利用合成生物学技术促进刺糖多孢菌多杀菌素的高效合成

多杀菌素是由刺糖多孢菌产生的次级代谢产物,具有绿色、高效、杀虫谱广等特点,是当前国际上生物杀虫农药的重点研究对象。多杀菌素及其类似物丁烯基多杀菌素的特殊结构决定了其杀虫独特的作用机理。当前,为满足大规模工业化生产的需求,研究人员致力于提高多杀菌素及丁烯基多杀菌素的产量,其中应用合成生物学技术在提高产量上取得了突出成就。本文综述了国内外通过合成生物学相关技术调控代谢途径以提高多杀菌素和丁烯基多杀菌素产量的研究,重点从底盘细胞改造与优化、合成生物系统构建、基因路线改造、代谢网络调控等方面进行了阐述,并提出和探讨了利用合成生物学技术进一步提高多杀菌素产量的技术策略,同时对未来的研究方向进行了展望,为利用合成生物学技术促进多杀菌素的生物合成提供了新的研究策略。

GluA对须糖多孢菌生长发育和丁烯基多杀菌素生物合成的影响

谷氨酸转运蛋白(GluA)是一类ATP结合蛋白,可通过调控谷氨酸的主动运输影响细胞内碳代谢、氮代谢和次级代谢,属于ABC转运系统。为研究GluA对放线菌须糖多孢菌(Saccharopolyspora pogona)生长发育及丁烯基多杀菌素生物合成的影响,本研究通过基因编辑技术对编码该蛋白的基因gluA-1分别构建了过表达和敲除菌株。表型分析显示,过表达菌株S. pogona::gluA-1丁烯基多杀菌素产量升高了4.2倍,菌体生长发育对数期延长,菌株最高菌体密度和乙酰辅酶A含量显著提升,但菌丝体形态无明显改变。敲除菌株S. pogona-ΔgluA-1丁烯基多杀菌素产量则下降了37%,菌株生长明显受抑制,乙酰辅酶A含量显著下降,且菌丝体缩短变粗,分支减少。以上结果表明,GluA对须糖多孢菌生长发育和丁烯基多杀菌素生物合成具有一定的促进作用,这为研究其在链霉菌次级代谢过程中的作用奠定了重要基础。

调控多杀菌素生物合成重要功能基因的挖掘及其作用机制

合成生物学在高效底盘细胞构建、活性天然产物挖掘以及代谢途径优化改造等方面能全力推进目标天然产物高效生物制造。然而,在刺糖多孢菌合成生物学研究中,由于对调控多杀菌素生物合成的重要功能基因及其作用机制了解甚少,难以通过“设计-构建-测试-学习”策略构建高效细胞工厂以大幅提高多杀菌素产量。为解决该问题,本研究在通过人工诱变获得一株具有多杀菌素产量提高、生长速率增快以及胞外葡萄糖摄取能力增强的优良底盘菌株CW-12基础上,对其进行了比较蛋白质组学分析。研究结果发现,与细胞内碳代谢、脂肪酸代谢、氨基酸生物合成、三羧酸循环等相关的代谢途径的增强是诱变株CW-12多杀菌素生物合成能力提高的重要原因,并筛选到668个表达水平上调的蛋白。随后,我们选择3-羟脂酰辅酶A脱氢酶(SS_2202)和乙酰辅酶A乙酰基转移酶(SS_2203)进行了作用机制分析,明确其过表达能有效促进多杀菌素生物合成。该研究对如何挖掘调控多杀菌素生物合成的重要功能基因及其作用机制解析具有一定的指导意义,为后续通过合成生物学策略构建多杀菌素高效生物合成细胞工厂奠定了重要基础。

植酸酶及其基因工程研究进展

植酸酶可添加于食品与饲料中 ,能消除因不能降解的植酸所引起的抗营养作用 ,提高机体对蛋白质及多种微量元素的利用率 ,降低粪便中磷的含量 ,从而减少环境中磷的积累污染 ,有利于保护生态环境。弄清植酸酶的性质、基因结构和功能 ,了解其基因工程的研究进展 ,不仅具有重要的理论意义 ,而且在开发研究植酸酶制剂用于饲料、食品和医药等方面具有重要的实践价值。本文谨对植酸酶的性质、基因结构和功能及其基因工程的研究进展做一综述 。

