广西巴马小型猪睾丸发育过程中组织形态及生殖激素水平的变化

为探究广西巴马小型猪睾丸的生长发育规律,为初情期和性成熟的判定提供依据,本实验采集广西巴马小型猪胚胎期65、90、105 d和出生后0、30、60、90、120、150、180、300 d的睾丸组织,测定睾丸长径、短径、厚径、重量等形态学指标,通过HE染色观察其组织特征,并使用ELISA方法测定出生后不同日龄的生殖激素水平。结果显示:随着日龄增加,睾丸各形态学指标持续增大,0~30 d各项指标增长速度最快,睾丸指数呈现先升高后降低的趋势,并在出生后60 d达到最大值;睾丸的各形态学指标间均呈正相关(P<0.01)。组织学观察表明,出生后60 d的睾丸和附睾中各部位内开始出现精子,已达到初情期;胚胎期生精小管的直径与面积在不同胎龄间差异不显著,出生后,与30 d相比,60 d睾丸的生精小管直径和面积增加(P<0.05)。促性腺激素释放激素(GnRH)存在2个快速上升的阶段(0~30 d和90~120 d),120 d之后迅速下降,卵泡刺激素(FSH)在出生后呈现阶梯式上升的趋势,30~60 d出现首次快速上升,黄体生成素(LH)在120 d快速增长至150 d后逐渐下降,睾酮(T)在出生后经过短暂下降逐步上升至120 d,120~150 d出现一次快速上升,180 d达到峰值后快速下降。本实验发现,广西巴马小型猪胚胎期65~90 d和出生后0~60 d是其睾丸快速发育的时期;出生后30~60 d是精子发生的关键时期,初情期在30~60 d;巴马小型猪睾丸在60 d时已具备基本的生精能力,在150 d时基本发育成熟。

广西巴马小型猪内脏器官生长发育及血清生化指标研究

本研究旨在分析广西巴马小型猪不同生长阶段内脏器官、肠道组织形态发育以及血清生化指标的变化,为保护广西地方小型猪品种、医学动物模型的开发提供参考。实验猪由广西大学巴马小型猪繁育中心实验牧场培育,在0、30、60、90、120、180日龄时分别选择4头健康且体重相近的母猪进行屠宰,采集血液、心、肝、脾、肺、肾、空肠和回肠,测定不同日龄下广西巴马小型猪内脏器官的重量和血清生化指标,测定30、90、180日龄的空肠、回肠肠绒毛长度、数量和小肠腺平均直径、数量。结果表明:在所测日龄内,广西巴马小型猪内脏器官的生长强度顺序依次为肝脏、肺脏、肾脏、心脏、脾脏,其相对生长速度由快到慢依次为脾脏、肝脏、肺脏、心脏、肾脏。90日龄和180日龄广西巴马小型猪的空肠绒毛长度显著高于30日龄;180日龄的空肠绒毛数量显著高于30日龄;180日龄的空肠肠腺直径显著高于90日龄与30日龄;90日龄空肠肠腺数量达到最高后下降,180日龄的空肠肠腺数量显著低于90日龄。90日龄和180日龄广西巴马小型猪的回肠绒毛长度显著高于30日龄;30日龄的回肠绒毛数量显著高于180日龄;180与90日龄的回肠肠腺直径显著高于30日龄;随着日龄的增加,回肠肠腺数量呈上升趋势,但每个时期差异均不显著。本实验结果说明,广西巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏与肾脏的生长速度在0~30日龄最大;广西巴马小型猪肝脏发育的基本结构单位肝小叶在30日龄左右时基本形成,其肝脏组织结构发育的稳定期推测可能在210~240日龄,由于样本有限,具体发育稳定期有待后续研究;随着日龄增长,广西巴马小型猪空肠、回肠的肠绒毛和肠腺发育不断完善,但是空肠肠绒毛与肠腺的生长发育比回肠更好,推测空肠是饲料消化吸收的主要场所。

