鼻咽癌细胞中EB病毒编码的潜伏膜蛋白1活化cyclinD1的表达

为了探讨EB病毒编码的潜伏膜蛋白 1(EBV LMP1)促进细胞增殖 ,参与EBV相关疾病致瘤的分子机制 ,研究了LMP1在鼻咽癌细胞中调节cyclinD1表达 ,进而影响细胞周期行进及细胞恶性表型改变 ,并初步确定了LMP1发挥该功能的结构域 .利用已建株的Tet on LMP1 HNE2鼻咽癌细胞系 ,蛋白质印迹实验分析LMP1诱导cyclinD1蛋白质表达的表达动力学 ,包括时间效应及剂量效应 ;利用三种LMP1功能区缺失的突变体及野生型LMP1,以载体型细胞为对照 ,确定LMP1活化cyclinD1表达的结构域 .同时结合基因诱导表达及反义寡聚核酸技术阻断基因表达的实验方法 ,进一步确定LMP1上调的cyclinD1功能 ,即对细胞周期行进及细胞恶性表型的影响 .结果表明LMP1确实可以诱导cyclinD1的表达 (2～ 4倍 ) ,且诱导具有时间依赖性及剂量依赖性 ;利用三种LMP1功能区缺失的突变体及野生型LMP1,以载体型细胞为对照 ,结合报道基因分析法 ,确定与空白载体细胞系比较 ,野生型LMP1从转录水平可反式激活cyclinD1报道基因活性约 11 2倍 ,其中CTAR1及CTAR2均可活化cyclinD1表达 ,但以CTAR2为主 ,与野生型LMP1诱导cyclinD1反式激活活性比较 ,CTAR1缺失导致cyclinD1报道基因活性下降 2 3 6 % ,CTAR2缺失导致cyclinD1活性下降约 80 7% ,C端均缺失时cyclinD1活性只?

EB病毒LMP-1上调鼻咽癌细胞系AP-1的活性

为了探讨 EB病毒潜伏膜蛋白 1 ( LMP- 1 )通过信号传导途径介导的致瘤分子机制 ,由此首先构建了 AP- 1报告基因 ,用佛波酯诱导确定了其报道 AP- 1的功能 ;通过建立荧光素酶双报道系统 ,研究了 LMP- 1表达对 AP- 1和 NFκB活性的影响 .研究发现 :在 LMP- 1阴性鼻咽癌 ( NPC)细胞系 ,导入 LMP- 1表达质粒后 ,AP- 1和 NFκB的活性均升高 4～ 5倍 ;而在 LMP- 1阳性 NPC细胞系中 ,当导入 LMP- 1反义表达质粒 ,AP- 1和 NFκB的活性则受抑制 ,活性下调 3～ 4倍 .结果表明 ,LMP- 1能上调 NPC细胞系 AP- 1的活性 ,同时再次证实了 LMP- 1能活化 NFκB.

EB病毒潜伏膜蛋白1调控细胞凋亡的cDNA阵列分析

为探讨EB病毒潜伏膜蛋白 (LMP1)介导细胞凋亡和抑制细胞凋亡双重效应的机制 ,采用已建立的受四环素调控的LMP1表达的鼻咽癌细胞系 (pTet on LMP1HNE2 ) ,定量诱导 pTet on LMP1HNE2细胞LMP1动态表达 ,分别与含有细胞凋亡相关基因为主的AtlasapoptosiscDNAexpressionarray膜杂交 ,分析LMP1介导的表达差异基因。结果表明 :①LMP1介导细胞凋亡和抑制细胞凋亡的基因的表达 ,同时上调或下调某些与细胞凋亡相关基因的表达 ;②LMP1不仅介导细胞凋亡和抑制凋亡基因的表达 ,同时介导细胞分裂分化和增殖基因的表达 ,LMP1同时介导功能不同甚至功能相反的基因表达 ;③LMP1介导的基因表达与其表达持续时间和表达水平相关 ,不同表达水平和不同表达时间介导的基因表达谱不同。因此 ,LMP1具有介导细胞凋亡和抑制凋亡基因表达的双重生物学效应 ,同时介导细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡等多种生物学效应基因的表达 ,从而参与细胞的癌变。

