河蟹养殖塘极端高温期溶氧变化试验

夏季是河蟹生长的主要阶段,但在8月常会出现极端高温。2022年,我国多地气温创下了历史最高记录,江苏部分地区最高气温直逼40℃,而且持续多天,严重影响了河蟹的脱壳与存活。高温期,池塘中溶氧发生剧烈变化,而溶氧与河蟹生长紧密相关,本研究对河蟹养殖塘极端高温期的溶氧进行动态监测和比较分析。

不同地理种群克氏原螯虾形态差异及相关分子标记研究

为了解我国克氏原螯虾不同地理群体的种属差异,加快克氏原螯虾的育种进程,筛选与目标性状紧密相关位点的基因型进行分子辅助选育,选取安徽巢湖、江西鄱阳湖、山东微山湖、湖南洞庭湖、湖北洪湖、江苏洪泽湖6个地区的克氏原螯虾样品,对全长、体长、体重、头胸甲长、头胸甲宽、腹部长、腹部宽、尾扇长8个形态学指标进行测量,以2个形态参数比进行多元分析;并根据标记位点鉴定出的个体基因型,与测量到的形态指标的差异进行生长性状的关联分析,分析出克氏原螯虾重要的经济性状肌肉重、腹部宽、头胸甲宽等和与之相关的标记位点。聚类分析表明,6个地区的克氏原螯虾分为2个分支,第1分支为巢湖群体和洪湖群体;鄱阳湖群体、微山湖群体、洞庭湖群体和洪泽湖群体构成第2分支。主成分分析结果显示,雌虾的4个主成分累计贡献率达85.10%,其中,第1和第2主成分分别是腹长因子和腹宽因子;雄虾的4个主成分累计贡献率达86.31%,第1和第2主成分分别为头胸甲和腹部因子。判别分析中,雌性综合判别率为82.16%,雄虾为83.28%,判别率较高。关联分析表明,14对分子标记的连锁不平衡共有105对SSR位点组合,满足P<0.01的条件,14对SSR引物在168份克氏原螯虾材料中存在连锁不平衡,可与生长性状进行关联分析。采用一般线性模型对克氏原螯虾种质的6个表型性状和2个质量性状同SSR位点进行关联分析,在P<0.01的阈值条件下,存在1组引物关联多个性状的情况,共检测到30组引物对6个表型性状和2个质量性状呈极显著关联状态。由此可以丰富克氏原螯虾群体关联位点的筛选,并在一定程度上为克氏原螯虾种质资源的保护和亲本选育工作提供支持。

中华绒螯蟹MIH基因SNP位点筛选及其与生长性状的关联分析

为明确蜕皮抑制激素基因(MIH)对中华绒螯蟹的生长调控机制,本研究选取100只中华绒螯蟹幼蟹个体,分析幼蟹MIH基因的单核苷酸多态性(SNP)位点及基因型,并对与生长指标相关的多态性位点进行连锁不平衡和单倍型分析,进一步明确多态性位点单倍型与生长性状之间的相关性。结果显示,在中华绒螯蟹幼蟹MIH基因中共筛选鉴定出5个SNP位点,其中3个位点(C640G、C2529T和G2595T)与中华绒螯蟹生长性状具有相关性;3个相关位点中共检测到5种单倍型,其中H1单倍型(GCG)的占比最高(68.8%),为优势单倍型;H3单倍型(GTT)个体的生长性状指标最高,显著高于H2单倍型(CCG)。本研究得到的中华绒螯蟹MIH基因上3个与生长性状相关的SNP位点,可作为候选分子标记用于中华绒螯蟹优质品种选育。