广西巴马小型猪MyoD1基因克隆及其真核表达载体的构建

本研究旨在对广西巴马小型猪成肌细胞决定基因1(myoblast-determining 1,MyoD1)进行克隆分析,并构建MyoD1基因真核表达载体pEGFP-N1-MyoD1,为进一步研究该基因在广西巴马小型猪骨骼肌发育中的调控作用奠定基础。以广西巴马小型猪的肝脏组织为材料,应用RT-PCR技术克隆得到广西巴马小型猪MyoD1基因编码序列,对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,并构建该基因的真核表达载体,经过PCR和双酶切验证,通过脂质体转染,将重组质粒转染C2C12细胞,在细胞水平验证了该载体的正确性。结果显示,广西巴马小型猪MyoD1基因编码区序列长960 bp,编码319个氨基酸,核苷酸序列与猪、牛、水牛、绵羊、马、人、小家鼠、褐家鼠、家犬的同源性依次为99.7%、92.8%、92.9%、92.6%、91.5%、82.9%、82.9%、82.0%和90.9%;系统进化树分析表明,广西巴马小型猪MyoD1基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性;蛋白质结构分析表明,MyoD1蛋白为膜外蛋白,在第4-116位氨基酸处存在1个MyoD家族标志性的MyoD结构域,对广西巴马小型猪、猪和人的MyoD1蛋白高级结构比较发现其具有极高的相似性。本研究构建的广西巴马小型猪MyoD1基因表达载体pEGFP-N1-MyoD1,转染C2C12细胞后产生绿色荧光信号,表明MyoD1基因在C2C12细胞中成功表达。

广西巴马小型猪BMP2基因克隆、生物信息学及组织表达分析

本研究旨在对广西巴马小型猪骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic proteins 2,BMP2)基因进行克隆及其结构和功能的预测,并检测其在广西巴马小型猪和长白猪中的表达差异。以广西巴马小型猪基因组DNA为模板,通过测序鉴定BMP2基因外显子区的单核苷酸多态性(SNPs),利用多种生物信息学软件对广西巴马小型猪BMP2基因启动子区、编码区(CDS)、3′UTR区进行了分析,预测分析广西巴马小型猪BMP2基因编码蛋白的基本理化性质、磷酸化位点、O-糖基化位点、跨膜区域、亲疏水性、蛋白质修饰结构、二级结构和三级结构等,并对miRNA结合位点及其相关通路进行分析,绘制了广西巴马小型猪和长白猪的组织表达谱。结果显示,试验成功克隆了广西巴马小型猪BMP2基因CDS区,总共1188 bp,编码395个氨基酸;与猪参考基因组相比,广西巴马小型猪BMP2基因在G1663A、G1897C发生了同义突变,在C1896T(Pro→Leu)、T1971C(Gly→Ser)、G2000A(Leu→Ser)发生了3处错义突变;在3′UTR区域存在miR-142-5p、miR-129-5p等共13个miRNA结合区域;相似性比对结果显示,广西巴马小型猪与野猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊、马、澳洲野犬、家犬、猕猴对应区段的相似性依次为99.92%、91.75%、91.84%、91.92%、91.92%、90.50%、89.43%、90.91%和90.91%;系统进化树结果表明,广西巴马小型猪与野猪的亲缘关系最近,与黄牛的亲缘关系相对较近,与猕猴亲缘关系较远;BMP2蛋白分子质量为44.55 ku,理论等电点为8.37,预测其有12个O-糖基化位点,42个磷酸化位点;预测分析发现该蛋白为亲水性蛋白,且是膜外蛋白。组织表达谱发现,广西巴马小型猪生长板软骨中BMP2基因表达量显著低于长白猪(P<0.05)。该研究为进一步探索广西巴马小型猪中BMP2基因的功能提供了理论基础,也为广西巴马小型猪品种资源的利用提供了重要参考。