鼻咽癌恶性转化基因Tx核苷酸序列分析

从人类鼻咽癌细胞系CNE2基因组DNA文库中克隆一个恶性转化基因Tx转染小鼠JB6 + 细胞 ,使细胞恶性转化 ,宿主细胞具有停泊非依赖生长的特性 .已经报道的Tx中一个 3 0kb片段(Tx3 0 )的序列分析结果表明 ,Tx包含人类免疫球蛋白κ轻链完整的J区 .进一步对Tx全长进行亚克隆和测序 ,并采用生物信息学方法进行分析表明 ,Tx包含人类Igκ完整的J区、C区基因片段、还有 5个重组信号序列 ,1个核基质结合序列和 1个N segment的插入 .Tx与正常人IgκJ、C区比较只是在某些位点存在碱基的缺失、插入或置换 ,二者同源性高达 98% ,其电子定位于 2p11 2 ,这与人Igκ的染色体定位是一致的 .可以认为 。

鼻咽癌恶性转化基因Tx中3.0kb片段序列分析

从中国人鼻咽癌细胞株 CNE2中克隆分离出的恶性转化基因 Tx,其基因长度为 1 6kb.在对其中 2 .8kb片段测序的基础上 ,对其中 Xho /Eco R 长度约 3.0 kb的片段 ( Tx3.0 )进一步进行了测序 ,并利用生物信息学技术分析认为 ,Tx3.0与人类免疫球蛋白 kappa( Igκ)轻链基因高度同源 ,并直接映射于 J区 .Tx3.0中除有编码免疫球蛋白 kappa链的 J2、J3、J4及 J5基因片段外 ,在各个片段间不仅有 TATA box、CAAT box和 Poly A等经典的调控序列 ,还有 NF- IL6的反应元件、某些转录因子的识别序列、以及核基质结合序列等 .据此以及 2 .8kb序列的分析结果 ,对 Tx3.0下游 1 .0 kb片段序列进行了预测 .对 Tx3.0基因片段的研究为进一步研究 Tx基因在鼻咽癌发病中的作用 ,提供了重要信息 .

毛细管凝胶电泳分离和检测低聚核苷酸和脱氧核糖核酸的合成产物

本文将毛细管凝胶电泳方法用于低聚核苷酸及DNA合成产物的分离检测，并探讨了低聚核苷酸的淌度与其碱基数的关系以及迁移时间和相对迁移时间的重现性。

EB病毒LMP1及其CTAR1、CTAR2导入人HNE2鼻咽癌细胞的研究

用电穿孔转染法 ,建立稳定表达野生型LMP1及其不同突变体的鼻咽癌细胞系 ,并以这些细胞系为材料 ,用MTT法检测增殖期活细胞 ,观察LMP1及其不同的结构域对鼻咽癌细胞生长的影响。结果得到了LMP1及其三种突变体、空白载体表达的鼻咽癌细胞系 :HNE2 -LMP1(野生型 )、HNE2 -LMP1△ 185 - 35 1(CTAR1缺失型 )、HNE2 -LMP1(1- 2 31) (CTAR2缺失型 )、HNE2 -LMP1(1- 185 ) (羧基端胞浆区缺失型 )、HNE2 -pSG5 (空载体型 )。进一步证实HNE2 -LMP1、HNE2 -LMP1(1- 2 31)、HNE2 -LMP1△ 185 - 35 1平均吸光度 (A )比值高于对照组HNE2 -pSG5及HNE2 (P <0 0 1)。这提示 :EB病毒LMP1及其LMP1(1- 2 31)和LMP1△ 185 - 35 1在体外明显促进HNE2细胞增殖。结果表明EB病毒LMP1可能在鼻咽癌中发挥着重要的作用。