肌质网钙泵SERCA基因在中华绒螯蟹钙离子调控中的功能及其对蜕壳的影响

中华绒螯蟹的蜕壳周期中具有高度复杂的钙调节机制,本研究探索了水体中不同Ca2+浓度(40、80、160和320 mg/L)对中华绒螯蟹的Ca^(2+)信号转导的影响,并对其中的关键因子肌质网钙泵(SERCA)进行基因干扰以探索其功能。结果显示:①养殖水体高浓度Ca^(2+)可致Y器官和鳃组织中Ca^(2+)信号通路相关基因SERCA、PMCA、RyR和NCX相对表达量上升,眼柄中MIH表达量下降,血淋巴中Ca^(2+)与蜕皮激素水平上升,说明高浓度的Ca^(2+)可促进中华绒螯蟹蜕壳。②利用RNAi技术干扰SERCA基因表达,普通水体和加入320 mg/L Ca^(2+)的水体中中华绒螯蟹Y器官中PMCA和NCX基因表达量上升、RyR基因表达量下降,且细胞内Ca^(2+)浓度上升,表明SERCA基因在中华绒螯蟹维持细胞内Ca^(2+)浓度和细胞内钙稳态机制中发挥重要作用。③长期干扰SERCA基因的表达可延长中华绒螯蟹的蜕壳间隔,且降低增重率与存活率。然而,高钙环境下长期干扰SERCA基因,相对于普通水体,蜕壳间隔缩短,存活率降低。研究表明,SERCA基因可能是通过对Ca^(2+)信号的干扰而影响中华绒螯蟹的蜕壳。本实验将为中华绒螯蟹蜕壳机制的进一步研究提供基础参考。

基于微卫星标记的克氏原螯虾种群遗传多样性和遗传结构分析

为了解当前我国不同地区克氏原螯虾种群的遗传背景情况,以期为人工养殖、新品种选育和资源保护提供参考依据。选取江苏洪泽湖(HZH)、湖北洪湖(HH)、湖南洞庭湖(DTH)、山东微山湖(WSH)、安徽巢湖(CH)、江西鄱阳湖(PYH)6个典型区域的克氏原螯虾群体作为研究对象,采用14对微卫星引物对来自6个地区的168份样品进行遗传多样性检测。结果可知,各群体不同标记位点的等位基因数在3~14之间,平均期望杂合度为0.81,平均多态信息含量分布在0.42~0.59之间,各群体均处于中高度遗传多样性水平。6个群体均发生一定程度Hardy-Weinberg平衡偏离,仅有少数位点在单一群体满足Hardy-Weinberg平衡,同时连锁不平衡检测发现9个连锁座位对处于不平衡状态。遗传距离结果显示,6个克氏原螯虾群体的遗传一致度(I)处于0.1278~0.6439之间,各群体间遗传距离(D)处于0.4402~2.0573之间。群体间遗传分化指数(Fst)接近0.5,反映出群体间的基因交流水平较弱,存在高度的遗传分化。AMOVA分析发现,39.65%的遗传变异来源于群体间,97.99%的遗传变异来源于个体间。遗传结构数据显示,K=5时,6个群体间存在显著的结构差异。上叙结果可知,6个地区的克氏原螯虾群体具有丰富的遗传多样性,群体间出现了显著分化,可通过隔离保种、杂交、选择育种等方式保护利用克氏原螯虾的种质资源,为我国克氏原螯虾产业的持续健康发展提供良种支持。