巴马香猪VRTN基因克隆、表达及其多态性与繁殖性状的关联分析

旨在研究VRTN(vertebrae development homolog)基因在巴马香猪群体中的编码区序列特征、组织表达情况、脊椎数性状因果突变位点ins291的等位基因频率及其与乳头数和产仔数性状的关联。本研究采集3头0日龄巴马香猪组织,利用cDNA克隆技术获得VRTN基因编码区全长序列并进行生物信息学分析,利用荧光定量PCR技术检测VRTN在心、肝、脾、肺、肾、背最长肌和皮下脂肪组织中的表达情况;采集279头经产巴马香猪母猪血液,检测ins291位点在该群体中的频率分布,并与乳头数、产仔数性状进行关联分析。结果表明,巴马香猪VRTN基因编码区全长2 097 bp,其编码的氨基酸序列在不同物种间存在大量保守区域;VRTN基因编码698个氨基酸,预测为亲水性蛋白质,存在1个螺旋转角螺旋域超家族结构功能区、2个低复杂度区域和2个内部重复结构,并与核受体辅抑制子1(NR6A1)、果蝇同源框基因Prospero的脊椎动物同源蛋白2(PROX2)和富亮氨酸重复序列74亚基(LRRC74A)等蛋白具有相互作用;VRTN基因在0日龄巴马香猪各组织中均有表达,其中在背最长肌组织中表达量最高;巴马香猪保种群体中VRTN基因有利突变位点ins291的等位基因频率为21.15%,不同基因型个体之间平均产仔数、总乳头数、左侧乳头数、右侧乳头数和单侧最大乳头数性状均无显著差异(P>0.05),但纯合突变型(ins/ins)个体的乳头数性状均高于其他基因型个体。结果提示,在巴马香猪产业化生产中可通过分子育种手段提高VRTN ins291有利等位基因频率,但不影响其产仔数性状。

广西地方猪群体遗传结构、选择信号分析和ROH检测

为深入挖掘广西地方猪种的种质特性相关基因,用50K芯片对巴马香猪和隆林猪进行了基因分型,并下载了陆川猪、东山猪、杜洛克、长白猪和大白猪的60K芯片数据,将数据整合后通过多种软件进行群体遗传结构分析、选择信号分析和ROH检测,并对相关位点和区域进行了基因定位与富集分析。结果显示:隆林猪近交程度最低但可能已经受西方商业猪种血液入侵,血统不纯;陆川猪近交程度最高,且与东山猪在遗传距离和亲缘关系上都比较近;去除隆林猪后,共有435个位点受到了选择,以50 kb作为受选择区域共定位到了175个基因,参与了31条信号通路,其中分别有5、9、7、9、1个基因与脂肪、糖尿病或胰岛功能、免疫、繁殖、热应激相关;广西地方猪种共检测到4491个ROH区域,高频ROH区域主要位于1、4、7、14号染色体,共定位到了48个基因,参与8条信号通路,其中4、3、2个基因分别与免疫、繁殖和肉质相关,4号染色体还存在一个区域被7个品种同时定位,包含的DECR1基因可能与广西地方猪种的独特肉质性状有关。本研究结论为广西地方品种中有DECR1、TNNC1和MTCH2等基因与肉质相关;IL12A、BCL11B和TLR9等基因与免疫功能相关;GNRHR、RBBP4和ALAS1等基因与繁殖性状相关;该结论为广西地方猪种种质资源开发、利用提供了重要理论依据。

