医学研究生《细胞培养技术》课程教学改革探析

为实现党的二十大提出的我国到2035年要达到教育、科技和人才“三位一体”的总体目标^([1]),需持续深化教育改革.研究生是我国科学研究创新的后备力量,提升研究生科学研究创新实践能力是当前面临的一项重要任务^([2]).培养医学生的科学研究素质和创新实践能力不仅是医学研究生创新创业能力发展的需要,亦是全面建设社会主义现代化国家协同发展的战略性支撑^([3]).

能力培养为导向的医学模块化教学模式探索

模块化教学改革的目标是培养学生的自主学习能力、复合应用能力,增强学生发现问题、分析问题和解决问题的能力,培养学生的创新精神和实践应用能力,从而加强高质量高素质复合应用型医学人才的培养,为以后临床医疗工作打好基础。打破原有的学科壁垒,建立以器官系统为中心的模块化教学模式,将具有关联的基础学科课程内容及临床课程内容整合在一起,并根据不同的系统,将传统讲授法与PBL、案例法、翻转课堂等教学方法结合,进行混合式教学,探索出临床医学专业本科生能力培养为导向的教学模式。

牛蒡子苷元通过SIRT1/NLRP3途径减轻哮喘小鼠气道炎症

目的探讨牛蒡子苷元对哮喘小鼠模型中对气道炎症的疗效以及其机制是否与SIRT1/NLRP3信号通路有关。方法选取40只♀清洁级BALB/c小鼠,分为control组,OVA模型组,ATG组(5、10和20 mg·kg^(-1))。HE及PAS染色法观察肺组织病理改变;Diff-Quick染色法对小鼠BALF中细胞分类及计数;流式细胞术测定小鼠肺组织中细胞因子在CD4阳性细胞群中的阳性比例;Western blot测定肺组织SIRT1、NLRP3、caspase-1、IL-18和IL-1β蛋白表达;免疫荧光法检测小鼠肺组织中NLRP3荧光强度。结果牛蒡子苷元能抑制OVA诱导的炎症细胞的渗出及杯状细胞增生;牛蒡子苷元抑制小鼠肺泡灌洗液中总细胞数及NEU、EOS、LYM的生成,并升高肺组织中IFN-γ水平的同时降低IL-4的水平;Western blot结果显示,牛蒡子苷元增加SIRT1蛋白表达同时抑制NLRP3、caspase-1、IL-18和IL-1β蛋白表达;免疫荧光结果显示,牛蒡子苷元可以减弱肺组织NLRP3的荧光强度。结论牛蒡子苷元通过SIRT1/NLRP3途径减轻哮喘小鼠气道炎症。

人参皂苷Rh2通过VEGF/MMP-9信号通路抑制哮喘小鼠气道重塑的实验研究

目的:探讨人参皂苷Rh2对支气管哮喘小鼠气道重塑及VEGF和MMP-9信号通路的影响。方法:60只清洁级雌性BABL/c小鼠,随机数字表法分为6组,每组10只,分别为A组为生理盐水对照组、B组为卵蛋白(OVA)哮喘组、C组为人参皂苷Rh2低剂量组、D组人参皂苷Rh2高剂量组、E组为SU5416治疗组、F组为地塞米松治疗组。在末次激发24h后所有小鼠取左肺组织行苏木精-伊红(HE)染色、Masson三色染色、PAS染色。取右肺组织分别用酶联免疫吸附法(ELISA),RT-PCR和Westernblot检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-4、IL-5、IL-13含量以及VEGF和MMP-9 mRNA、蛋白表达。结果:哮喘模型组小鼠与对照组相比较BALF中炎症细胞计数、IL-4、IL-5、IL-13水平增高;肺组织VEGF和MMP-9 mRNA、蛋白表达水平均显著高于对照组(P<0.01)。人参皂苷Rh2干预组小鼠与哮喘模型组相比较BALF中炎症细胞计数、IL-4、IL-5、IL-13水平,VEGF和MMP-9 mRNA、蛋白表达水平均显著降低,具有显著差异(P<0.01),但2个不同治疗组之间上述各指标间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:人参皂苷Rh2可抑制哮喘小鼠气道重塑的发生,其机制有可能部分是通过抑制VEGF/MMP-9信号通路而实现的。