鲤IL-17B基因序列特征、表达模式、原核重组蛋白的获得及其促炎作用

为了解鲤白细胞介素17B基因(IL-17B)的功能,实验使用同源搜索和基因克隆技术在鲤基因组中挖掘到2个IL-17Bs基因(CcIL-17B1和CcIL-17B2),均有3个外显子和2个内含子,编码198个氨基酸,内含IL-17家族特有的由4个半胱氨酸形成的2个二硫键,蛋白序列一致性高达91.92%。共线性分析显示,在硬骨鱼类染色体加倍过程中,IL-17B及其附近基因出现了丢失,大部分硬骨鱼类有1个IL-17B、斑马鱼2个IL-17Bs均丢失,而鲤特有的染色体加倍致使存在2个CcIL-17Bs。实时荧光定量PCR(qPCR)结果显示,CcIL-17Bs在鲤受精卵发育早期(0~12 h)和成鱼性腺中高表达。使用大肠杆菌表达系统,获得了可溶的重组蛋白NusA-17B。肛灌不同浓度的NusA-17B,结果显示,高浓度(500μg/kg)组的1和3 d的鲤肠道组织肠绒毛缺损,出现大量的杯状细胞和炎性细胞,定量分析显示,炎症因子基因IL-1β、IFN-γ、IL-6、趋化因子CCL20和NF-κB的表达均显著上调;7 d时肠道组织结构和炎症相关基因的表达均得到恢复,与对照组无显著差异。低浓度(5μg/kg)和中浓度(50μg/kg)肛灌实验,除了中浓度1和3 d鲤肠道TRAF6的表达显著上调,其余被检测基因的表达均与对照组无显著差异。使用不同浓度(0.1、1.0、10.0和100.0 ng/mL)NusA-17B孵育鲤肾组织8 h,结果显示,IL-1β在0.1、1.0和100.0 ng/mL的NusA-17B刺激下显著上调,IFN-γ和NF-κB分别只在10.0和0.1 ng/mL的NusA-17B刺激下显著上调,IL-6及趋化因子CCL20能够在10.0和100.0 ng/mL的NusA-17B刺激下显著表达,TRAF6则在0.1、1.0和10.0 ng/mL的NusA-17B刺激下显著表达。体内和体外实验结果表明CcIL-17B参与了炎症反应。

鲤脂蛋白脂肪酶基因特性、表达分布、重组蛋白获得及酶活性比较

为研究鲤脂蛋白脂肪酶(CcLPLs)的基因特征、时空表达分布及酶活性,实验利用基因组同源搜索获取鲤CcLPLs同源基因并分析其序列特征;通过荧光定量PCR(qPCR)方法对CcLPLs在不同组织的表达进行分析;采用原核表达系统获取CcLPLs重组蛋白,并使用对硝基苯酚法测定各重组蛋白的酶活性。结果显示,鲤基因组中挖掘到5个CcLPLs基因(CcLPLA1a、CcLPLA1b、CcLPLA2a、CcLPLA2b*和CcLPLBa),经验证,CcLPLA2b*是假基因,共线性分析显示,鱼类特有基因组加倍过程中出现基因丢失的现象,而鲤特有的基因组加倍致使鲤存在5个CcLPLs。CcLPLA1a和CcLPLA1b核苷酸序列和氨基酸序列相同,同源性分析显示,CcLPLBa与CcLPLA1s的同源性为64%,与CcLPLA2a同源性为50.8%。qPCR结果显示,CcLPLs的表达量在肝脏、心脏、脂肪、肌肉、脑、肠道和脾脏中依次降低,在各个组织中,各基因表达量从高到底依次为CcLPLA1s、CcLPLA2a和CcLPLBa。鲤正常投喂、饥饿及再投喂状态下CcLPLA1s和CcLPLA2a在肝脏、肌肉和脂肪组织中的表达结果显示,饥饿状态下,CcLPLA1s和CcLPLA2a在肝脏中的表达量高于正常投喂组,而在肌肉和脂肪中低于正常投喂组;再投喂后,CcLPLA1s和CcLPLA2a在肝脏中表达水平降至正常投喂组,而在肌肉和脂肪中表现为先升高后降低的趋势。通过构建具有促溶效果的原核表达载体,分别获得了原核表达重组蛋白Skp-CcLPLs和SlyDCcLPLs,酶活性测定结果显示,重组蛋白其脂蛋白脂肪酶活性从高到低依次为CcLPLA1a、CcLPLBa和CcLPLA2a,最适pH均为8.0,发挥最大活性的NaCl浓度为0.6 mol/L。本研究探讨了鲤CcLPLs同源基因在进化中的表现,对CcLPLA1s、CcLPLA2a和CcLPLBa的时空表达进行了分析,测定了投喂和饥饿对CcLPLA1s、CcLPLA2a表达的影响,揭示鲤饥饿胁迫下脂质代谢及响应对策,为控制鲤脂肪含量提供靶点,成功进行重组蛋白的原核表达并测定了其酶活性,为鱼类脂蛋白脂肪酶研究提供参考。