鞣花酸对断奶仔猪小肠黏膜形态及肠黏膜屏障功能的影响

鞣花酸是一种广泛存在于各种软果、坚果植物组织中的天然多酚类成分。为了研究鞣花酸对生长发育阶段猪肠道屏障及肠道免疫功能的影响,试验选取30日龄断奶的健康二元(L×Y)杂交仔猪60头,随机分为试验组和对照组,对照组仔猪饲喂基础日粮,试验组在基础日粮中添加鞣花酸(含量为90%)500 g/t,饲喂40 d,比较对照组与试验组仔猪的生长情况、血清中二胺氧化酶(DAO)活性、仔猪肠道绒毛高度及隐窝深度、肠道黏膜中炎症因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素6(IL-6)]、紧密连接蛋白[闭锁连接蛋白1(ZO-1),咬合蛋白(Occludin)]基因的表达情况。结果表明:试验组仔猪的平均日增重显著高于对照组仔猪(P<0.05),空肠和回肠绒毛高度显著高于对照组(P<0.05),空肠隐窝深度显著低于对照组(P<0.05),血清中DAO活性显著低于对照组(P<0.05)。试验组仔猪空肠黏膜中ZO-1的mRNA表达量极显著高于对照组(P<0.01),TNF-α的mRNA表达量极显著低于对照组(P<0.01),IL-6的mRNA表达量显著低于对照组(P<0.05);试验组仔猪回肠中Occludin的mRNA表达量极显著高于对照组(P<0.01),IL-6的mRNA表达量显著低于对照组(P<0.05)。说明鞣花酸能够提升仔猪的生长性能,降低血清中DAO的活性,增加小肠绒毛高度,降低隐窝深度,提高仔猪小肠黏膜中紧密连接蛋白相关基因的表达,同时降低仔猪炎症相关基因的表达,总体上提高了仔猪小肠的健康状态,减少了仔猪肠道炎症反应。

猪不同生长阶段肠道微生物组的变化及其影响因素

肠道是机体重要的消化与免疫器官,维持肠道健康对猪的生长发育和疾病预防具有十分重要的意义。高通量测序技术的发展极大地促进了人们对肠道微生物功能的认知,猪肠道微生物组的研究正逐步成为热点。目前,尽管对某一生长阶段猪的肠道微生物组已有较为深入的理解,但仍缺乏有关商品猪整个生命周期范围内肠道微生物组动态变化的全面纵向研究。而从出生到出栏,猪在整个生长周期内的肠道微生物组并不是一成不变的,是一个动态的发育过程。作者综述了猪哺乳期、断奶期、育肥期和妊娠期等从出生到育肥过程中不同阶段肠道微生物组的纵向变化及其主要影响因素:一方面,肠道微生物群落结构的显著变化主要发生在断奶期;另一方面,虽然肠道微生物组成随着时间始终在不断变化,但仍有一部分优势菌是一直存在的,这部分优势菌被称为核心菌群,而只在特定时期才出现的菌只是胃肠道中的“过客”,也最易受外界因素影响。肠道微生物组与多种因素相关,如年龄、饮食、环境、抗生素使用等,其中饮食对塑造肠道微生物起到至关重要的作用。本文可为理解猪在不同生长发育阶段肠道微生物的动态变化规律及改善猪生长性能和健康水平的微生物技术手段提供理论参考。

高脂高糖饮食对小型猪肠道微生物的影响

高能饮食是肥胖发生的重要诱因之一,肠道微生物在其中发挥重要作用。为探究高脂高糖饮食过程中肠道微生物组成的动态变化并筛选与肥胖发展密切相关的肠道微生物,本研究以广西巴马小型猪为动物模型,随机分为普通饮食组(CN组)和高脂高糖饮食组(HFD组),进行为期30 d的饮食干预,分别在干预0、7、15和30 d时收集粪便样品,利用16S rRNA基因测序技术分析高脂高糖饮食对广西巴马小型猪肠道微生物组成、结构和功能的影响。结果显示:HFD组个体肠道微生物的多样性普遍低于CN组,高脂高糖饮食改变了小型猪肠道微生物的结构;随着高脂高糖饮食干预时间的增加,观察到了肠道微生物组的总体变化趋势:在门水平,HFD组个体肠道微生物中Firmicutes丰度增加而Bacteroidetes丰度逐渐下降;在属水平,HFD组中Lactobacillus丰度逐渐减少而Ruminococcus丰度则不断升高;CN组和HFD组之间存在一些显著差异的肠道微生物,其中g__Lactobacillus、g__norank_f__p_251_o5和g__unclassified_c__Bacilli等12个菌群在CN组显著富集,g__Peptococcus、g__Collinsella和g__Senegalimassilia等8个菌群在HFD组显著富集,可能是与肥胖发生相关的潜在微生物;微生物功能预测分析发现,两组之间微生物功能无显著性差异,均主要富集在氨基酸的生物合成、淀粉与蔗糖的代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢以及糖酵解和糖异生等方面。本研究发现,高脂高糖饮食降低了肠道微生物的多样性,使微生物结构发生了改变,存在一定菌群失调的现象,发现了与肥胖发展密切相关的潜在微生物。