芦根乙醇提取物对糖尿病小鼠肝糖原含量及糖原合成酶的影响

目的探讨芦根乙醇提取物对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠肝糖原含量及糖原合成酶(GS)的影响。方法正常对照组小鼠10只,糖尿病小鼠随机分为模型对照组、高剂量组和低剂量组,每组10只。应用组织化学糖原(PAS)染色法检测各组小鼠肝糖原含量,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(Western-blot)法检测各组实验小鼠肝脏GS mRNA和蛋白的表达。结果 PAS染色后模型对照组肝糖原含量明显减少,低剂量组、高剂量组较模型对照组明显增多(P<0.01),其中高剂量组最为明显;模型对照组GS mRNA和GS蛋白均低于其他3组,低剂量组低于高剂量组(P<0.05)。结论芦根乙醇提取物对糖尿病小鼠肝糖原含量具有正向促进作用,其机制可能是通过提高肝糖原合成酶的表达而起作用。

人参皂甙经PI3K/AKT通路诱导乳腺癌细胞凋亡

目的探讨人参皂甙Rg3经磷脂酰肌醇-3激酶／蛋白激酶B（P13K／AKT）通路对人乳腺癌MCF7／Adr细胞的诱导凋亡作用。方法不同浓度人参皂甙Rg3作用于人乳腺癌MCF7／Adr细胞24～72h后，MTT法检测细胞活力；荧光显微镜下观察细胞核的形态学改变；流式细胞术检测细胞凋亡率；Westernblot法检测P13K、AKT的表达。结果人参皂甙R加对人乳腺癌MCF7／Adr细胞的生长有明显的增殖抑制作用，呈浓度和时间依赖性。经荧光染色后可观察到典型的凋亡小体，细胞凋亡率明显增高，MCF7／Adr细胞P13K、AKT表达均明显减弱。结论人参皂甙Rg3能诱导体外培养的人MCF7／Adr细胞凋亡，抑制P13K、AKT活性是人参皂甙Rg3诱导MCF7／Adr细胞凋亡的重要机制之一。

商陆皂苷甲对哮喘小鼠气道炎症的缓解作用及对肺组织中IL-6和STAT3表达水平的影响

目的:探讨商陆皂苷甲(EsA)对卵清蛋白(OVA)诱导哮喘小鼠气道炎症的药理作用,并阐明其作用机制。方法:40只清洁级BALB/c雌性小鼠随机分为空白对照组、OVA组、低剂量EsA组和高剂量EsA组,每组10只;除空白对照组外,其他组小鼠用腹腔注射致敏,分别在第1、7和14天致敏,从第21天开始采用1%OVA激发,每1 d为1个激发周期,每个激发周期激发1次,共进行3次;空白对照组和OVA组小鼠应用生理盐水0.2 mL灌胃给药,低剂量EsA组和高剂量EsA组小鼠分别按照10和20 mg·kg-1灌胃给药,从第17天开始连续给药7 d,每天1次。采用HE染色法观察各组小鼠肺组织形态表现,直接计数法计算各组小鼠肺泡灌洗液(BALF)中总炎症细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数量,流式细胞术检测BALF中嗜酸性粒细胞、白细胞介素4(IL-4)和干扰素γ(IFN-γ)水平,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测各组小鼠BALF中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,Western blotting法检测各组小鼠肺组织中白细胞介素6(IL-6)和信号传导及转录激活蛋白-3(STAT3)蛋白表达水平,免疫组织化学法和免疫荧光法检测各组小鼠肺组织中IL-6和STAT3蛋白表达量。结果:与空白对照组比较,OVA组小鼠肺组织支气管和血管周围炎性细胞浸润,支气管部分损伤;与OVA组比较,低和高剂量EsA组小鼠肺组织中炎性细胞浸润明显减轻,气道损伤缓解。与空白对照组比较,OVA组小鼠BALF中总炎症细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数量增加(P<0.05),IL-4、IL-1β和TNF-α水平升高(P<0.05或P<0.01),而IFN-γ水平降低(P<0.05);与OVA组比较,低和高剂量EsA组小鼠BALF中总炎症细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数量降低(P<0.05),IL-4、IL-1β和TNF-α水平降低(P<0.05或P<0.01),而IFN-γ水平升高(P<0.05)。与空白对照组比较,OVA组小鼠肺组织中IL-6和STAT3蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与OVA组比较,低和高剂量EsA组小鼠肺组织中IL-6和STAT3蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论:EsA可缓解哮喘小鼠气道炎症,其作用机制与调节IL-6和STAT3信号通路有关。