基于地标点法的不同黄河鲤群体形态鉴别

为了解黄河鲤谱系进化过程中不同群体形态差异,利用地标点法对20世纪70年代标本黄河鲤和现有山东、河南黄河鲤群体形态进行比较。选取19个地标点,通过最小平方和法进行回归分析,回归系数为0.998,证明地标点选取有效。通过地标点的重叠效果以及对平均形进行矢量化、网格化处理,形态差异主要体现在背鳍基部和腹鳍。相对扭曲主成分分析在不同黄河鲤群体中共提取34个主成分,通过第1、2主成分绘制散点图,标本黄河鲤群体与其他2个群体无重叠且较集中,河南和山东黄河鲤群体重叠且分散。聚类分析表明,河南、山东群体聚为一支,标本黄河鲤为单独一支。前5个主成分累积贡献率为93.03%,解释了主要形态变异,对前5个相对扭曲主成分得分建立Bayes判别函数,结果显示100%的标本黄河鲤能准确识别。背鳍基部和腹鳍2个位置靠近鱼类传统测量中体高特征值,标本黄河鲤与河南、山东黄河鲤形态差异极显著。综上,标本黄河鲤与河南、山东黄河鲤形态差异较大,主要体现在体高/体长比,而河南和山东黄河鲤形态无明显差异,为探究不同群体黄河鲤谱系在种质利用过程中分化和遗传渐渗时间奠定了基础。

吉富罗非鱼MSTN基因结构及其多态性与生长性状的相关性

通过PCR和基因组步移法,从吉富罗非鱼DNA中扩增出肌细胞生长抑制素(MSTN)基因及其5′调控区。该序列全长2413bp,含有3个外显子,2个内含子。5′调控区462bp,外显子Ⅰ379bp,外显子Ⅱ371bp,部分外显子Ⅲ145bp,内含子Ⅰ305bp,内含子Ⅱ751bp,编码区共编码298个氨基酸。5′调控区含有与肌肉特异性基因转录密切相关的转录调控元件E-box以及其他一些转录调控元件,如TATAbox,OCT1,AP1,AP4。通过随机测序法寻找SNPs(Signal nucleotide poly morphisms),获得了3个SNPs,但在群体筛选中,只有内含子Ⅱ内的1个SNPs表现多态性。同时测量了96尾(45♂,51♀)吉富罗非鱼的体质量、体长、体高、体厚,并将这些数据与MSTN基因的SNPs多态性进行相关性分析,研究发现MSTN基因内含子Ⅱ的728nt处G/T多态与吉富罗非鱼体型(体厚/体长、体高/体长)存在显著相关(P<0.05)。这些研究结果表明,MSTN基因的SNPs可作为吉富罗非鱼育种的候选分子标记。

奥利亚罗非鱼与鳜杂交的受精细胞学及胚胎发育研究

通过对奥利亚罗非鱼(♀)和鳜(♂)杂交的受精细胞学观察发现:异源精子入卵后产生星光,并核化成雄性原核,与雌原核互相靠近,接触最终完全融合为一个合子核,合子核继续分裂。分析比较了奥利亚罗非鱼,鳜以及奥鳜杂种胚胎发育情况,发现杂种胚胎的发育速度在囊胚早期与母本奥利亚罗非鱼基本一致,到囊胚后期速度有所减慢,但与鳜胚胎发育速度相差很大。这表明奥利亚罗非鱼和鳜虽属不同科间的远缘杂交,但有正常的受精细胞学程序和常规的细胞分裂(卵裂)方式。