广西巴马小型猪CTGF基因真核表达载体构建及其相关生物信息学分析

【目的】构建广西巴马小型猪结缔组织生长因子(CTGF)基因真核表达载体并鉴定其活性,为深入研究CTGF在癌症发生中的作用及其分子机制提供参考,也为构建CTGF转基因广西巴马小型猪及研发基于CTGF的癌症基因治疗策略提供理论依据。【方法】利用RT-PCR从广西巴马小型猪肝脏组织中克隆CTGF基因,并将CTGF基因亚克隆到p DsRed-N1载体上,然后通过脂质体转染小鼠Hep3B细胞,转染48 h后于荧光显微镜下观察细胞是否表达红色荧光蛋白,同时利用在线生物信息学软件对其理化性质进行分析。【结果】成功克隆获得广西巴马小型猪CTGF基因编码区(CDS)序列,序列全长1050 bp,共编码349个氨基酸,与NCBI上已公布普通猪参考序列的同源性为99.5%,有5处碱基突变,且均为同义突变。将广西巴马小型猪CTGF基因亚克隆到pDsRed-N1载体上成功构建了阅读框架正确的广西巴马小型猪CTGF基因真核表达载体,转染小鼠Hep3B细胞48 h后有红色荧光蛋白表达。广西巴马小型猪CTGF蛋白具有较强的亲水性,其二级结构中α-螺旋、β-折叠、延伸链和无规则卷曲各占13.18%、5.73%、17.48%和63.61%。【结论】广西巴马小型猪CTGF基因在进化过程中的保守性非常稳定,通过构建的真核表达载体能转染小鼠Hep3B细胞并成功表达,可用于生产转基因广西巴马小型猪及研发与CTGF基因有关的疾病模型。

水牛MYF5基因克隆分析及真核表达载体构建

本研究旨在对广西沼泽型水牛MYF5基因进行克隆和分析,并构建其真核表达载体。应用RT-PCR方法从水牛肌肉组织中扩增MYF5基因,测序鉴定后对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,同时构建该基因真核表达载体,并在细胞水平验证所构建载体的正确性。结果表明:水牛MYF5基因编码区序列长度为768 bp,编码255个氨基酸,其核苷酸序列与牛、山羊、猪、人、猩猩和狼相应序列的相似性分别为99%、98%、94%、91%、90%和89%;水牛MYF5基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性;MYF5蛋白为膜外蛋白,具有MYOD家族标志性MYOD结构域;构建水牛MYF5基因真核表达载体pMXs-MYF5,转染HEK293T、水牛颗粒细胞后产生绿色荧光信号,表明细胞表达MYF5基因。

基于16S rRNA测序揭示杜洛克猪早期体重与肠道微生物的关系

本研究旨在探讨肠道微生物与杜洛克猪早期体重的关系。从91头80日龄杜洛克公猪中根据个体体重排序选择体重较轻(lighter body weight,LBW)的9头猪和体重较重(heavier body weight,HBW)的9头猪。通过对16S rRNA基因V3-V4区测序,分析了HBW和LBW组猪粪便中微生物多样性、组成和预测功能。结果显示,HBW和LBW组之间微生物的Alpha多样性无显著差异(P>0.05)。杜洛克仔猪肠道微生物的核心菌门为厚壁菌门(HBW和LBW组分别为65.62%和66.57%)和拟杆菌门(HBW和LBW组分别为30.87%和29.80%),核心菌属为普雷沃菌属(HBW和LBW组分别为23.82%和20.84%)、乳杆菌属(HBW和LBW组分别为9.11%和16.55%)、未分类的瘤胃菌科(HBW和LBW组分别为10.32%和9.98%)和未分类的毛螺菌科(HBW和LBW组分别为6.33%和4.53%)。PCoA分析显示,肠道微生物在杜洛克仔猪个体之间差异较小,但两组间在微生物组成上存在一些显著差异的菌属。在属水平上,HBW组猪中北里孢菌属、g_norank_o_Tremblayales、未命名的丹毒丝菌属、未分类的普雷沃氏菌科和粪芽孢菌属的丰度显著高于LBW组(P<0.05),棒状杆菌属在LBW组中的丰度显著高于HBW组(P<0.05)。此外,KEGG通路差异分析发现,倍半萜类化合物生物合成、胰岛素信号通路、抗坏血酸和醛酸代谢及安沙霉素类合成的途径显著富集于HBW组(P<0.05),分泌系统途径显著富集于LBW组(P<0.05)。本研究结果有助于理解猪早期肠道微生物与宿主间的相互作用和猪的健康养殖。

