA的检出表明TTV为一种新型的肝炎病毒，TTV为一种嗜肝性病毒。

我国部分地区人群中HDV感染的流行病学调查

对山西、新疆、安徽、上海、天津及北京等地的自然人群和某些特殊人群进行了ＨＤＶ感染的调查．结果表明，上述地区自然人群感染率为０．４％～１．１％；某些特殊人群中ＨＢｓＡｇ携带者ＨＤＶ感染率为７．１％～１１．４％，临床肝炎病人中ＨＤＶ感染率为９．５％～１０．４％．慢性肝炎患者ＨＤＶ感染率明显高于急性乙型肝炎患者。血液制品及院内感染是其传播的主要来源．

南京地区TTV部分基因的克隆及序列测定

目的：了解中国南京地区有无输血传播病毒（TTV）感染。方法：用套式聚合酶链反应（PCR）检测病因未明肝炎患者血清中TTVDNA，并对PCR扩增产物进行序列测定。结果：14例非甲-非戊型肝炎患者血清中共检出8例TTVDNA阳性者，对其中一株进行序列测定，该序列与日本TTV部分基因（CLON_22）和TTV中国株1相对应位置的核苷酸同源性很高，分别达97.65％和98.99％。结论：中国南京地区肝炎患者存在TTV感染。