牛内皮细胞生长因子提取物对培养细胞的作用

从牛脑组织中制备了内皮细胞生长因子粗品(ECGS)和纯品(β-ECGF)。实验结果表明,β-ECGF具有显著的促进内皮细胞生长的作用,它的分子量约为70kd,等电点为4～6,ECGS按100μg/ml加入培养基中,可使人的脐静脉内皮细胞传20代以上,血清用量可节省50％,细胞能够克隆、冷冻和复苏。

胰岛移植研究进展

胰岛移植已经成为治疗胰岛素依赖型糖尿病的一种有效方法。并且有实验资料显示，胰岛移植不仅能够纠正糖代谢的紊乱，

血脑屏障体外实验模型的建立

目的 :应用培养的CBA/J小鼠脑血管内皮细胞 (brainmicrovascularendothelialcells,BMVEC)构建血脑屏障(blood brainbarrier,BBB)的体外实验模型。方法 :将BMVEC种植在明胶包被的 2 4孔板细胞插入器的微孔滤膜上培养至汇合状态 ,通过 4h液面渗漏实验、扫描和透射电镜、血脑屏障形成前后膜两侧的电阻以及辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase ,HRP)的通透性和RMP 7对血脑屏障通透性的调控作用来证实BBB的形成。结果 :BMVEC培养至汇合后 ,4h液面渗漏实验成为阳性 ;扫描电镜显示细胞形成单层 ,透射电镜证实细胞间形成紧密连接 ;跨细胞电阻 (thetransendothelialelectricalresistance ,TEER)分别为汇合前和人脐静脉内皮细胞的 3.2倍和 7.7倍 ;对HRP的通透率分别为前对照组的 1 3.4 %和 6 .7% ;RMP 7处理使HRP在BBB的通透率增加了 2 .7倍。结论 :构建的BBB体外模型在形态学、电阻和通透性方面具备了BBB的基本特性 。

KLF4对肿瘤干细胞自我更新和增殖潜能的影响

目的:分析Kr櫣ppel样因子4(Krppel-like factor4,KLF4)对肿瘤干细胞T3A-A3自我更新和增殖能力的影响。方法:构建靶向干扰KLF4的慢病毒载体pLVTHM-shKLF4,利用前期实验分离与鉴定的肿瘤干细胞T3A-A3,应用RT-PCR和Western blotting分别检测pLVTHM-shKLF4感染后T3A-A3细胞中KLF4mRNA和蛋白的表达。细胞球形成实验检测pLVTHM-shKLF4感染对T3A-A3细胞自我更新的影响,平板集落形成实验检测T3A-A3细胞的克隆形成能力,流式细胞术检测T3A-A3细胞周期变化。裸鼠皮下移植瘤实验观察pLVTHM-shKLF4干扰KLF4表达后对T3A-A3细胞移植瘤生长的影响。结果:与肝癌细胞BEL-7402、HepG2相比,肿瘤干细胞T3A-A3表达更高水平的KLF4;pLVTHM-shKLF4感染能够在mRNA和蛋白水平下调T3A-A3细胞中KLF4的表达。pLVTHM-shKLF4感染的T3A-A3细胞形成细胞球的直径明显小于对照病毒的pLVTHM-shNC感染的T3A-A3细胞[(104.33±16.28)vs(186.67±28.15)μm,P<0.01],pLVTHM-shKLF4感染细胞形成的细胞克隆数目明显少于对照细胞[(83.5±7.78)vs(125±9.19)个,P<0.01),pLVTHM-shKLF4感染的T3A-A3细胞G1期比例明显升高[(39.65±4.03)%vs(29.35±1.00)%,P<0.01]。pLVTHM-shKLF4感染的T3A-A3细胞的移植瘤生长速度较对照细胞移植瘤明显减慢[细胞接种33 d,(46.14±12.94)vs(228.12±94.86)mm3,P<0.01]。结论:干扰KLF4的表达可抑制肿瘤干细胞T3A-A3的自我更新及其在体内外的增殖潜能。

线粒体形态与细胞凋亡的关系

线粒体是高度动态的细胞器,其形态、数量以及在细胞内的分布经常发生变化,线粒体的融合/分裂率精确地调控细胞内线粒体的数目和形态。目前已知的与线粒体分裂有关的分子有Drp-1、Fis1、Mff、MTP18和Rab32,参与线粒体融合的分子有Mfn1/2和Opa1。线粒体的融合/分裂与细胞凋亡密切相关。最近报道凋亡早期出现线粒体网络的断裂和线粒体嵴的重塑,而且调控线粒体形态的蛋白参与了细胞凋亡,与凋亡调控有关的蛋白也影响线粒体的形态结构。因此,线粒体形态的变化与细胞凋亡密切相关,线粒体分裂过程增强可促进细胞凋亡的发生。本文将对线粒体的形态、线粒体的融合与分裂的调节及其与细胞凋亡的关系做一综述。

AGE-RAGE系统在糖尿病神经病变中的作用

糖尿病神经病变是糖尿病最常见的并发症之一,其确切发病机制目前还不是很清楚,但糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGE)的形成在糖尿病神经病变的发病机制中起到了至关重要的作用,本文仅就AGE的形成、AGE与糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)在糖尿病神经病变中的作用及针对AGE-RAGE系统的治疗做一综述。

