神经营养因子(NGF、NT-3、BDNF及CNTF)和受体trkA、trkB、trkC在正常大鼠脊髓和胳鼠脊髓移植体的免疫组织化学研究

本研究采用免疫组织化学方法观察了NGF家族（NGF、NT－3、BDNF）和非NGF家族的CNTF以及NGF家族因子受体trkA、trkB、trkC在正常大鼠脊髓腰段的分布和胎鼠脊髓移植体在移植后4周的表达。在正常大鼠脊髓腰段，各神经营养因子及受体反应物主要存在于脊髓灰质，特别是前角的运动神经元。但在脊髓后角的分布稍有不同，BDNF阳性细胞的胞浆染色较深，胞核不染色；而NT－3的胞核染色较胞浆为深，核仁不染色。在胎鼠脊髓移植体，NGF、BDNF、CNTF和NT－3及受体trkA、trkB、trkC均有不同程度的染色。本实验结果揭示了在正常大鼠脊髓神经元内各神经营养因子及受体的表达，提示神经营养因子除具有靶源性来源以外，还有神经元自分泌的产物。而在胎鼠移植体内和其周围组织神经营养因子及其受体的表达，可能是在移植体内的移植细胞自分泌和成鼠脊髓损伤的刺激所引起的，这在移植体的存活和发育中有重要作用。

海人藻酸致大鼠脊髓损伤模型的光镜和电镜研究

用成年Ｗｉｓｔａｒ大鼠７０只，雌雄不拘，通过向腰髓内注射海人藻酸（５μｌ，０．００１ｍｏｌ／Ｌ）建立了脊髓内注射神经毒导致大鼠脊髓损伤的动物模型；一部分向脊髓内注射盐水做为对照．动物按注射后存活２ｈ、６ｈ、１２ｈ、２４ｈ、３ｄ、６ｄ和１４ｄ分组．Ｎｉｓｓｌ染色，电镜观察。注射后２４ｈ内，脊髓腹角神经元出现进行性细胞肿胀，尼氏作皱缩深染，形成许多微细的空泡，胞核浓缩。电镜下观察到内质网、线粒体和高尔基氏体的肿胀和胞质内的空泡和树突的膨胀．注射后３～６ｄ，神经细胞发生明显的退变，细胞质浓缩，尼氏体分解，早期病变的小空泡形成较大的空洞，核偏移。６ｄ后大部分细胞死亡，尚存的脊髓运动神经元明显肿胀，细胞核的边界不清，尼氏体完全消失，电镜下显示细胞器完全被破坏，胞质内的空洞进一步融合形成几个大空洞，细胞核继续浓缩。１４ｄ后注射部位的运动神经元几乎完全消失，胶质细胞明显增生。作为谷氨酸受体激动剂的海人藻酸导致脊髓运动神经元的急性溃变，可作为除撞击、压迫、缺血或横断所致脊髓损伤以外的又一种动物模型，其损伤的病理变化以神经元退变为主，而脊髓的完整性不受破坏，类似于脊髓灰质炎的病变，适用于神经细胞移植的研究。

大鼠嗅球和鼻腔嗅粘膜成鞘细胞的形态学研究

目的 观察大鼠嗅神经成鞘细胞在嗅球和嗅粘膜的分布及其形态学结构特征 ,研究其与中枢神经再生的关系。 方法 Luxol固蓝染色、Mallory染色和NGFRp75免疫组织化学染色结合透射电镜观察。 结果 在嗅球纤维层的成鞘细胞随神经纤维呈纵向排列 ,在嗅小球层的成鞘细胞则围绕着嗅小球环行排列。在嗅粘膜的成鞘细胞位于柱状上皮深方 ,沿基底膜分布。成鞘细胞的胞体为细长梭形 ,有较长的突起 ,细胞核呈圆形或椭圆形。在嗅小球周围和嗅粘膜内的成鞘细胞呈NGFRp75免疫反应阳性。在电镜下 ,嗅球成鞘细胞的纵断面上可见其胞体呈长梭形 ,细胞核为不规则形 ,核仁清晰。在胞体的周围有大量的平行神经纤维纵向排列 ,在放大的横断面上 ,可见在 1个成鞘细胞的细胞核周围有数根神经纤维被胞质包裹在一起。 结论 嗅成鞘细胞是一种特殊的胶质细胞 ,分布于嗅球的纤维层、嗅小球层和嗅粘膜内。嗅神经成鞘细胞的胞体细长 ,有较长突起 。

