镍离子亲和层析介质的制备及其用于组氨酸标记蛋白质的纯化

以交联琼脂糖微球为基质,通过环氧氯丙烷活化,偶联亚胺二乙酸并螯合N i2+,制备得到一种镍离子亲和层析介质。结果发现,在强碱条件下环氧活化率达到了38.0μmol/mL,最终N i2+配基密度达到了30.9μmol/mL,偶联效率为81.3%。利用得到的镍离子亲和介质对基因工程大肠杆菌表达的组氨酸标记3-羟基丁酮还原酶进行了一步层析纯化,酶活回收率达到了58.8%,纯化倍数为2.1,蛋白纯度在85%左右,纯化效果与常用商品介质基本相当。

国产弱阳离子琼脂糖交换介质的性能及其用于蛋清溶菌酶的分离纯化

从理化性能、离子交换容量、静态和动态吸附性能等方面对国产快流速CM-琼脂糖弱酸性阳离子交换介质进行了综合考察和评价,并应用该介质进行了鸡蛋清中溶菌酶的分离。结果发现,国产介质的理化性能符合要求,离子交换容量达到了187 mmol/mL,高于国外商品介质;对模型蛋白溶菌酶的静态和动态吸附容量分别达到了107.0 mg/mL和90.3 mg/mL(高流速下),同样略高于国外商品介质,显示能够满足蛋白质的有效吸附;离子交换层析分离蛋清溶菌酶较为成功,纯度在95%以上,产量达到了4.1 mg/mL鸡蛋清。

紫球藻的培养及其硫酸多糖的分离纯化

利用优化了的海水培养基和简易光生物反应器对紫球藻进行培养,建立了一套从培养液中直接分离纯化紫球藻多糖(PSP)的工艺,并对纯化后的PSP进行了初步分析。实验表明,本方法培养的紫球藻生物量达到了干重2.1g/L,分离后粗PSP产量为0.378g/L,离子交换得率约为78%。经气相色谱分析PSP主要由木糖、葡萄糖和半乳糖组成,质量比约为13.68:7.83:5.23。红外光谱显示该多糖具有一般多糖的特征吸收峰,其中六碳糖为吡喃型。PSP为硫酸酯化多糖,硫酸基团含量约为4%。

一株高效转化Phytosterol为雄甾烯酮菌株的筛选与鉴定

从保藏的200多株菌中筛选出1株高效转化植物甾醇为4-烯-雄甾-3,17-二酮和1,4-二烯-雄甾-3,17-二酮的菌株,并对该菌进行了形态、生理生化的研究。结果发现菌株ST06可以利用多种碳源,可以水解淀粉,但不利用纤微素。用16SrDNA的方法对其进行鉴定,发现与Bacillus属Bacillus amyloiquefaciens的相似性最高,达到99.9%,将该菌株命名为Bacillus amyloiquefaciens ST06。该菌在培养温度30℃,pH7.0,转速220r/min,转化时间7d,底物添加量为0.3%时,ADD与AD的总得率高达40%以上,此时底物转化率高达93.7%。

疏水性电荷诱导层析——原理、性能及其应用

介绍了疏水性电荷诱导层析(hydrophobic charge induction chromatography,HCIC)的原理及特点:其功能基团结合了疏水作用和静电相互作用,是一种混合型的双模式层析方法。由于HCIC在蛋白质(特别是抗体)的分离纯化中表现出操作简便、选择性较好等优点,受到了学术界和工业界的关注。对HCIC的技术原理、发展历程、层析行为以及应用现状等进行综述,以期对HCIC的深入研究和应用开发提供指导。

一株产灵菌红素粘质沙雷氏菌的筛选、鉴定及发酵条件

利用贫营养条件,从土壤样品中筛选到一株产红色素的菌株。经形态学、生理生化实验进行菌株初步鉴定,并经16S rDNA测序分析确定该菌株为粘质沙雷氏菌属,将其命名为:Serratiamarcescens JNB5-1。该菌株所产红色素经全波长扫描及LC-MS确定为灵菌红素。对Serratiamarcecens JNB5-1产灵菌红素做初步发酵研究,在蔗糖2 g/dL,牛肉膏1.5 g/dL,CaCl21 g/dL,脯氨酸0.75 g/dL,MgSO4.7H2O 0.02 g/dL,FeSO4.7H2O 0.006 g/dL的培养基中发酵72 h后,其发酵产量可达4.139 g/L。