芝麻素通过PKCα/NF-κB信号途径抑制肥大细胞活化

目的:观察芝麻素对肥大细胞活化和炎症介质释放的影响并探讨其可能的作用机制。方法:体外培养HMC-1细胞,用10μg/ml的anti-DNP Ig E处理细胞6 h后,再用100 ng/ml的DNP-HAS孵育10 min诱导HMC-1细胞活化,在DNPHAS处理前给予最终浓度25、50和100μg/L芝麻素预处理30 min后光镜下观察芝麻素对肥大细胞脱颗粒的影响,ELISA法检测芝麻素对肥大细胞组胺、TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8释放的影响,Western blot方法观察芝麻素对FcεRI受体下游信号Lyn和Syk,PKCα激活,IκBα磷酸化和NF-κB活化的影响。结果:DNP-HAS能明显诱导HMC-1细胞脱颗粒,促进组胺和TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8等细胞因子的释放,激活FcεRI受体下游信号分子Lyn、Syk和PKCα,磷酸化IκBα,促进NF-κB活化(P<0.05)。芝麻素高(100μg/L)、中(50μg/L)浓度能明显抑制HMC-1细胞脱颗粒和炎症介质的释放,阻断FcεRI受体下游信号激活,抑制NF-κB活化(P<0.05)。结论:芝麻素通过PKCα/NF-κB途径抑制肥大细胞活化和炎症介质释放。

小班授课模式在组织学与胚胎学教学中的实践与体会

组织学与胚胎学是医学生普遍认为难学难记的专业基础课。为解决这一难题,相关教学方法的改革相继出现,并且在实际应用中得到良好的效果。为寻找一种符合自身特点的教学方法,我们综合了多种教学方法的长处,探索出了"小班授课模式"教学方法。该方法既能在主观上提高学生的学习能动性,又能在客观上最合理的利用学生的学习时间。经过对我院2015级医学各专业学生的实际教学应用,我们总结了部分经验和体会。

人参皂甙Rg3对人乳腺癌MDA-MB-231细胞生长的抑制作用及其机制

[目的]研究人参皂甙Rg3对人乳腺癌MDA-MB-231细胞生长的抑制作用及其机制.[方法]采用MTT比色法检测人参皂甙Rg3对人乳腺癌MDA-MB-231细胞生长的抑制作用.利用流式细胞仪检测细胞凋亡及周期变化.建立人乳腺癌MDA-MB-231细胞裸鼠移植瘤模型,观察不同浓度的人参皂甙Rg3对裸鼠的体质量及肿瘤增殖抑制率的影响.采用Western blot方法检测肿瘤组织中procaspase-3和procaspase-9蛋白表达水平.[结果]人参皂甙Rg3可明显抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长(P<0.05),且抑制作用呈剂量和时间依赖性;明显促进MDA-MB-231细胞凋亡(P<0.05),可将细胞周期阻滞于G0/G1期.人参皂甙Rg3对人乳腺癌细胞体内的增长具有明显的抑制作用,与对照组比较,人参皂甙Rg3各浓度组proCaspase-3和proCaspase-9蛋白表达水平均明显降低(P<0.05).[结论]人参皂甙Rg3在体内和体外均可抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞生长,机制认为可能与诱导细胞凋亡、改变细胞周期和Caspase-3,Caspase-9活化有关系.