自体和胎鼠骨骼肌桥接脊髓缺损的实验研究

成年雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠分为Ａ、Ｂ组在Ｔ_８～Ｔ_（１０）做脊髓半横断切损２．０ｍｍ；Ｃ、Ｄ组在Ｔ_８～Ｔ_（１０）做脊髓全横断切损２．０ｍｍ。Ａ、Ｃ组接受成体竖脊肌的移植体，Ｂ、Ｄ组接受胎鼠（Ｅ_（１８））股部肌肉的移植体。Ｅ组，为无移植体的脊髓完全横断对照组。术后２个月的ＣＴ－ＨＲＰ示踪及组织学（Ｇｌｅｅｓ）银染色方法显示，在各实验组动物的骨骼肌移植体与受体脊髓间呈不同程度的组织愈合，特别是在胎鼠骨胳肌移植的Ｂ组和Ｄ组，脊髓与肌肉移植体之间出现一段两种组织交错的融合区。在两种骨骼肌移植体内，都发现有再生的银染和ＣＴ－ＨＲＰ标记的阳性神经纤维沿着骨骼肌纤维生长行走。Ａ、Ｃ组自体移植体的骨骼肌横纹清晰可见；Ｂ、Ｄ组移植体的胎鼠骨骼肌组织已变性，横纹消失。在移植体两端与脊髓组织愈合处及肌组织内发现的神经纤维提示，再生的神经纤维可通过骨胳肌移植体进入脊髓远段，而且胎鼠骨胳肌移植体优于成体的骨骼肌移植。本文讨论了骨骼肌作为中枢神经移植体修复脊髓缺损的可能性，并推测骨骼肌移植体内可能存在诱导神经纤维再生的特异神经生长因子，促进了损伤脊髓的修复。

骨骼肌提取液对大鼠坐骨神经损伤所致腰段脊髓腹角和背根节神经细胞溃变的影响

用ＣＴ－ＨＲＰ逆行追踪法及ＣｈＡＴ单克隆抗体的ＡＢＣ免疫组织化学技术研究了新生大鼠骨骼肌提取液（ＭＥ，２０～５０ｋＤ）对钳夹大鼠坐骨神经所致的腰骶部脊髓腹角和背根节神经细胞溃变的影响。实验结果显示：注射ＭＥ实验组的脊髓腹角运动神经元和背根节细胞的存活均数与注射盐水的对照组相比，其比值为６：０，有显著性差异（Ｐ＜０．０１）。提示骨骼肌提取液（２０～５０ｋＤ）对脊髓腹角运动神经元和背根节感觉神经细胞的演变有明显的保护作用。

限定骨骼肌提取液（ME，10～50kDa）影响培养的大鼠脊髓腰段运动神经元生长的定量研究

用胎鼠的限定骨骼肌提取液（ＭＥ，１０～５０ｋＤａ）作用于无血清培养的胚胎大鼠脊髓腰段腹角细胞后，用四唑盐（ＭＴＴ）微量自动比色定量法和ＬＤＨ活性测定法检测了骨骼肌提取液对大鼠脊髓运动神经元生长存活的生物活性，结果显示：细胞培养４ｄｉｖ后，ＭＴＴ微量比色的ＯＤ值随加入骨骼肌提取液浓度的增加而升高，含骨骼肌提取液２００和４００μｇ／ｍｌ蛋白的实验孔与单纯无血清的对照孔比较有极显著性差异（Ｐ＜０．００１），说明２００μｇ／ｍｌ以上浓度的骨骼肌提取液对脊髓腹角神经元的生长有明显的促进作用。细胞培养１４ｄｉｖ后，ＬＤＨ活性测定ＯＤ值的线性回归斜率亦随加入骨骼肌提取液浓度的增加而升高，说明存活细胞数的增加。实验说明培养神经细胞的ＭＴＴ和ＬＤＨ的检测方法有可能成为评估运动神经营养因子活性的指标。

运动神经元营养因子对大鼠脊髓撞击伤修复的影响

成年Wistar大鼠32只，分为4组．分别按Alien法制成脊髓完全性（545gcf）和不完全性（21gcf）损伤模型．每种损伤模型文分别制成MNTF的实验组和盐水对照组。术后4周，分别做Glees、Nissl染色和ChAT、GFAP抗体的免疫组织化学反应，在镜下观察了运动神经元营养因子对脊髓急性撞击伤病理变化和再生的影响。结果表明：运动神经元营养因子对Allen法所致的完全性脊髓损伤修复的作用不明显，但对不完全性脊髓损伤具有局限脊髓空洞、促进瘢痕愈合和神经再生的作用。