巴马香猪产活仔数性状全基因组关联分析

为寻找与巴马香猪产活仔数相关的分子标记,试验利用全基因组关联分析(GWAS)定位并筛选了影响产活仔数性状的候选基因,采集297头具有多胎产仔记录的巴马香猪耳组织样品,提取DNA并利用猪50K SNP芯片进行基因分型,分型结果经质控与基因型填充后,使用Tassel软件对巴马香猪产活仔数性状进行全基因组关联分析。结果显示,巴马香猪平均窝产活仔数在1~9胎内随着胎次增加逐渐升高;经质控过滤后共获得32816个SNPs位点,利用全基因组关联分析共筛选到8个与巴马香猪产活仔数相关的SNPs位点,分别在基因组或染色体水平达到显著;对关联显著SNP位点上下游500 kb内的编码基因进行富集分析,并依据猪繁殖性状相关QTL区域及基因功能,最终筛选到4个基因(CAPZB、MSH3、CITED2和HSD17B7)作为影响巴马香猪产活仔数的候选基因。

广西巴马小型猪与长白猪的BMP2和FGFR3基因序列及表达差异分析

【目的】明确广西巴马小型猪与长白猪的BMP2和FGFR3基因序列及表达差异,为进一步阐明大型猪与小型猪的体型形成机制提供理论依据。【方法】以1日龄的广西巴马小型猪和长白猪为研究对象,采集其四肢骨生长板软骨组织提取总RNA,反转录合成cDNA后用于扩增BMP2和FGFR3基因的编码区(CDS)序列,采用PCR-RFLP检测FGFR3基因SNP位点多态性,并通过实时荧光定量PCR分析BMP2和FGFR3基因在1日龄广西巴马小型猪和1日龄长白猪生长板软骨组织中的表达差异。【结果】1日龄广西巴马小型猪与1日龄长白猪的体型差异明显,其体重、体长和体高的差异均达极显著水平(P<0.01,下同),股骨长的差异达显著水平(P<0.05,下同)。广西巴马小型猪和长白猪的BMP2基因CDS序列全长1188 bp,且2个品种猪的CDS序列完全一致;广西巴马小型猪和长白猪的FGFR3基因CDS序列全长808 bp,与NCBI已公布的FGFR3基因序列(XM_005666479.1)比对发现存在8个碱基突变位点及1个碱基缺失位点。广西巴马小型猪和长白猪共有5个错义突变位点,分别为A124G、C190G、A204C、C205A和C245T,另外3个突变位点是广西巴马小型猪A438G和C549T的同义突变及长白猪A752C的错义突变;碱基缺失位点为长白猪第328~330个碱基(GCA)缺失。FGFR3基因A2374G和C2620T位点的基因型及基因频率在广西巴马小型猪与长白猪间的分布差异极显著,对应的等位基因分布均不符合Hardy-Weinberg平衡,且2个基因座均处于连锁平衡状态。1日龄广西巴马小型猪生长板软骨组织中的BMP2基因相对表达量显著低于1日龄长白猪,而FGFR3基因相对表达量极显著高于1日龄长白猪。【结论】BMP2和FGFR3基因在猪的软骨和骨骼形成方面具有重要意义,其中,BMP2基因对猪骨发育起促进作用,而FGFR3基因对猪骨发育起抑制作用。广西巴马小型猪体型矮小与FGFR3基因高表达及BMP2基因低表达存在直接关联。