苏云金杆菌4.0718质粒上杀虫晶体蛋白基因的PCR分析

苏云金杆菌 (BacillusThuringiensis) 4 .0 718由本实验室选育是对鳞翅目 (Lepidopteran)昆虫有高毒性的菌株。采用SDS温和提取方法提取此菌株的质粒 ,电泳纯化后获得了其 4种不同分子量的质粒P1,P2 ,P3,P4。利用序列分析软件对已知的cryI类型基因进行阵列比较 ,根据其高度保守区域设计了 1对通用引物 ,对cryI类型基因的扩增产物为 2 77bp左右的片段 ,用此引物对Bacillusthuringiensis 4.0 718的 4种不同质粒进行了PCR分析 ,发现质粒P1,P2 ,P3扩增阳性 ,都产生了 2 77bp的扩增片段 ,而质粒P4没有扩增产物 ,这为进一步的基因定位打下了基础。

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白毒性片段的结构域在毒杀昆虫中的作用

苏云金芽孢杆菌 (Bacillusthuringiensis)杀虫晶体蛋白的毒性片段包含三个不同的结构域。通过对毒性片段编码基因的定点诱变和体外重组 ,已经对结构域的功能有了较清晰的认识。一般认为结构域Ⅰ参与孔道的形成 ,结构域Ⅱ决定毒素与受体的特异性结合 ,结构域Ⅲ主要调节毒素的活性。本文根据国外研究 ,从毒素蛋白质结构的不同组织层次 。

新型蛋白酶抑制剂基因hwtx-11在大肠杆菌中的克隆表达及杀虫功能研究

将化学合成的蜘蛛毒素蛋白酶抑制剂基因hwtx-11克隆至载体pGEX4T-1上,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达.重组菌株在IPTG诱导下,经SDS-PAGE和Western blot分析表明,表达的GST-HWTX-11融合蛋白的相对分子量约为33 kD.对重组菌株诱导表达后的产物进行生物活性测定,GST-HWTX-11融合蛋白对甜菜夜蛾(Spodoptera exiguaHubner)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)在3d时的LC50分别为86.6μg/mL、119.4μg/mL;其与Cry1Ac对甜菜夜蛾和棉铃虫幼虫毒力也有明显的协同作用.

增产菌的作用机制研究——增产菌超氧化物歧化酶的纯化及性质研究

增产菌是从蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus),中分离筛的能促进作物增产的益苗。本项研究通过硫酸铵分级沉淀、Sephadex G—75凝胶过滤和DE—52柱层折,对增产菌83—10菌株的超氧化物歧化酶(SOD)进行了纯化,经电泳检测、原子含量测定和抑制性试验鉴定,获得了达到均一程度的Fe—SOD,其比活为2251.5U/mg。该酶在紫外光区的吸收峰为280nm,测得该酶的亚基分子量和分子量为20500和41000道尔顿,並分析了该酶亚基的氨基酸组成。文中讨论了增产菌SOD对作物的保健作用。

苏云金杆菌发酵监测的初步研究

跟踪检测了苏云金杆菌发酵过程中发酵液 pH值、OD595nm值、非极性物质、可溶性蛋白质含量等的变化 ,并比较了伴孢晶体不同状态下的OD值 .在此基础上进行了探讨 。

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白毒性片段的结构域在毒杀昆虫中的作用

苏云金芽孢杆菌 (Bacillusthuringiensis)杀虫晶体蛋白的毒性片段包含三个不同的结构域。通过对毒性片段编码基因的定点诱变和体外重组 ,已经对结构域的功能有了较清晰的认识。一般认为结构域Ⅰ参与孔道的形成 ,结构域Ⅱ决定毒素与受体的特异性结合 ,结构域Ⅲ主要调节毒素的活性。本文根据国外研究 ,从毒素蛋白质结构的不同组织层次 。