胎鼠、成鼠和人胚的骨骼肌提取液及肌源神经营养因子的高效液相分析

大量的在体和离体实验证明，骨骼肌内存在着促进脊髓神经元存活和再生的物质。本研究采用高效液相分析方法对胎鼠、成鼠和人胚的骨骼肌提取液进行了分析。结果表明，三者在相同条件下尽管出现蛋白峰的数量不同，峰值也有所差异，但在相同的时间点出现两处４ 峰（Ⅰ、Ⅱ１、Ⅱ２、Ⅱ３）的基本波型。峰Ⅱ１ 的分子量为３５０００Ｄ，峰Ⅱ２ 的分子量为２２０００Ｄ，峰Ⅱ３ 的分子量为１８０００Ｄ。胎鼠和人胚的三峰呈中、低、高的形态分布，而成鼠的三峰呈低、中、高的形态分布。肌源神经营养因子（１０～３０ ｋＤ）位于峰Ⅱ。此结果使人们对肌源神经营养因子的存在产生了疑问，肌源神经营养因子究竟是一个新的营养因子（分子量究竟是多少？），还是已知的神经营养因子（ＣＮＴＦ，ＢＤＮＦ，ＮＴ３ 等）在骨骼肌组织中的分布？ 对此有必要进行分子生物学的研究来确定。

巢蛋白在体外培养的大鼠骨骼肌卫星细胞发育过程中的表达——免疫细胞化学研究

为了观察巢蛋白 (nestin)在骨骼肌卫星细胞发育过程中的分布状况以进一步探讨 nestin在肌细胞发育中的作用 ,本实验对新生 Wistar大鼠股部骨骼肌传代培养后 ,在不同发育期进行 nestin单克隆抗体的 ABC免疫组织化学反应 ,并以抗 actin,desmin单克隆抗体作同期对照 ;计算阳性肌卫星细胞数量并进行统计学分析。结果发现 :actin,desmin,nestin三组间在同一培养时间点上的阳性肌卫星细胞数量无差异 (P>0 .0 5 ) ,但在时间点之间的比较上 ,4h组较 2 h组的阳性肌卫星细胞数量有所增加 (P<0 .0 5 ) ,其余各时间组的阳性肌卫星细胞数量则显著高于 2 h组、4h组 (P<0 .0 1)。提示

γ-氨基丁酸和钙结合小蛋白在鸡脊髓运动神经元内共存的免疫组化和电镜免疫细胞化学的研究

雏鸡12只,用免疫组织化学方法显示在脊髓前角分别出现γ-氨基丁酸和钙结合小蛋白抗体阳性反应的运动神经元。并在前者的免疫组化反应阳性神经元的基础上进行了胶体金标记钙结合小蛋白的电镜免疫细胞化学反应。证明了γ-氨基丁酸免疫组化反应阳性的运动神经元的胞浆内又出现标志钙结合小蛋白的金颗粒。因此推测:脊髓运动神经元除γ-氨基丁酸的突触前抑制外,在神经元内大量的γ-氨基丁酸可能不是单纯抑制性神经递质。根据神经元的退行性变时出现包括γ-氨基丁酸在内的某些氨基酸的功能障碍和钙调节失控的假说,γ-氨基丁酸有可能通过钙结合蛋白共同起到参与防止神经元退行性变的类似神经营养因子的作用。

骨骼肌组织对鸡胚背根节细胞GABA表达的影响

采用在体和离体实验及随后的免疫组织化学方法，研究了周围靶组织对鸡背根节（ＤＲＧ）内ＧＡＢＡ细胞发育的影响。在胚胎６ｄ行鸡胚单侧右后肢切除后１２ｄ，切除侧后肢缺如，其ＤＲＧ明显小于对照侧，其细胞数量也明显少于对照侧。实验侧的ＤＲＧ细胞均呈ＧＡＢＡ阴性，而对照侧有７．０％的感觉神经细胞为ＧＡＢＡ阳性。在Ｌ４～Ｓ１脊髓边缘切断右侧脊神经根后１２ｄ，ＤＲＧ的形态无特殊异常，ＧＡ－ＢＡ免疫反应细胞的出现率与对照侧相同。取自胚胎６ｄ的鸡胚ＤＲＧ细胞培养１２ｄ后的ＧＡＢＡ免疫反应为阴性。然而，当同样胚龄的ＤＲＧ细胞与骨骼肌细胞共同培养１２ｄ后，有部分ＤＲＧ细胞呈ＧＡＢＡ阳性反应，其神经突起与骨骼肌细胞相连。这些结果表明：鸡胚ＤＲＧ细胞ＧＡＢＡ的表达是依赖其周围靶组织——骨骼肌的存在，与其中枢靶组织无关。