不同采样量、保存时间和温度对猪血常规测定结果的影响

为了提高猪血常规测定结果的准确性,试验采集6头广西巴马小型猪血液,利用全自动血细胞分析仪测定并分析了采血量、冷藏保存时间、冷冻温度对猪血常规测定结果的影响。结果表明:采血量较大(3 mL左右)时血常规测定结果的稳定性更差;血样采集后在4℃保存4 h内测定对血常规指标没有显著影响,8 h以后测定对白细胞指标有显著影响;-20℃、-40℃、-80℃冷冻后测定血常规均会对大多数指标有极显著影响;液氮冷冻30 min对猪血液红细胞总数、血红蛋白浓度、血红蛋白含量、血小板总数等指标没有显著影响。说明测定猪血常规应采集较少量(1 mL左右)血液于4℃保存并于4 h内完成测定。

小型猪2型糖尿病模型肠道微生物分析

目的近期研究证据表明,肠道微生物与2型糖尿病(T2DM)等代谢性疾病有关,相关机制研究多以啮齿类动物为模型,而在更适合研究人类疾病的猪模型上却鲜有报道。方法为了探究小型猪T2DM模型中肠道微生物的组成和结构的变化,本研究以广西巴马小型猪为动物模型,通过高脂高糖饮食诱导T2DM,建模成功后采集T2DM发病组(T2DM组)和普通饮食饲喂的对照组(CN组)个体的新鲜粪便样品,采用16S rRNA基因测序技术进行肠道微生物组成与结构的比较分析。结果结果发现,T2DM组个体的肠道微生物的多样性发生了明显下降;在门水平上,与CN组相比,T2DM组厚壁菌门丰度显著增加(P<0.05),而拟杆菌门丰度下降;在属水平,PCoA分析发现CN组和T2DM组组成显著差异,T2DM组独有与产琥珀酸相关的光冈菌属,两组比较和LEfSe分析发现两组间存在多个显著性差异的菌属:颤螺旋菌属、普氏菌属和消化球菌属等在CN组显著富集,g;ntestinibacter在T2DM组中显著富集;功能预测未发现两组存在显著差异的代谢通路,两组均主要富集在氨基酸的生物合成、碳新陈代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢以及糖酵解和糖异生等方面。结论本研究发现了2型糖尿病小型猪肠道微生物的变化特征和与糖尿病发生密切关联的潜在微生物,为研究肠道微生物与2型糖尿病的关联及其作用机制提供了理论依据。

广西巴马小型猪CTSK基因CDS区克隆与生物信息学分析

目的对广西巴马小型猪组织蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)基因CDS区进行克隆及生物信息学分析。方法从广西巴马小猪的皮下脂肪中提取总RNA,通过RT-PCR方法扩增获得CTSK基因CDS区序列,并采用相关生物信息学软件对其序列特征、系统进化、编码蛋白结构和理化性质进行分析。结果广西巴马小型猪CTSK基因CDS全长993 bp,编码330个氨基酸,与NCBI上公布的普通猪(NM_214302.1)CTSK基因序列完全一致。同源性比对结果发现,CTSK基因在进化过程中具有较高的保守性。广西巴马小型猪CTSK蛋白具有明显的亲水性区域,在第17-330氨基酸位置区域存在一条信号肽序列,不存在跨膜结构域,二级结构元件由α螺旋、β折叠、无规卷曲和延伸链组成。修饰结构预测发现CTSK蛋白存在两处N糖基化位点,亚细胞定位发现其可能主要分布于内质网和细胞核。结论本研究成功克隆了广西巴马小型猪CTSK基因CDS序列并进行分析,为今后进一步深入研究该基因功能和建立相关疾病动物模型提供理论基础。