高效转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸菌株的筛选、鉴定及初步优化

从发酵食品及自然界中筛选出能利用L-谷氨酸生产γ-氨基丁酸的菌株,并对转化条件进行初步优化。采用乳酸菌分离纯化的方法分离出乳酸菌,再通过初筛、复筛挑选出高产γ-氨基丁酸的菌株,并对其进行形态学、常规生理生化鉴定及16S rDNA基因分析,随后对菌株产γ-氨基丁酸的转化条件进行初步优化。根据常见细菌系统鉴定手册,所筛菌株初步确定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。优化后的最佳转化条件为:菌株菌龄为36 h、缓冲液初始pH为4.8、缓冲液浓度为0.2 mol/L。在优化后的转化条件下,添加5 g/dL底物转化24 h,转化率最高可达97.81%,转化液中γ-氨基丁酸的质量浓度达34.26 g/L,该菌种可作为γ-氨基丁酸产生菌,具有较好的γ-氨基丁酸生产潜力。

混合模式吸附层析从猪血浆中分离免疫球蛋白

混合模式吸附层析是一种新型的生物分离方法,通常结合了静电和疏水相互作用,具有非盐依赖的吸附特性,在高盐和低盐条件下,都可以高效吸附目标蛋白。本文将混合模式吸附用于从猪血浆中分离免疫球蛋白,首先比较了不同沉淀法从猪血浆中去除纤维蛋白原,确定了最佳硫酸铵沉淀条件;进一步考察了混合模式吸附剂对猪血免疫球蛋白的静态和动态吸附性能,确定了吸附和解吸条件;最后采用混合模式吸附层析,从硫酸铵沉淀的上清液中直接分离免疫球蛋白,得率为11.5 mg·ml^(-1)血浆,SDS-PAGE凝胶图像分析纯度达到77.4%,为猪血资源的综合利用提供了新方法。

改进葡聚糖接枝技术制备高性能层析介质

利用改进的葡聚糖接枝技术,在以环氧氯丙烷为交联剂交联琼脂糖微球骨架的过程中加入葡聚糖溶液,在交联的同时接枝葡聚糖制得葡聚糖接枝型琼脂糖微球Rigose-Dex,再与盐酸2-氯三乙胺(DEAE)反应,获得葡聚糖接枝型高载量弱阴离子交换介质Rigose-Dex DEAE。以牛血清白蛋白(BSA)为模型蛋白,以商品化介质DEAE Sepharose 6FF为对照,系统研究了该葡聚糖接枝型Rigose-Dex DEAE的蛋白吸附性能,并进行了物理性能研究。结果表明,改进后葡聚糖接枝技术的最高接枝量为24.5mg/mL。自制Rigose-Dex DEAE可耐受700cm/h的线性流速,对BSA的动态饱和载量为127.6mg/mL,为商品介质DEAE Sepharose 6FF载量的212%;具有在高流速下快速结合蛋白的能力,上样蛋白溶液在层析柱中停留2min即可基本达到饱和动态载量;重复使用性能好,经120次在线清洗后,Rigose-Dex DEAE介质的动态载量为原始载量的90.4%。

伯克霍尔德氏菌胞外酯酶催化己酸乙酯合成的研究

从变质的食用油中分离得到1株具有产己酸乙酯酯化酶能力的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)X10,并对其发酵条件和酯化条件进行了优化。结果表明,该菌株最佳发酵条件为:淀粉4%,酵母膏3%,橄榄油4%,发酵液初始p H值6.5,培养温度30℃,转速180 r/min。最佳酯化条件为:己酸添加量2%,酯化温度35℃,酯化液初始p H4.6,振荡方式为连续振荡。优化条件下酯化酶活力由1.79 U/m L提高到3.53 U/m L,较优化前增加了97.21%。

脂肪酶生产菌株的筛选及其发酵条件优化

为获得具有高产脂肪酶能力的菌株,以橄榄油为唯一碳源进行富集,再经过维多利亚蓝B平板初筛和两次摇瓶复筛,从自然界中筛选得到一株具有较高酶活的革兰氏阴性短杆菌G1。通过提取16S rDNA进行同源比对,确定该菌属于伯克霍尔德氏菌属。该菌经紫外和ARTP复合诱变得诱变株G1-7-4,酶活较原始菌株提高了51.87%。在单因素试验考察各因素对脂肪酶酶活的影响的基础上采用响应面法对影响酶活的重要因素进一步优化,得到最佳发酵条件：玉米油33.09 mL/L,酵母膏31.90 g/L,初始p H 6.67。该条件下酶活最高达到80.62 U/mL,为初始条件下的24.81倍。该脂肪酶的最适p H为8.0,在30-80℃范围内均具有较高酶活,最适反应温度为50℃。

