缺氧诱导因子-1与肿瘤

缺氧诱导因子 1(hypoxiainduciblefactor 1,HIF 1)是调控细胞氧平衡和诱导缺氧反应基因表达的重要的DNA结合蛋白 ,与肿瘤的发生、发展密切相关。HIF 1受多种抑癌基因、癌基因、生长因子的调节 ,参与对肿瘤生理过程的调控。了解HIF 1的作用机制 ,人工调控肿瘤组织内的HIF 1水平有助于对肿瘤的治疗。

重组华根霉脂肪酶的酶学性质及其对面团热机械学和烘焙特性的影响

对一种新型重组华根霉脂肪酶(Rhizopus chinensis lipase,RCL)的酶学性质进行研究,并利用酶流变分析仪、质构分析仪研究该酶对面团热机械学特性及烘焙特性的影响。结果表明:该酶的最适反应条件为40℃、pH8.5;其在40℃内、pH3～9范围内稳定性较好,冻干粉酶比活力约为17640U/g。通过与另一种商业脂肪酶(AY"AMANO")的对比研究发现,重组华根霉脂肪酶不仅显著影响面团的热机械学特性,而且能够增加面包的比容和弹性,降低面包的硬度、黏聚性和咀嚼性。

GABA_A受体的神经药理学研究进展

配体闸门离子通道超家族成员之一的GABAA 受体 ,是一种介导抗焦虑药物、镇静药物、抗惊厥药物、肌肉驰缓药物和失忆活动的多功能药物作用靶标。本文综述了近年来国外有关GABAA

BMMYA'平板-Fast blue RR顶层琼脂法高效筛选高酶活脂肪酶

摘建立了一种高效筛选高酶活或高产脂肪酶菌株的平板方法。该方法以华根霉(Rhizopus chinensis CCTCCM201021)脂肪酶基因proRCL在毕赤酵母中构建的基因突变文库为筛选对象,利用BMMYA'平板-FastblueRR顶层琼脂法对其中高酶活或高产的脂肪酶突变株进行筛选,将待筛菌株接种至含有2%甲醇的BMMYA'平板上,30℃生长并诱导4～5 d后,平板经脂肪酶致死温度65℃处理1 h,冰浴、室温平衡后,向平板中倾入Fast blue RR顶层琼脂。2 min内周围显示出明显的黑褐色的菌株为高酶活或高产突变株。该方法简便,快速,高效而且准确,筛选阳性率可达到90%。

BRCA1和BRCA2与DNA损伤修复及转录调控

乳腺癌和卵巢癌敏感基因BRCA1和BRCA2与同源重组、DNA损伤修复、胚胎生长、转录调控及遍在蛋白化有关。其中,BRCA1和BRCA2在DNA损伤修复和转录调控中功能的确定,将有助于探讨和阐明两者的肿瘤抑制功能及其机理。作者将综述近年来有关BRCA1和BRCA2在DNA损伤修复和转录调控中功能研究的最新进展。

KH560修饰的溶胶–凝胶法二氧化硅载体用于脂肪酶的固定化

以F127为模板剂,采用溶胶–凝胶法制备了环氧硅烷改性剂KH560修饰的二氧化硅(F-560-S),通过TG、FTIR、SEM和N_2吸附–脱附等方法对样品表面性质和结构进行了表征。结果表明,F-560-S表面富含环氧基,且具有较大孔径和比表面积。以F-560-S为载体通过共价结合法固定南极假丝酵母脂肪酶B(CALB),结果表明环氧基和载体形貌共同影响固定化酶固载量和酶学性质。F-560-S对CALB的固载量达到375 mg/g support,为普通Si O_2(U-S)的37.5倍;F-560-S固定的CALB在多种有机溶剂中催化1-苯乙醇与醋酸乙烯酯的反应时,催化转化率普遍高于U-S固定的CALB,热稳定性和操作稳定性均有明显改善,重复使用7次后F-560-S固定的CALB酶活力仍为初始活力的88.3%。

生物法转化分离耦合制备γ-癸内酯

研究通过添加树脂AB-8吸附转化产物以降低高浓度产物对Yarrowia lypolitica细胞的毒性,进而提高产量。确定了蓖麻油添加量25 g/L、树脂量7.5%、pH值7.5的最佳优化工艺,产物的最大比生成速率提高36%且达到最大值后降低较慢,有利于产物积累,56 h后总产量达到2.17 g/L,耦合工艺在提高产量的同时又能较好地实现产物的分离。