磷酸二酯酶在C型钠尿肽抑制大鼠胃窦平滑肌自发性收缩运动中的作用

[目的]观察磷酸二酯酶(PDE)在C型钠尿肽(CNP)抑制大鼠胃窦平滑肌自发性收缩运动中的作用.[方法]制作离体大鼠胃窦环行平滑肌条灌流模型,给予CNP及PDE非选择性抑制剂IBMX后观察胃窦平滑肌自发性收缩运动的变化,并利用ELISA法测定灌流液中环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)含量.[结果]CNP可明显抑制大鼠胃窦平滑肌的收缩,经CNP作用后cAMP及cGMP含量均明显增高(P<0.05);经PDE非选择性抑制剂IBMX作用后,CNP对胃窦平滑肌自发性收缩运动的抑制作用明显减弱(P<0.01),给予PDE非选择性抑制剂IBMX作用同时给予CNP,cGMP含量明显增高(P<0.01),但cAMP水平无明显改变(P>0.05).[结论]在胃窦平滑肌组织,经CNP作用后生成的cGMP可通过调节PDE从而提高胃组织中cAMP水平,提示PDE参与CNP对胃窦平滑肌自发性收缩运动的抑制效应.

定点突变去除抗乙酰胆碱受体抗体的补体结合功能

[目的]制备无补体结合功能的免疫球蛋白样抗乙酰胆碱受体抗体,用于重症肌无力的特异性免疫治疗.[方法]应用定点突变技术,将致病性抗乙酰胆碱受体抗体IgG 637的重链CH 2区的第322位氨基酸进行K 322 A突变,获得的突变型抗体IgG 637/K 322 A基因经转化大肠杆菌XL 1-Blue进行增殖,测定序列证实为突变序列,转染哺乳类细胞CHO-k 1进行表达,其产物经酶联免疫吸附试验检测与补体C 1 q的结合活性.[结果]突变型抗乙酰胆碱受体抗体IgG 637/K 322 A不能与补体C 1 q结合,而对照抗体IgG 637可与补体结合.[结论]经定点突变,成功地获得了失去补体结合功能的抗乙酰胆碱受体抗体.

芦根乙醇提取物对糖尿病小鼠肝脏线粒体氧化应激的干预作用

[目的]探讨芦根乙醇提取物对糖尿病小鼠肝脏线粒体氧化应激的影响.[方法]采用链脲佐菌素腹腔注射方法制作糖尿病小鼠模型,将实验小鼠分为正常对照组、模型对照组、芦根乙醇提取物大、中、小剂量组.芦根乙醇提取物大、中、小剂量组小鼠分别灌胃给予5.00,2.50,1.25g/kg芦根乙醇提取物,每日1次,5周后检测各组小鼠肝脏线粒体丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)水平及Na+-K+-ATPase,Ca2+-Mg2+-ATPase活性.[结果]模型对照组MDA水平明显高于正常对照组(P<0.01),而模型对照组SOD水平及Na+-K+-ATPase,Ca2+-Mg2+-ATPase活性则显著低于正常对照组(P<0.05);芦根乙醇提取物大、中剂量组MDA水平较模型对照组明显下降(P<0.05,P<0.01),SOD及Na+-K+-ATPase,Ca2+-Mg2+-ATPase活性明显升高(P<0.05,P<0.01).[结论]糖尿病小鼠肝脏出现线粒体氧化应激变化,芦根乙醇提取物对此变化具有一定的改善作用.