EB病毒潜伏膜蛋白1诱导人鼻咽上皮细胞端粒酶的表达

上皮细胞逃避老化期是细胞永生化过程中一个重要分子事件,端粒酶活性表达是维持人染色体端粒长度、抑制细胞进入老化期的关键因素之一。我们利用最新的端粒酶PCR-ELISA半定量技术,检测永生化早期阶段人胚鼻咽上皮细胞中端粒酶表达的情况,探讨EB病毒在人胚鼻咽上皮细胞永生化过程中的分子机制。结果表明,EB病毒诱导老化前期人胚鼻咽上皮细胞端粒酶表达,从而促使人胚鼻咽上皮细胞逃避老化期、进入永生化早期阶段。此外,我们还首次发现,人胚鼻咽上皮细胞表达端粒酶活性依赖于EB病毒LMP1蛋白的表达水平和LMP1分子的完整性,LMP1可能通过诱导端粒酶活性表达促进人鼻咽上皮细胞永生化。我们的实验为进一步探讨EB病毒诱导人胚鼻咽上皮细胞永生化的作用机制提供了实验基础。

EB病毒LMP1 CTAR1、CTAR2的表达促使人鼻咽癌细胞HNE2增殖

探讨EB病毒LMP1不同结构域在鼻咽癌中的致瘤作用,为阐明鼻咽癌分子发病机理,寻找治疗鼻咽癌的分子靶提供实验依据。以转染空白载体为对照,利用电穿孔转染方法,建立稳定表达LMP1不同突变体的鼻咽癌细胞系HNE2-LMP1(1～815)、HNE2-LMP1(1～231)、HNE2-LMP1△187～351,并以这些细胞系为材料,用MTT法检测增殖期活细胞,BrdU掺入法检测细胞增殖状况,比较各组细胞的软琼脂集落形成率和裸鼠成瘤能力,以观察LMP1不同的结构域对鼻咽癌细胞生长的影响。LMP1(1～231)和LMP1△187～351在体外明显促进HNE2细胞增殖,HNE2-LMP1(1～231)、HNE2-LMP1△187～351平均吸光度(A)比值、BrdU掺入率、软琼脂集落形成率均高于HNE2-pSG5与HNE2(P<0 01),而HNE2-LMP1(1～187)与HNE2-pSG5、HNE2相比,这些指标无明显差别。HNE2-LMP1△187～351和HNE2-LMP1(1～231)的裸鼠成瘤潜伏期、倍增时间与平均瘤重明显高于HNE2-pSG5鼻咽癌细胞系,其差异有显著的统计学意义(P<0 05)。而HNE2-LMP1(1～187)、HNE2-pSG5和HNE2鼻咽癌细胞系在潜伏期、倍增时间与平均瘤重方面两两比较,差异无显著的统计学意义(P>0 05)。EB病毒LMP1CTAR1和CTAR2对HNE2细胞生长有明显促进作用,提示EB病毒LMP1可能在鼻咽癌的发生发展中起着重要的作用。

免疫球蛋白kappa轻链基因在鼻咽癌中表达的初步研究

目的：为了探讨Ｉｇκ是否参与了鼻咽癌的癌变过程及可能机制，对Ｉｇκ在鼻咽癌中的表达进行了研究，并初步探讨Ｉｇκ与ＥＢ病毒潜伏膜蛋白基因ＬＭＰ－１在鼻咽癌中的相关性。方法：分别运用原位杂交技术和免疫组化技术检测鼻咽癌活检组织中Ｉｇκ的ＲＮＡ和蛋白质水平的表达。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析两株鼻咽癌细胞系（ＣＮＥ１和ＣＮＥ－ＬＭＰ）ｋａｐｐａ蛋白的表达及强度差异。结果：原位杂交技术显示１００％（４２例／４２例）标本均有ｋａｐｐａ的表达：免疫组化和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹提示，ｋａｐｐａ蛋白表达在所有的鼻咽癌组织和鼻咽癌细胞系里，且表达的可能是游离型的ｋａｐｐａ轻链。在整合表达有ＬＭＰ的ＣＮＥ１－ＬＭＰ鼻咽癌细胞株，游离型ｋａｐｐａ的表达明显增强。结论：这些结果提示Ｉｇκ基因可能与鼻咽癌癌变过程相关。其致癌机制可能与它和ＥＢ病毒的ＬＭＰ有联系，这为阐明鼻咽癌癌变的分子机理提供了又一条有益的思路。

EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞系中通过NF-κB、AP-1促进MMP9表达

目的 探讨EB病毒 (Epstein BarrVirus,EBV)LMP1是否通过NF κB和AP 1促进MMP9表达 ,为全面阐明LMP1的分子致瘤机制提供实验依据。方法 将MMP9 CAT表达质粒导入HNE2 pSG5、HNE2 LMP1、HNE2 LMP1(1 185 )、HNE2 LMP1(1 2 31)、HNE2 LMP1Δ187 35 1鼻咽癌 (nasopharyngealcarcinoma ,NPC)细胞系 ,比较各组细胞系的氯霉素乙酰转移酶 (CAT)活性 ,以确定LMP1或其不同的结构域是否上调MMP9转录 ;采用明胶Zymography法检测上述细胞产生MMP9的活性 ,以确定LMP1或其不同的结构域是否促进MMP9蛋白表达 ;借助报道基因分析法确定在NPC中野生型LMP1能否激活NF κB和AP 1的活性 ,进一步将突变了NF κB或AP 1结合位点的MMP9 CAT表达质粒导入上述细胞系 ;比较相应的CAT活性 ,以确定LMP1或其不同的结构域是否通过NF κB或AP 1上调MMP9表达。结果 与导入载体pCDNA3比较 ,HNE2 LMP1、HNE2 LMP1(1 185 )、HNE2 LMP1(1 2 31)和HNE2 LMP1Δ187 35 1NPC细胞系CAT活性分别提高 7.2 ,1.3,3.3和 4.0倍。明胶Zymography法检测显示 ,在HNE2 LMP1、HNE2 LMP1(1 2 31)和HNE2 LMP1Δ187 35 1细胞系中 ,均可检测到 92 0 0 0MMP9活性 ,而HNE2 pSG5、HNE2 LMP1(1 2 31)几乎均为阴性。较之母细胞 ,野生型LMP1活化NF

EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞系中通过NF-κB、AP-1促进IL-8分泌

目的 探讨EB病毒LMP1分子致瘤机制 ,在已证实鼻咽癌细胞系中LMP1有效激活NF κB或AP 1的基础上 ,对LMP1是否通过NF κB或AP 1促进IL 8分泌进行探讨。方法 以稳定表达LMP1及其 3种突变体、空白载体的鼻咽癌细胞系 [HNE2 LMP1、HNE2 LMP1(1 185 )、HNE2 LMP1(1 2 31)、HNE2 LMP1△ 187 35 1和HNE2 pSG5 ]及antisense LMP1处理的HNE2 LMP1鼻咽癌细胞系为材料 ,将IL 8报道质粒瞬时导入这些细胞系中 ,通过测定luciferase值以反映LMP1是否促进IL 8转录 ;将mutAP 1 IL 8 luc或IκBα(S32A S36A)表达质粒导入HNE2 LMP1细胞系中 ,比较其IL 8报道活性 ,以确定LMP1是否通过AP 1或NF κB诱导IL 8转录 ;利用ELISA方法测定HNE2 LMP1、HNE2 pSG5、anti sense LMP1处理的HNE2 LMP1鼻咽癌细胞系中的IL 8浓度 ,进一步从蛋白水平上确定LMP1是否促进IL 8分泌。结果 与HNE2 pSG5相比 ,在HNE2 LMP1、HNE2 LMP1△ 187 35 1和HNE2 LMP1(1 2 31)细胞系中IL 8报道活性分别升高了原来水平的 11.5、8.6和 3.4倍 ,而HNE2 LMP1(1 185 )对IL 8报道活性不影响。在HNE2 LMP1细胞系中IL 8蛋白水平提高了 17.4倍 ,而antisense LMP1则使HNE2 LMP1细胞的IL 8报道活性及蛋白水平分别下降到原来水平的 18.3%和 9.2 % ;