从植物乳杆菌全细胞转化液中分离纯化γ-氨基丁酸的工艺研究

前期筛选获得1株高效转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸(GABA)的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GB01-21,该菌以浓度200 g/L的L-谷氨酸为底物,发酵20 h左右,能以99%的摩尔转化率生产γ-氨基丁酸,产物γ-氨基丁酸的终浓度可达140 g/L左右。从全细胞转化液中分离纯化γ-氨基丁酸,着重对脱色工艺进行了研究,考察了温度、时间、pH和活性炭添加量对脱色效果的影响。通过单因素实验的基础上的正交实验分析,确定了脱色最佳工艺条件为粉末活性炭(150～200目)用量为1.5%,脱色温度70℃,pH值4.0,脱色时间40 min,γ-氨基丁酸转化液的脱色率高达98.42%,γ-氨基丁酸的保留率可达97.23%。随后对γ-氨基丁酸转化液进行初步分离纯化,最终测得γ-氨基丁酸的回收率89.4%,纯度为96.7%。

灵芝菌丝体液态发酵中生物质组分定量的研究

灵芝全基因组的解析为灵芝代谢网络模型构建提供了分子生物学基础,为了获取灵芝代谢网络模型所必需的代谢与生物质组分详细数据,在200 L发酵罐条件下对灵芝进行液体发酵,并对发酵过程中多种物质进行检测。结果表明:发酵第6天,胞内多糖、胞外多糖及生物量达到最大值,分别为(2.57±0.08)g/L、(0.55±0.01)g/L和(8.45±0.23)g/L。同时确定了不同生物质组成的含量,其中总蛋白(34.02±2.34)%、粗纤维(8.33±0.10)%、总脂质(10.10±0.20)%、DNA(1.11±0.01)%、RNA(3.76±0.01)%、灰分(9.35±0.10)%。通过HPLC和GC-MS完成了氨基酸和脂肪酸绝对定量。在已有的数据基础上,结合灵芝基因组计算预测出Gln、Asn及8种核苷酸含量,为后续的基于生物信息学的灵芝全局代谢网络模型的构建、完善与分析以及以此为基础的灵芝生物活性物质代谢调控的新策略等基础研究提供有利的数据支撑。

大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh的克隆、高效表达及酶学性质

以大肠杆菌基因组DNA为模板,扩增得到苹果酸脱氢酶（mdh）编码基因mdh,构建了重组菌pET-28a-mdh/BL21并成功表达了mdh,大小约36 000。选用Ni柱亲和层析法纯化具有活性的苹果酸脱氢酶（mdh）,纯化后比酶活达到112.5 U/mg,纯化倍数达2.62倍,回收率为59%。并对该酶的酶学性质进行了初步研究,其中反应最适pH值为6.0,在pH值2.0~6.0范围内稳定;反应最适温度为37℃,在42℃以下酶的稳定性较好。K＋对酶有明显的激活作用,Cu2＋对酶有抑制作用,Hg2＋和Zn2＋对酶有很强的抑制作用。醇类对酶的活力影响不大,丙三醇可显著提高酶的热稳定性。酶动力学参数以草酰乙酸为底物的Km为0.235 mmol/L,Vmax为0.47μmol/（L.min）。

高效疏水电荷诱导色谱介质的基团修饰及其色谱行为的初步研究

以粒径10μm、孔径300球形硅胶为载体,以γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH-560)为中间偶联剂,将4-巯基吡啶键合至硅胶上,制备了高效疏水电荷诱导色谱介质。通过单因素实验,探讨了反应温度、反应时间、KH-560的浓度对活化密度的影响,结果表明,在反应温度为75℃,反应时间为10 h条件下,KH-560的利用率大,可获得较宽范围的活化密度,此外还考察了缓冲液pH、反应温度、反应时间、4-巯基吡啶浓度对偶联密度的影响。结果表明,在pH=7.5的缓冲液,反应温度40℃,反应时间6 h下,4-巯基吡啶利用率高,通过控制4-巯基吡啶的浓度,可获得较宽范围的配基密度。最后,于高效液相色谱条件下,通过等度洗脱,考察了流动相pH对牛血清蛋白和溶菌酶保留因子的影响。并通过梯度洗脱,分离了不同等电点的牛血清蛋白和溶菌酶,验证了该介质的高效疏水电荷诱导色谱行为。

Mycobacterium sp.高效转化植物甾醇为雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮的诱变选育

采用紫外线、亚硝基胍复合诱变雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)的转化产生菌Mycobacterium sp.,结合平板筛选,获得一株遗传性状稳定单产ADD的突变菌株Mycobacterium sp.-11,其ADD质量浓度达到1246 mg/L,比原始菌株(484 mg/L)提高了150%,经初步优化后发酵液中ADD最高达到1430 mg/L,发酵液中ADD质量占ADD、AD两产物质量总和的比例由70%提高到99.1%。