重症肌无力单链抗体A7基因在毕赤酵母中的表达

[目的]将抗乙酰胆碱受体单链抗体(ScFv)A 7基因转化至毕赤酵母GS 115,筛选阳性转化子并诱导蛋白表达,制备单链抗体A 7蛋白.[方法]将构建的含有抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的重组真核表达载体pPIC 9 K-ScFv A 7经SalⅠ酶切线性化后,利用电转化方法转化受体毕赤酵母菌GS 115,以甲醇诱导蛋白表达,应用鼠抗c-myc单克隆抗体进行斑点杂交试验,检查所表达的单链抗体A 7蛋白.[结果]在酵母菌的培养上清液中发现单链抗体A 7蛋白的表达,而阴性对照菌中未见表达产物.[结论]抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7蛋白已成功地在真核表达系统中表达.

“互联网+”背景下组织学与胚胎学教学模式的改革与思考

2016年教育部发布的《教育信息化“十三五”规划》中指出,要依托信息技术营造信息化教学环境,促进教育理念、教学模式和教学内容改革,以适应信息时代对培养高素质人才的需求^([1]).基于“互联网+”的多元化教学是近年来应用较为广泛的新型教学改革模式^([2-4]).如何在互联网模式下将传统课堂教学的直接优势性与信息网络技术背景下线上学生自学的便捷性进行有机结合以构建一种全新的多元化教学已成为高等教育改革的新课题.

丹皮酚对脂多糖刺激气道上皮细胞的影响

[目的]探讨丹皮酚对脂多糖(LPS)所刺激气道上皮细胞的影响及其作用机制.[方法]采用流式细胞术检测以15、30μmol/L丹皮酚预处理经LPS刺激的16HBE细胞ROS的表达水平及细胞凋亡情况,采用Western blot法检测细胞色素C(Cyt-C)、caspase-9、caspase-3、Bax及Bcl-2的表达水平.[结果]与LPS组比较,丹皮酚低剂量和高剂量组LPS刺激16HBE细胞中ROS的表达均显著降低(P<0.05)、细胞早期和晚期凋亡率(P<0.05)及细胞胞浆中Cyt-C蛋白表达水平均显著降低(P<0.01),线粒体中Cyt-C蛋白表达水平显著升高(P<0.01);丹皮酚显著降低LPS刺激16HBE细胞中caspase-9、caspase-3的表达(P<0.01)及促凋亡蛋白Bax的表达(P<0.01),明显升高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(P<0.05).[结论]丹皮酚通过抑制线粒体凋亡通路减轻LPS刺激对气道上皮细胞的影响.

糖尿病胃动力障碍大鼠胃窦平滑肌组织中CNP和NPR-B蛋白含量变化

目的探讨糖尿病胃动力障碍大鼠胃窦平滑肌组织中C型钠尿肽(CNP)和B型钠尿肽受体(NPR-B)的蛋白含量变化。方法腹腔注射链脲佐菌素(STZ)(65 mg/kg)4周,制备糖尿病动物模型。利用多道生理信号记录系统记录糖尿病大鼠胃窦平滑肌收缩活动,将发生胃窦平滑肌收缩活动紊乱的大鼠列入糖尿病胃动力障碍模型。采用免疫组织化学方法观察糖尿病大鼠胃窦平滑肌中CNP和NPR-B的分布。结果糖尿病胃动力障碍组大鼠与正常对照组相比胃窦平滑肌组织CNP表达无明显差异,但NPR-B表达明显增多(P<0.01)。结论糖尿病大鼠发生胃动力障碍可能与胃窦平滑肌中NPR-B上调有关,提示糖尿病大鼠胃CNP-NPR-B/pGC-cGMP转导系统的改变可能参与胃动力障碍的发生。