胎次与公猪对巴马香猪产仔数影响及产仔数统计对样本量要求的研究

为研究胎次与公猪对巴马香猪产仔数的影响并分析产仔数统计对样本量的要求,本实验采集了989头巴马香猪历年产仔数,使用Excel、R语言和SPSS19.0分析巴马香猪1~11胎产仔数Person相关系数、各胎次之间的影响差异,并选取159头9胎以上母猪进行可靠性分析;分析巴马香猪公猪与杜洛克公猪对巴马香猪产仔数的影响差异;使用C#编写了Exceltools2.0软件对753头母猪平均产仔数进行以10%样本量为梯度的1~100次随机抽样,计算其变异系数。结果显示:巴马香猪平均产仔数为9.36±2.09头,对胎次的回归方程为Y=8.637+0.167X;第1~9胎产仔数大多相互呈中低度相关,6胎以内相邻胎次之间Person相关系数比更远的胎次间更大;产仔数随胎次增加升高,到8、9胎最高,第1胎的产仔数极显著低于其他胎次;与杜洛克公猪交配能极显著提高巴马香猪的平均产仔数;159头9胎以上母猪与753头母猪各胎次分析结果一致,第2~11胎的平均产仔数与第1~11胎和第3~11胎差异均不显著;抽取1次使变异系数达到1%以下需要的样本量为10%,抽取1次使变异系数达到1‰以下需要的样本量为70%。综上,巴马香猪母猪的可使用年限比其他猪种更长;可以使用第2~11胎平均产仔数作为总平均产仔数或者该品种的平均产仔数;随机抽取70%的母猪计算其平均产仔数准确度极高。

巴马香猪断奶过渡期肠道微生物的变化

肠道微生物对猪的健康和生长具有重要作用,了解断奶期间微生物群落组成和功能的变化对猪生产具有重要意义。本研究收集了广西巴马香猪断奶前3 d(B3)、断奶后24 h(A0)、断奶后3 d(A3)和断奶后7 d(A7)共4个时间阶段的直肠拭子,通过Illumina Miseq平台对16S rRNA基因V3-V4区域进行测序,分析巴马香猪断奶过渡期肠道微生物组成、结构和功能的改变。结果表明:随着仔猪年龄的增长,断奶后Alpha多样性逐渐增加;断奶应激导致巴马香猪断奶过渡期的肠道微生物的组成发生变化,在门水平,厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)是断奶过渡期所有组的优势菌门,拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)在断奶过渡期其丰度发生了显著变化(P<0.05);在属水平,双歧杆菌属(Bifidobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)和梭杆菌属(Fusobacterium)等是断奶前的特征菌属,断奶后其优势被普氏菌属(Prevotella)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)和密螺旋体属(Treponema)等菌属替代。KEGG功能预测发现,巴马香猪断奶前肠道微生物主要参与脂类代谢,断奶后肠道微生物主要参与免疫性疾病、其他氨基酸的代谢和其他次生代谢产物的生物合成等代谢途径。

巴马香猪回肠、结肠消化特征研究

本试验旨在研究巴马香猪回肠、结肠的消化特征。采集了9头成年巴马香猪母猪回肠和结肠内容物,通过超高压液相色谱-串联质谱技术进行质谱检测。使用Compound Discover 3.1软件进行代谢物检测,SMICA-P软件和SPSS 19.0软件进行极显著差异代谢物筛选,MetaboAnalyst 5.0、HMDB和KEGG网站进行代谢物性质和代谢途径分析。结果表明:本研究正、负离子模式分别获得了26119和16265个质谱峰,分别匹配了6403和1912种代谢物;无监督主成分分析中模型对X变量的解释率超过0.6,且9个质量控制样本均集中分布在中心点;监督正交偏最小二乘判别分析中模型对Y变量的解释率和模型预测能力均超过为0.93;200次迭代验证的模型回归直线截距均小于0.05;共检测到42种极显著差异代谢物,其中10个极显著差异代谢物与胆汁酸类物质有关,6个差异代谢物为氨基酸;14种差异代谢物参与了19条代谢途径;胆汁酸类物质在回肠内容物中含量比结肠高90~20574倍,氨基酸类物质含量在回肠内容物中比结肠高5~21倍,十二烷二酸和3-甲基二氧吲哚含量在结肠内容物中比回肠高约1000倍。结果提示,高胆汁酸和高氨基酸吸收效率是回肠的消化特征;高微生物代谢产物是结肠消化特征。