几种特种水产动物超氧化物歧化酶的研究

对牛蛙、黄鳝、泥鳅、乌鳢、鲶鱼、鳊鱼、鲤鱼七种特种水产动物肌肉的SOD 活性及其同工酶进行了研究。结果表明不同特种水产动物肌肉组织的 SOD 活性及其同工酶具有显著差异。发现在这七种特种水产动物中 SOD 活性的高低与其耐受逆境和抗病能力具有密切关系。文中还讨论了不同特种水产动物的 SOD 活性与其生态习性的关系。

企业技术创新能力主要影响因素的探究-基于模糊聚类分析和灰色模型

本文利用模糊聚类分析方法和灰色模型对企业技术创新的影响因素进行分析,确定影响因素的重要因素,形成了企业技术创新影响因素由定性到定量分析,通过灰色模型进行精确度检验和预测分析来如何更好的利用企业技术创新的影响因素来提高核心竞争力并提出可行的建议。

藠藠头中抗菌活性成分的抑癌作用及机理研究

从藠头(Allium chinense G.Don)中提取的活性物质在不同温度处理下具有良好的热稳定性。利用其活性物质处理肝癌(HepG-2)细胞和海拉(Hela)细胞,发现该物质对两种癌细胞生长都有抑制作用,且呈浓度依赖性。采用流式细胞仪分析发现,该物质可改变两种癌细胞的细胞周期,但不诱导细胞凋亡。通过体外对木瓜蛋白酶和蛋白酶K活力的测定,该物质对木瓜蛋白酶活力有较大的影响,对蛋白酶K活力影响不明显,这可能与木瓜蛋白酶的活性中心含巯基有关。分析认为藠头活性成分的抑癌作用可能是通过影响癌细胞内象木瓜蛋白酶等一些活性中心含巯基的酶的活力来实现的。

藠头中活性物质对白色念珠菌的抑制作用及其机理研究

藠头(Alliumchinense)活性物质对白色念珠菌(Candidaalbicans)的生长有较强的抑制作用,其活性物质洗脱液的最低抑菌浓度(MIC)值为0.2%(V/V);用藠头活性物质洗脱液处理白色念珠菌可导致细胞内OD260nm物质泄漏,且呈浓度和时间依赖性;藠头活性物质洗脱液可抑制白色念珠菌培养基的酸化,对细胞活性的影响也呈浓度和时间依赖性;通过红光图谱发现,藠头活性物质破坏了白色念珠菌细胞壁β-(1-3)-D葡聚糖的糖苷键而改变了细胞壁结构。

外源基因在苏云金杆菌染色体上的定点整合及表达

【目的】研究构建稳定表达外源基因、无抗性标记基因的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)工程菌的方法。在构建Bt工程菌时,高拷贝外源质粒的转入导致Bt芽孢数量减少,芽孢形成期延滞,影响Bt菌株的杀虫活力。而且,外源质粒在Bt中的稳定性较差,外源基因容易丢失。将基因整合入染色体是一种构建遗传性状稳定、杀虫活力高的Bt工程菌的有效方法。【方法】本研究采用PCR技术,分两段扩增定位于Bt无晶体突变株XBU001染色体上的trigger factor基因片段作为同源臂,克隆入温度敏感型载体pKSV7,构建了定点整合载体pKTF12。并利用pKTF12质粒将cry1Ac基因定点整合入XBU001染色体上。【结果】利用载体pKTF12将cry1Ac定点插入triggerfactor位点,对宿主菌XBU001的正常生长没有影响。重组菌株KCTF12中的cry1Ac基因能够稳定遗传、表达并形成菱形晶体。与携带高拷贝外源质粒的Bt菌株HTX42相比较,KCTF12具有芽孢数量增多、芽孢形成期提前的优势。【结论】定点整合法是一种构建稳定表达外源基因、无抗性标记基因Bt工程菌的有效方法。