三种混合模式色谱填料色谱性能的比较

以γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷为中间活化剂,将3-氨基吡啶、2-巯基苯并咪唑和2-巯基-1-甲基咪唑3种杂环配基键合到粒径为5μm、孔径为30 nm的球形硅胶上,制备3种高效疏水电荷诱导色谱填料。利用溶菌酶、牛血清白蛋白和免疫球蛋白G作为模型蛋白,考察其在3种不同配基色谱柱上的保留行为和分离行为。比较了3种不同性质的模型蛋白在不同色谱柱上的色谱性能的异同。发现以2-巯基-1-甲基咪唑为配基的色谱柱具有良好的p H控制色谱行为和良好的分离性能,初步验证了高效疏水电荷诱导色谱的分离模式及潜在应用。

链球菌蛋白G免疫球蛋白结合域C3区串联体的表达、筛选与初步应用

筛选并制备高效结合抗体的重组蛋白G亲和层析介质。以链球菌蛋白G C3区为结构单元,拼接形成3、4、5、6个重复C3片段的串联体,分别克隆至PET21,并在E.coli BL21(DE3)中表达。经Ni^(2+)纯化的重组蛋白分别偶联至Purose 4 Fast Flow制备亲和层析介质,比较介质的吸附情况,发现重组四串体对h IgG的吸附量最高,其静态饱和吸附量为66.79 mg×mL^(-1),动态吸附载量为35 mg×mL^(-1)介质,优于同类型商品介质。利用该介质分离纯化小鼠腹水和人血清中的IgG,纯度在95%左右,回收率不低于80%。

提高酿酒酵母异戊二烯产量的代谢途径的挖掘

以酿酒酵母为宿主菌株,挖掘可以提高异戊二烯产量的新的基因改造策略。该研究通过敲除线粒体丙酮酸载体(MPC2)、线粒体孔蛋白(POR2)和丙酮酸脱氢酶复合体的E1α亚基(PDA1)基因来增加细胞质乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)的通量,并将含有白杨(Populus alba)异戊二烯合酶基因的质粒pESC-His-ispS分别转入以上3个敲除体,得到工程菌SC1、SC2和SC3。通过摇瓶发酵,SC3效果最优,比原始菌株提高了0. 3倍。为了进一步增加Acetyl-CoA在胞质中的通量,以△PDA1菌株作为基础,进一步引入并过表达了来自Leuconostoc mesenteroide和Clostridium kluyveri的木酮糖-5-磷酸特异性磷酸转酮酶基因(xylulose-5-phosphate-specific phosphoketolase)(LmPK)和磷酸转乙酰酶基因(phosphotransacetylase)(CkPTA)得到SC4,将质粒pESC-His-ispS转入SC4,得到工程菌pHB1。然后将含有大肠杆菌异戊烯基焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase)(IDI1)的质粒pESC-His-ispS-EcIDI1转入SC4,获得pHB2。摇瓶发酵结果表明,产量达到了54μg/L,比原始菌株提高了约1倍。该研究为后续异戊二烯的研究提供了新的研究思路,也为利用酵母规模化生产异戊二烯的奠定了重要基础。

新金色分枝杆菌ksd D基因的敲除及其对菌株AD(D)合成的影响

新金色分枝杆菌（Mycobacteriumneoaurum）能将植物甾醇转化为药物中间体4-烯-雄甾-3，17-二酮（AD）和1，4-二烯-雄甾-3，17-二酮（ADD），其中3-甾酮-△1-脱氢酶（KSDD）是AD转化为ADD的关键酶。本实验室在筛菌过程中筛选到-株能将甾醇转化为AD（D）的菌株，经鉴定为M．neoaurum，本研究以该菌株为出发菌株，首先扩增出长度约1．7kb编码KSDD的ksdD基因全序列，在基因内部插入-段来源于质粒pET28a的卡那霉素抗性基因（Km），将得到的基因元件ksdD：：Km电转化M．neoaurum，通过PCR验证获得稳定遗传的ksdD基因缺失重组转化子。研究结果表明，与原始菌株相比，缺失株KSDD酶活下降了85％，AD产量相比提高了1倍，ADD产量下降了35．2％。该研究证实了ksdD基因编码的3-甾酮-△1-脱氢酶（KSDD）是AD转化ADD的关键酶，为进-步研究KSDD酶学性质及阐明AD合成ADD的代谢机理奠定基础。