翘嘴红鲌肝脏G6Pase催化亚基的克隆以及摄食和饲料中碳水化合物对其表达的影响

本文采用RT—PCR和RACE法分离、克隆了翘嘴红鲌G6Pase催化亚基基因全长cDNA，共1900bp[不含poly（A）]，包括49bp5’非翻译区，1068bp阅读框以及含Poly（A）信号AATAAA的778bp3’非翻译区[不包括Poly（A）]。阅读框共编码355个氨基酸，分子量为39．89ku。序列比对分析表明翘嘴红鲌G6Pase与斑马鱼G6Pase的相似性高达95％，与鼠、狗、人G6Pase的相似性为63％，和光滑爪蟾、金头鲷、河豚等G6Pase的相似性分别为69％、55％、76％，并具有G6Pase特有的3个保守基序。为了研究摄食以及饲料中碳水化合物对G6Pase的影响，使用实时定量RT—PCR分别测定了饲喂等能但不含碳水化合物和含23．98％碳水化合物的饲料的翘嘴红鲌肝脏G6Pase基因的表达水平，在使用上述饲料饲喂8周后，禁食48h，然后测定禁食和摄食后3、6、12、24hG6Pase mRNA的表达量，结果显示摄食后12h，两组G6Pase的表达明显增加，说明摄食影响G6Pase基因的表达，禁食和摄食后3～12h，含糖组G6Pase基因的表达量为无糖组的2～4倍，这表明碳水化合物可以诱导G6Pase mRNA的表达。

奥利亚罗非鱼卵巢芳香化酶基因的克隆及其表达

采用RT-PCR和快速扩增cDNA末端（RapidamplificationofcDNAends，RACE）法分离出奥利亚罗非鱼（Oreochromisaureus）卵巢芳香化酶（P450aromA）的全序列，得到1784bp的全长cDNA，包括38bp5’非翻译区，1566bp阅读框以及含Poly（A）信号（AATAAA）的167bp3’非翻译区[不包括Poly（A）]。阅读框共编码521个氨基酸，推算的蛋白质分子量为59kD。同源性分析显示，奥利亚罗非鱼P450aromA的氨基酸序列与其他鱼类性腺芳香化酶（P450arom）具有70％以上的同源性，与其他鱼类脑P450arom有60％左右同源性，但其芳香化酶高保守区包括I．螺旋区、芳香化酶特异保守区和血红素结合区分别与其他鱼类P450arom的同源性高达83％--96％、78％～86％和85％-100％。系统发育分析表明，奥利亚罗非鱼P450aromA属于鱼类性腺P450arom，分子系统进化树分析结果与根据传统的形态学和生化特征分类结果基本一致。生物信息学分析显示，奥利亚罗非鱼P450aromA基因编码的蛋白无信号肽，无跨膜区域，为非分泌型蛋白。同时还含有多个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N．糖基激化位点、N．肉豆蔻酰化位点及蛋白激酶C磷酸化位点。使用Taqman探针法检测P450aromA在奥利亚罗非鱼成鱼各种组织中的表达。结果发现，P450aromA只在卵巢中表达。同时比较了鱼苗、鱼种和成鱼卵巢中P450aromA的表达差异，结果显示，鱼苗中无P450aromA的表达，成鱼中P450aromA的表达量是鱼种阶段的30倍。