毕赤酵母分泌表达华根霉脂肪酶(r27RCLC)的糖基化鉴定

研究了毕赤酵母GS115中能够高效分泌表达的华根霉脂肪酶(r27RCLC)的糖基化情况。运用糖基化抑制剂衣霉素处理表达目的蛋白的毕赤酵母细胞,通过SDS-PAGE比较分析经衣霉素处理后的脂肪酶r27RCLC分泌表达量的变化,结果显示酶的分泌表达受到很大的抑制,说明脂肪酶r27RCLC在表达时候很可能发生了糖基化,且糖基化对其有重要影响。通过生物化学方法,利用内切糖苷酶PNGase F和Endo Hf酶切处理脂肪酶r27RCLC,SDS-PAGE和Western Blot,结果显示r27RCLC未发生糖基化。将样品r27RCLC通过胰蛋白酶酶解等步骤处理,进行MADLI-TOF-MS质谱分析,结果发现MADLI-TOF-MS鉴定结果与内切糖苷酶酶切处理结果一致,进一步证明毕赤酵母分泌表达的华根霉脂肪酶r27RCLC未发生糖基化。

华根霉(Rhizopus chinensis)前导肽脂肪酶基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达

通过3次PCR程序克隆得到了华根霉(Rhizopus chinensis CCTCCM201021)脂肪酶全基因序列,该基因的开放阅读框长1170bp,不含内含子,编码一个389个氨基酸残基的蛋白质,包括26个氨基酸的信号肽,94个氨基酸的前导序列和269个氨基酸的成熟肽,其推断的氨基酸序列与一些已报道的根霉脂肪酶序列同源性为86%。在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中分泌表达前导肽序列。SDS-PAGE分析表明表达蛋白的分子量约37kD。N-端氨基酸序列分析表明该重组蛋白分泌过程中前导序列N-端的67个氨基酸被切割掉,表达的重组脂肪酶由前导序列C-端的27个氨基酸和成熟肽的269个氨基酸组成。发酵132h后上清中重组脂肪酶的表达量最高,蛋白含量约5.4mg/mL,橄榄油乳化法测水解酶活为161U/mL,其比活比野生型华根霉脂肪酶高约43倍。

非水相中微生物脂肪酶催化转酯化拆分(R,S)-α-苯乙醇

研究了非水有机溶剂体系中脂肪酶不对称转酯化拆分(R,S)-α-苯乙醇反应,比较了15种不同微生物来源的脂肪酶,从中优选出催化活性及对映选择性较高的脂肪酶LipasePS,系统考察了影响该酶催化不对称转酯化反应的关键因素,获得了优化的催化拆分工艺条件.结果表明,脂肪酶LipasePS在非水反应体系中,以正己烷为反应介质,初始水活度为0.75,底物苯乙醇和乙酸乙烯酯浓度分别为0.3和0.6mol/L,加酶量5mg/ml,35°C,200r/min,反应14h后,底物(R,S)-α-苯乙醇的转化率达44.7%,产物(R)-乙酸苯乙酯的光学纯度达98.6%.水活度可影响酶对底物的转化率和对映选择性.

微生物β-D-葡萄糖苷酶对玫瑰香(Muscat)葡萄结合态香气物质的影响

β-D-葡萄糖苷酶是风味修饰中的关键酶,对葡萄酒香气的提升具有十分重要的作用。利用筛选的产β-D-葡萄糖苷酶的黑曲霉、海藻曲霉、鲁氏毛霉,结合固相微萃取、气质联用等技术,对β-D-葡萄糖苷酶促进玫瑰香葡萄结合态香气的释放进行了研究。研究结果表明,不同微生物来源的β-D-葡萄糖苷酶对糖苷类香气物质的水解能力不同,产物也存在显著差异,黑曲霉作用产生的香气物质含量远高于其他两种菌株,其中萜烯类香气物质最为丰富,占总香气含量的85.91%。因此,来源于黑曲霉的β-D-葡萄糖苷酶对糖苷类风味物质的作用最显著,可以改善葡萄酒的风味。