糖尿病胃动力障碍大鼠胃窦平滑肌中PDE2和PDE3蛋白表达变化

为了观察糖尿病胃动力障碍大鼠胃窦平滑肌组织中PDE2和PDE3的蛋白含量变化,由腹腔注射STZ制备糖尿病动物模型,利用多道生理信号记录系统记录糖尿病大鼠胃窦平滑肌收缩活动,将发生胃窦平滑肌收缩活动紊乱的大鼠列入糖尿病胃动力障碍模型,再采用免疫组织化学方法观察糖尿病胃动力障碍组大鼠胃窦平滑肌中PDE2和PDE3的分布。结果发现,糖尿病发病胃动力障碍大鼠与正常对照组相比,胃窦平滑肌组织PDE2表达无明显差异,但PDE3表达明显减少(P<0.05)。因此,糖尿病大鼠发生胃动力障碍可能与胃窦平滑肌中PDE3下调有关,糖尿病大鼠胃c GMP-PDE3的改变可能参与胃动力障碍的发生。

LY294002联合Znpp IX对人乳腺癌细胞增殖及侵袭能力的影响

[目的]探讨PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002联合血红素加氧酶-1(HO-1)抑制剂Znpp IX对人乳腺癌MCF7/Adr细胞增殖及侵袭能力的影响.[方法]将Znpp IX(0.625~10.000μmol/L)与LY294002(5~80μmol/L)单独或联合应用于人乳腺癌MCF7/Adr细胞,用MTT法检测药物对MCF7/Adr细胞增殖的影响.实验分为对照组、LY294002组(10μmol/L)、Znpp IX组(1.250μmol/L)和联合用药组(LY294002 10μmol/L+Znpp IX1.250μmol/L),用Transwell小室测定各组MCF7/Adr细胞的侵袭力和迁移力,Western blot法检测Akt,p-Akt和HO-1蛋白的表达水平.[结果]联合用药组、LY294002组及Znpp IX组MCF7/Adr细胞的增殖抑制率分别为58.60%±3.24%,42.50%±2.44%和39.70%±3.21%,联合用药组MCF7/Adr细胞的增殖抑制率明显高于LY294002组和Znpp IX组(P<0.05).LY294002和Znpp IX单独或联合应用均可显著抑制人乳腺癌MCF7/Adr细胞的侵袭和转移(P<0.05),其中联合用药组抑制作用显著优于LY294002组和Znpp IX组(P<0.05).Western blot检测结果显示,各组Akt蛋白表达水平间差异无统计学意义(P>0.05);LY294002组p-Akt,HO-1表达水平均明显低于对照组(P<0.05),Znpp IX组HO-1表达水平明显低于对照组(P<0.05),与LY294002组和Znpp IX组比较,联合用药组p-Akt,HO-1水平均明显降低(P<0.05).[结论]Znpp IX和LY294002单独应用均可抑制人乳腺癌MCF7/Adr细胞的增殖、侵袭及转移,联合应用时作用加强,提示Znpp IX和LY294002联合应用具有协同增效作用.

重组乙酰胆碱受体α亚单位-BirA识别多肽序列基因的构建与表达

[目的]构建重组乙酰胆碱受体亚单位-BirA识别多肽序列基因(pcDNA 3.1-AChR-αBirA),并对其进行真核基因表达.[方法]设计引物生物素蛋白连接酶(BirA)识别多肽序列基因,将载体pcDNA3.1-AChR-αBirA识别多肽序列基因连接,并用EcoRⅤ单酶切检查BirA识别多肽序列基因插入的正确性,并测定序列进行验证.将构建成功的载体在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞上进行表达,经激光扫描共聚焦显微镜验证其产物.[结果]电泳检查可见大小为63 bp的条带,经测定序列验证了插入的基因序列为BirA识别多肽序列基因;转染后经激光扫描共聚焦显微镜观察到CHO细胞膜上的绿色荧光.[结论]成功构建了AChR-αBirA识别多肽序列基因重组载体,并可在CHO细胞中较好地表达.