奥利亚罗非鱼AMH基因结构及其表达

抗缪勒氏管激素（antiMullerian hormone, AMH），也称缪勒氏管抑制物质（mullerian inhibiting substance, MIS），为肽类生长因子，属于TGFβ生长和分化因子家族。应用RTPCR和RACE法，从奥利亚罗非鱼精巢组织中分离出AMH的cDNA。分离到3′UTR长为621 bp和168 bp的两条cDNA，除了长度不一，两者之间只存在两个碱基的差别。5′UTR为 27 bp，阅读框为1 545 bp，翻译成514个氨基酸，其中，AMH-N域237个氨基酸，TGFβ域93个氨基酸。同源性分析显示，AMH保守性偏低，奥利亚罗非鱼与其它鱼类的相似性为32%~60%，与哺乳类动物只有19%~21%，而TGF-β域的保守性相对较高，与其它鱼类的相似性为54%~72%。基因结构分析显示，奥利亚罗非鱼AMH存在6个内含子，和斑马鱼AMH结构相似，和人、鼠AMH有较大差别，它们缺少奥利亚罗非鱼和斑马鱼AMH基因共有的内含子Ⅰ和Ⅵ。然而，启动子转录因子分析结果表明，奥利亚罗非鱼AMH启动子中也存在SRY, SF-1, GATA-4, Sox5, Sox9等结合位点。使用Taqman探针分析奥利亚罗非鱼AMH在成鱼不同组织中的表达以及鱼苗、鱼种、成鱼性腺中的表达量，结果显示AMH在成鱼的卵巢、精巢中均有表达，而在脑、肝、肌肉以及心脏中不表达。AMH在鱼苗性腺中不表达，在鱼种、成鱼中雄鱼AMH表达量显著高于雌鱼，而鱼种雄鱼AMH表达量是成鱼雄鱼的10倍。

实时荧光定量PCR技术及其在水产上的应用

实时荧光定量PCR技术是在PCR技术基础上结合荧光染料发展起来的一种核酸定量技术,能快速、灵敏,并有效地对核酸进行定量检测,已被广泛应用于生命科学的各领域。笔者就实时荧光定量PCR的检测原理、荧光染料,管家基因及其在水产上的应用作一阐述。

建鲤内参基因EF-1α的实时荧光定量PCR方法的建立

真核生物延伸因子基因(EF-1α)在蛋白质翻译过程中起着重要的作用,其序列具有高度的保守性,常作为内参基因应用于real time PCR中。通过RT-PCR克隆出建鲤(Cyprinus carpio var.jian)EF-1α的部分cDNA序列,其长度为425 bp,翻译成140个氨基酸,Blast结果显示与其它鱼类leptin的相似性为98%。同时也克隆出建鲤EF-1α相应的DNA序列,共506 bp。cDNA和DNA的序列比对显示克隆出的建鲤EF-1α含有1个相位为0的内含子,在此基础上设计一对跨越内含子的引物,采用SYBR GreenⅠ染料建立了real time PCR方法。以肝脏cDNA为标准品,建立了标准曲线,并进行了融解曲线分析。结果表明,所建立的方法具有特异性强、相关系数高、线性范围广等优点,可应用于建鲤的功能基因表达研究。

荧光定量PCR数据处理方法的探讨

realtime RT-PCR通过直接检测指数扩增期的PCR产物来确定基因的初始模板量,是定量基因表达最灵敏的方法,其准确性取决于扩增效率以及数据的处理方法。目前最常用的两种分析荧光定量PCR实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量方法是通过标准曲线计算起始模板的拷贝数;相对定量方法则是比较处理过的样品和未处理过的样品目的基因之间的表达差异。而相对定量又有双标准曲线法,2-△△Ct法以及动力学法。该文介绍了这些方法的推导、假设及其应用。

吉富罗非鱼GH基因的分离及其SNPs与增重的相关性

采用同源克隆法从吉富罗非鱼血液DNA中分离出GH基因。GH含有5个内含子,阅读框长615 bp,编码204个氨基酸。通过随机测序法,在GH的外显子6处找到1个SNPs位点(A/G)。通过PCR–RFLP检测吉富罗非鱼群体内GH的SNPs,同时将其增重性状与SNPs进行相关分析,结果显示,在雌鱼中,GG型和GA型个体增重高于AA型个体,但差异不显著;在雄鱼中,AA型个体增重显著高于GG型个体(P<0.05)。