NH_4^+离子对重组毕赤酵母产华根霉脂肪酶发酵过程的影响

利用重组毕赤酵母在7 L的发酵罐中进行分批补料高密度发酵,考察不同NH4+质量浓度对毕赤酵母基因工程菌表达华根霉脂肪酶的影响。结果表明,补加(NH4)2SO4溶液维持NH4+质量浓度在7 g/L时华根霉脂肪酶酶活最高,分别是不补加(NH4)2SO4溶液、补加并维持NH4+质量浓度在5 g/L、10 g/L条件下的1.41、1.11、1.08倍,而且在该氮源质量浓度条件下,胞外总蛋白质质量浓度最高,达到5.61 g/L。通过分析不同氮源条件下发酵参数比生长速率、产物比形成速率和底物比消耗速率的差异,发现发酵维持NH4+质量浓度在7 g/L时,产物比形成速率和底物比消耗速率均较高,这与该条件下产酶水平最高相一致。研究结果表明,对毕赤酵母基因工程菌发酵过程中的氮源进行优化,能够明显促进外源蛋白质的表达。

诱导温度调控华根霉(Rhizopus chinensis)前导肽脂肪酶的表达及稳定性研究

比较了7 L发酵罐中不同诱导温度对华根霉前导肽脂肪酶在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达水平和稳定性的影响。通过实验表明在28℃条件下,最大酶活可以达到1412.5 U/mL,是30℃条件下的2.3倍,25℃条件下的1.3倍;而其产率可以达到12811 U/L·h^(-1),比产率达到82.6 U/g_(DCW)·h^(-1)。同时,在实验过程中发现诱导温度对目的蛋白的降解和聚合有重要的影响。通过对蛋白酶活性的测定和还原SDS-PAGE证实随着诱导温度的提高,蛋白酶活性急剧上升,从而导致由前导肽(37 kD)降解为成熟肽(30 kD)的降解作用的加剧。此现象在30℃条件下最为明显,在诱导84 h时前导肽已经全部降解为成熟肽。另外,通过非还原SDS-PAGE和分析表明随着诱导温度的提高也导致了二聚体的含量也逐渐增加。

l-薄荷醇的合成研究进展

介绍了l-薄荷醇的性质、应用与最近几年国内市场对l-薄荷醇的需求情况。着重阐述了4条l-薄荷醇合成路线及其研究进展。4条路线分别是:经由香茅醛、经由l-薄荷酮、经胡薄荷酮和经百里酚合成l-薄荷醇,香茅醛、l-薄荷酮、胡薄荷酮和百里酚在路线中可作为起始原料或中间产物。其中,以月桂烯经香茅醛合成l-薄荷醇以及由百里酚直接合成l-薄荷醇的路线,目前已实现工业化生产。l-薄荷醇的合成大多需要以天然产物为原料,价格较高。而以百里酚等石化产品为原料的合成路线虽较短,但得到的异构体较多,l-薄荷醇的收率相对较低。松节油作为可再资源,来源广泛,价廉易得,以其为原料的合成路线将具有的潜在的应用价值。

洋葱伯克霍尔德氏菌HMW DNA的制备及酶切研究

高质量粘粒基因组文库构建的关键是HMW DNA的长度至少为粘粒载体容量的10倍，通常粘粒载体的容量为30-50kb，因此提取的HMW DNA应不小于500kb。HMW DNA在制备时不能受到任何物理的剪切力，以免DNA断裂和损伤。利用琼脂糖凝胶包埋制备的DNA胶块经裂解和纯化后发现其DNA长度远大于500kb，明显优于商品化试剂盒提取和酚抽提法。用BamH Ⅰ、Sau3A Ⅰ、Xba Ⅰ和HindⅢ对DNA胶块进行不完全酶切研究表明，构建文库常用的Sau3A Ⅰ并不适合胶块内酶切反应，而BamHⅠ酶切B．cepacia HMW—DNA效果较好，产生的DNA片段集中在20-50kb之间，完全适合粘粒基因组文库的构建，为B．cepacia大插入片段基因组文库的构建以及功能基因组的研究奠定了良好的理论基础。