在体和离体的鸡背根节神经细胞5-羟色胺的免疫组织化学研究

用PAP免疫组织化学方法研究了鸡胚和雏鸡背根节内5-HT神经细胞的形态与胚胎发育,并在离体细胞培养条件下研究了靶周围组织(皮肤)对其胚胎发育的影响。在鸡腰骶部背根节,5-HT免疫反应阳性细胞最先出现于鸡胚13d(E_(13)),占0.4%;孵出后2d(AH_2)占6.2%。阳性细胞主要为大的A类细胞和极少的小B类细胞。免疫反应阳性的周围神经末梢位于皮肤和跟腱中。取自E_9鸡胚的背根节细胞培养7d后有部分出现5-HT阳性免疫反应,取自E_6鸡胚的背根节细胞培养10d仍为阴性反应;然而,当取自E_6鸡胚的背根节细胞与皮肤组织联合培养10d后,则出现5-HT阳性免疫反应细胞。本文还对脊髓5-HT细胞的出现进行了讨论。

养血清脑颗粒对蒙古沙鼠全脑缺血再灌注后的神经保护作用

目的探讨养血清脑颗粒对蒙古沙鼠全脑缺血再灌注后的神经保护作用。方法用两血管阻塞法(2-VO)结扎30 min再灌注损伤模型,将蒙古沙鼠随机分为假手术组、模型组和手术前90min灌胃法给药预防组。用Nissl染色法观察蒙古沙鼠海马CA1区细胞的变化;用免疫组织化学方法观察海马CA1区表达谷氨酸盐合成酶(GlSyn)和Caspase-3阳性细胞数量的变化;TUNEL法检测细胞凋亡。结果蒙古沙鼠全脑缺血再灌注1d及2d预防给药组Nissl染色结果显示,海马CA1区存活细胞数量比模型组明显增多(分别为P<0.01,P<0.05);再灌注5d预防给药组海马CA1区存活细胞数量与模型组相比无显著性差异(P>0.05)。再灌注1d及2d预防给药组海马CA1区表达谷氨酸盐合成酶(G1 Syn)的阳性细胞量较模型组明显减少(分别为P<0.01,P<0.05);再灌注5d预防给药组海马CA1区免疫阳性细胞数量与模型组相比无显著性差异(P>0.05);Caspase-3的表达在再灌注1d时预防给药组免疫阳性细胞数量与模型组比较有显著性升高(P<0.05),但是再灌注2d及5d时预防给药组免疫阳性细胞数较模型组无显著降低(P>0.05)。TUNEL结果显示预防给药组凋亡细胞相应减少。结论养血清脑颗粒能通过谷氨酸盐合成酶选择性抑制兴奋性氨基酸谷氨酸的神经毒性作用,减少神经细胞的凋亡,从而发挥神经保护作用。

成年大鼠嗅球和鼻腔嗅粘膜成鞘细胞的分离、培养与鉴定

目的 在嗅球成鞘细胞 (OECs)移植到脊髓可有助于损伤神经纤维再生的基础上 ,分别对嗅球和嗅粘膜的OECs进行培养 ,探索自体嗅粘膜作为OECs供体的可能性。 方法 根据OECs、成纤维细胞和星形胶质细胞贴壁时间的不同 ,采用差时贴壁方法分离出OECs,培养 14div后进行NGFRp75和GDNF的免疫细胞化学染色。 结果 按形态学和免疫组织化学特性 ,培养的嗅球和嗅粘膜OECs可分为 3类 :双极细胞、三级细胞和扁圆细胞 ,其中以双极细胞最多。嗅粘膜的双极成鞘细胞的突起更加细长。 结论 差时贴壁细胞分离法是一种简单、经济、实用的成鞘细胞分离方法。鼻腔嗅粘膜OECs的形态学和免疫细胞化学特性与嗅球OECs基本相同 。

嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤后顽固性神经性疼痛17例报道

目的探讨嗅鞘细胞移植对脊髓损伤后顽固性神经性疼痛的治疗效果。方法对细胞学治疗后获得疗效的脊髓损伤合并顽固性神经性疼痛患者的临床资料进行总结。2004年11月～2007年11月间的17例患者,其中男性15例,女性2例,年龄18～68岁,平均40.4岁。受伤6～312个月,平均105.9个月,受伤原因包括车祸、坠落、放射性损伤、机器挤压伤、枪伤、跳水。疼痛持续时间6～309个月,平均102.2个月。嗅球嗅鞘细胞胰蛋白酶消化成单细胞后培养12～14d。细胞移植到损伤段的上下两端。疼痛评价使用国际神经修复学会脊髓损伤日常生活功能评价量表:0分为极度疼痛,止痛药无效;1分为中度疼痛,需用强效止痛药;2分为轻度疼痛,普通止痛药有效;3分为无疼痛。结果随访时间0.5～88个月,平均17.5个月,疼痛平均改善1.2分。结论嗅鞘细胞移植对脊髓损伤后神经性疼痛有一定治疗作用。

小檗碱对局部脑缺血组织中HIF-1α表达的影响

目的研究大鼠局部性脑缺血再灌注损伤时,小檗碱(BE)对缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达及脑神经元凋亡的影响。方法雄性SD大鼠随机分为假手术组、大脑中动脉阻塞再灌注组(MCAO/R组)、假性治疗组(DMSO组)、小檗碱10mg/kg治疗组(BE10组)、小檗碱20mg/kg治疗组(BE20组)、小檗碱40mg/kg治疗组(BE40组)。治疗组在术前48h、24h及术后6h腹腔注射相应剂量药物,观察各组大鼠神经行为学缺陷;再灌注7d,TTC染色观察脑梗死体积变化;再灌注24h,制备脑组织切片分别作Nissl染色、免疫组织化学染色、TUNEL标记及免疫荧光双标记。结果BE20、BE40组神经功能较MCAO/R组有明显改善(P<0.05),但BE10组神经学评分与MCAO/R组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。不同剂量BE治疗均可以减小梗死灶体积(P<0.05),且呈现剂量依赖性。Nissl染色可见BE治疗组皮质神经元结构较清晰,胞体肿胀、核固缩、核溶解程度较模型组及假性治疗组明显减轻,淡染区域减小;免疫组织化学法观察到,BE组HIF-1α、Caspase-3、BNIP3、VEGF及TUNEL标记的阳性细胞数减少;免疫荧光双标记显示HIF-1α与BNIP3、Caspase-3及TUNEL阳性颗粒共表达于细胞中。结论BE可能通过降低HIF-1α水平并下调其下游的BNIP3和VEGF的表达,从而减少凋亡因子Caspase-3的作用而发挥神经元保护作用。

养血清脑颗粒对蒙古沙鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区神经元的治疗作用

目的探讨蒙古沙鼠全脑缺血再灌注后养血清脑颗粒(Yangxueqingnaokeli,YXQNKL)的治疗作用。方法采用蒙古沙鼠两侧颈总动脉结扎法,缺血30min再灌注5d模型(分为假手术组、缺血再灌注组、养血清脑颗粒治疗组)。用Nissl染色法观察海马CA1区神经元的形态和数量,用免疫组织化学方法观察海马CA1区神经元神经钙离子感应蛋白1(NCS-1)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)和谷氨酸盐合成酶(Glusyn)的表达情况。结果与缺血再灌注组比较,缺血再灌注+0.4g/kg养血清脑颗粒治疗组和缺血再灌注+0.8g/kg养血清脑颗粒治疗组Nissl染色显示海马CA1区神经元数量明显增加(P<0.05);免疫组织化学法显示海马CA1区神经元细胞NCS-1、caspase-3和Glusyn的阳性细胞数明显减少(P<0.05)。结论全脑缺血再灌注后,给予养血清脑颗粒能显著增加海马CA1区神经元数量,这与其减少海马CA1区神经元NCS-1、caspase-3和Glusyn的表达有密切的联系。

神经营养素在小鼠脾的定位研究

为了解神经营养素与免疫系统的关系，用免疫组织化学方法对神经营养素包括神经生长因子（ＮＧＦ）、脑源性神经营养因子（ＢＤＮＦ）、神经营养素３（ＮＴ－３）进行小鼠脾的定位研究。结果表明：３种神经营养素的免疫反应均存在于脾内，但分布特点各不相同。ＮＧＦ主要分布于白髓动脉周围淋巴鞘（ＰＡＬＳ）外层、边缘区（ＭＺ）和红髓（ＲＰ）的巨噬细胞样和淋巴细胞样细胞；ＢＤＮＦ除具有与ＮＧＦ相似的分布特点外，还见于脾淋巴小结生发中心的淋巴细胞样细胞；ＮＴ－３则存在于白、红髓的网状细胞样细胞。这一结果提示，脾的免疫和非免疫细胞均可能产生神经营养素，并提示不同类型的神经营养素对免疫系统有不同的作用。