黄颡鱼LRH-1基因的分离和表达

肝受体类似物(Liver receptor homolog-1,LRH-1)是核受体家族Ftz-F1中一个亚家族成员,由于其在哺乳类卵巢中的高表达而被认为在卵巢类固醇合成的调控中起着一定的作用。本研究使用RT-PCR、RACE法分离到了黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)肝受体类似物基因(LRH-1)以及一个无活性的LRH-1′cDNA。LRH-1cDNA全长1945bp,包括5′非翻译区207bp,3′非翻译区238bp,开放阅读框1500bp,编码500个氨基酸,推算的蛋白分子量为57.19kD。LRH-1′全长1663bp,5′非翻译区283bp,3′非翻译区330bp,开放阅读框1050bp,编码350个氨基酸,推算的蛋白分子量为39.7kD。与LRH-1相比,LRH-1′缺少存在于基因5′端的锌指结构和3′端起转录激活作用的AF-2基序。不同动物LRH-1氨基酸序列比对结果表明,黄颡鱼LRH-1和其他动物的LRH-1相似性为79%-85%,和其他动物的类固醇生成因子(SF-1)相似性为59%-66%。系统发育树显示,Ftz-F1分为两大支,一支包括鱼类SF-1;另一支又有2个分支,分别包含其他动物的SF-1和所有动物的LRH-1,在LRH-1分支中鱼类LRH-1单独为一小支。以β-actin为内标的荧光实时定量RT-PCR结果显示,LRH-1在雌、雄黄颡鱼脑、肝、肾、性腺均有表达,以肝脏的表达量为最高,雌鱼各组织的表达量均比雄鱼高,其中肝脏和性腺差异明显(P<0.05);在卵巢的不同发育阶段,该基因的表达量也不尽相同,Ⅲ期卵巢表达量最高,明显高于Ⅴ期(P<0.05),Ⅴ期又明显高于Ⅱ、Ⅳ和Ⅵ期(P<0.05);注射催产素促黄体释放激素类似物(LRH-A)12h后,LRH-1在脑的表达量没明显变化,在肝脏和肾脏的表达量明显增加,而在卵巢的表达量明显下降。

建鲤内参基因β-actin的实时荧光定量PCR方法的建立

β-actin在真核细胞的生理过程中起着重要的作用,其表达范围广、表达量恒定,常作为内参基因应用于real time PCR中。本文通过RT-PCR克隆出建鲤(Cyprinus carpio var.jian)β-actin的部分cDNA序列,其长度为424 bp,翻译成138个氨基酸,计算的蛋白质分子量为15.4 ku。氨基酸同源性分析显示,建鲤β-actin与斑马鱼(Danio rerio)相似性最高,为99.3%。与其他鱼的相似性也较高,为97.8%～98.6%。同时也克隆出了建鲤β-actin相应的DNA序列,其长度为590 bp。cDNA和DNA的序列比对显示克隆出的建鲤β-actin含有2个内含子,设计一对跨越内含子的引物,采用SYBR GreenⅠ染料建立了real time PCR方法。以肝脏cDNA为标准品,建立了标准曲线,并进行了溶解曲线分析。结果表明,所建立的方法具有特异性强、相关系数高、线性范围广等优点,可应用于建鲤的功能基因表达研究。

奥利亚罗非鱼DMO cDNA的分离和克隆

采用RTPCR和RACE法分离和测定了奥利亚罗非鱼DMOcDNA的全序列。得到1571bp[不含poly(A)]的全长cDNA,包括148bp5’非翻译区,1230bp阅读框以及含Poly(A)信号AATAAA的193bp3’非翻译区[不包括Poly(A)]。阅读框共编码409氨基酸,与尼罗罗非鱼DMO编码的氨基酸序列进行比较,同源性为96.3%,表明DMO在同一物种中差别较小。而与尼罗罗非鱼,红鳍东方豚,虹鳟,青鱼将,鼠,人等动物的DMRT1编码的氨基酸序列进行比较,同源性分别为:25.7%,25.8%,24.3%,29.7%,22.5%,22.0%,这说明DMO和DMRT1可能是两个不同的基因。