农杆菌介导转化黑曲霉条件优化及脂肪酶表达

优化了农杆菌介导转化黑曲霉的方法,优化条件包括共培养材料、农杆菌种类、诱导剂浓度、共培养时间、共培养温度以及共培养时农杆菌的菌体浓度。结果表明,农杆菌介导转化黑曲霉的最适条件为107个/mL不萌发的新鲜孢子与OD600培养至0.9~1.0的农杆菌以1∶1的比例混合后,在乙酰丁香酮浓度为200μmol/L的IM平板上,23℃避光培养48 h后进行转膜,转化子个数可达到(60±5)个转化子/106个孢子,且阳性率达到90%以上。并且构建了同源黑曲霉脂肪酶的组成型和诱导型启动子表达载体,通过优化后的农杆菌介导转化方法转化至黑曲霉中,利用罗丹明橄榄油平板对产酶转化子进行筛选鉴定,并获得了阳性克隆。

理性设计提高华根霉脂肪酶对不饱和长链脂肪酸的底物特异性及其在大豆油水解中的应用

为了提高华根霉脂肪酶在大豆油水解制备脂肪酸中的应用效果,通过理性设计的方法改造脂肪酶的脂肪酸特异性。对突变酶的酶学性质进行了研究,并通过单因素实验优化脂肪酶催化水解大豆油的反应条件。结果表明:利用定点突变技术获得了一系列脂肪酸特异性改变的脂肪酶,其中突变酶HQL增强了对不饱和长链脂肪酸的特异性,并且对p-NPP(C16)的水解活力相比野生型提高了2.72倍;所有突变酶的最适温度和最适p H均为40℃和8.0,与野生型脂肪酶一致;得到脂肪酶催化水解大豆油的最适反应条件为反应时间24 h、水油质量比1∶1、加酶量500 U/g(以油质量计)、p H 8.0、温度40℃,在最适反应条件下,野生型酶催化大豆油水解率仅为80%,而突变酶HQL由于增强了对长链不饱和脂肪酸的底物特异性,对大豆油水解率提高到98%。

β-1,3-葡聚糖酶在枯草芽孢杆菌中的表达与性质

藤黄节杆菌(Athrobacter luteu)β-1,3-葡聚糖酶(βglⅠ)能够特异性的作用于β-葡聚糖中的β-1,3-糖苷键,在酵母裂解活性上具有突出优势,但是βglⅠ在生产上存在表达低、生产成本高的问题。作者利用无缝克隆技术构建表达载体,实现了βglⅠ在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,并通过比较不同Tat类型和Sec类型信号肽、RBS、5′UTR等表达元件来提高βglⅠ的胞外产量。结果表明,信号肽SPLipA使得βglⅠ表达水平提高了0.4倍,在此信号肽基础上继续比较各RBS和5′UTR序列,其中cry3A 5′UTR使βglⅠ产量高出出发菌株1.2倍。此外,利用Ni2+亲和层析柱纯化βglⅠ并对其酶学性质进行研究,结果表明该酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为6.0,在0~45℃、pH 4.0~9.0的范围内稳定性较好,比活为973 U/mg。

树脂原位吸附促进高浓度底物不对称拆分dl-薄荷醇

以洋葱布克氏菌(Burkholderia cepacia)全细胞为催化剂,考察添加吸附树脂对酯酶酶法不对称拆分dl-薄荷醇的影响。通过对比6种弱极性的树脂吸附性能,选择出了对产物薄荷醇有较好吸附性能的树脂HZ-845,可以显著降低产物薄荷醇对不对称拆分反应的抑制作用,提高反应的底物初始浓度。在底物浓度提高6倍的条件下,在较短的时间内达到良好的转化率和产物光学纯度水平。在60g/L的底物初始浓度下,反应2h后添加树脂,反应24h,产物l-薄荷醇的产物e.e.值和反应转化率分别为98%和45%。

产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选鉴定及其离子束诱变

利用经过改良的初筛培养基,以p-NPG为底物作为筛子,从葡萄园土壤及葡萄表皮中筛选到一株产β-葡萄糖苷酶酶活较高的菌株,经18S rDNA鉴定为黑曲霉。通过离子束注入技术对该菌株进行诱变,获得了一株高产β-葡萄糖苷酶诱变菌株H68,与原菌株相比,酶活提高了53%。