补肾强督方对强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞产生MMP-9和TIMP-1的影响

目的:为探讨基质金属蛋白酶在强直性脊柱炎炎性骨破坏中的作用和补肾强督方治疗强直性脊柱炎的作用机制,比较强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞(PBMC)产生基质金属蛋白酶9(MMP-9)及基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)与健康对照者之间的差别,并研究补肾强督方治疗前后两者的变化。方法:2005年3月至2006年3月活动期强直性脊柱炎患者30例,其中男27例,女3例;年龄16～45岁,平均(30.8±8.8)岁;病程0.5～10年。经补肾强督方治疗3个月后,做自身前后对照,并设立健康对照组20例,常规分离血清和PBMC,将PBMC用PHA/PMA刺激后收集上清,应用RT-PCR检测PBMC的MMP-9和TIMP-1的mRNA表达水平,应用ELISA检测血清和细胞上清中MMP-9和TIMP-1的含量。结果:与健康对照组相比,患者治疗前血清中MMP-9和TIMP-1浓度明显升高,患者治疗后与治疗前相比MMP-9和TIMP-1浓度显著降低。经PHA/PMA刺激后,患者治疗前的PBMC表达MMP-9和TIMP-1mRNA水平明显上调,细胞上清液中MMP-9和TIMP-1量明显升高,与健康对照组相比差异有统计学意义。患者治疗后PBMC表达MMP-9和TIMP-1mRNA水平明显下调,细胞上清液中MMP-9和TIMP-1含量均显著下降,与治疗前相比差异有统计学意义。结论:强直性脊柱炎活动期患者的PBMC表达和释放MMP-9和TIMP-1增强。补肾强督方可以显著降低强直性脊柱炎活动期患者MMP-9和TIMP-1的产生。

胰腺干细胞体外诱导分化为胰岛素分泌细胞及对1型糖尿病模型鼠的治疗作用(英文)

背景：有实验证实人和动物起源的胚胎干细胞或成体干细胞可分化为胰岛素分泌细胞，但其分泌胰岛素的功能及对实验性糖尿病的治疗价值尚需要验证。目的：观察从大鼠的胰腺组织分离纯化干细胞在体外将诱导分化胰岛素分泌细胞后胰岛素mRNA的表达、分泌胰岛素的能力及对1型糖尿病模型鼠的治疗作用。设计：随机对照观察。单位：中日友好医院临床医学研究所。材料：实验于2004-08／2007—12在北京中日友好医院临床医学研究所病理生理研究室完成。选用8—10周龄雄性SD大鼠及雌性裸鼠各10只，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。尼克酰胺、链脲菌素均为Sigma公司产品，nestin抗体为BD Biosciences产品。大鼠胰岛素放射免疫检测试剂盒购自Linco research。胰岛素抗体及胰高糖素抗体为Santa Cruz产品。方法：应用nestin结合的免疫磁珠从SD大鼠胰腺导管细胞中分离和纯化干细胞，经体外扩增及诱导分化形成胰岛素分泌细胞。①采用RT-PCR法检测细胞分化过程中胰岛素mRNA的表达。②将干细胞经诱导分化形成的胰岛进行冰冻切片，采用免疫荧光染色观察胰岛素及胰高糖素阳性细胞表达。③对干细胞分化胰岛的胰岛素释放功能进行评价，放射免疫法测定上清中胰岛素检测干细胞分化形成的胰岛分泌胰岛素的能力。④鼠按220mg／kg链脲菌素腹腔注射法制备为1型糖尿病模型，造模后随机摸球分为天然胰岛组及干细胞胰岛组，每组5只。将大鼠天然胰岛（SD大鼠分离）及干细胞分化形成的胰岛分别移植于糖尿病裸鼠左肾包膜下，观察移植后鼠尾静脉血糖变化。主要观察指标：①细胞分化过程胰岛素mRNA表达。②胰岛样结构中胰岛素及胰高糖素阳性细胞表达。③干细胞分化形成的胰岛分泌胰岛素情况。④移植后鼠尾静脉血糖变化。结果：①RT-PCR检测结果表明胰岛素mRNA的表达随诱导时间延长而明显升高。②免疫荧光染色结果显示胰岛结构的中间存在大量胰岛素阳性细胞，胰高糖素阳性细胞主要分布于胰岛样结构的周边。③干细胞分化的胰岛在高浓度葡萄糖刺激后明显缺乏快速相的胰岛素释放，而是表现细胞外上清中胰岛素浓度的缓慢升高。④天然胰岛组移植后3d使血糖降低到10mmol／L以下，至观察到60d仍维持在正常水平；干细胞胰岛在移植后8d使血糖降低至10mmol／L以下，且在移植35d后血糖逐渐升高并恢复到胰岛移植前的水平。结论：大鼠胰腺干细胞经体外扩增和诱导分化后可分化胰岛素分泌细胞，但对葡萄糖的刺激没有快速相的胰岛素分泌。将胰岛素分泌细胞移植到1型糖尿病模型裸鼠后可一定程度地改善糖代谢的紊乱。

肿瘤血管内皮细胞的免疫学特性

在肿瘤的发展过程中,肿瘤血管起到极为重要的作用,不仅为肿瘤提供营养、而且为肿瘤的转移提供了途径。由于肿瘤血管内皮细胞长期处于肿瘤微环境中,其表型及功能特性都发生了明显的变化,其中包括某些免疫学特性的改变,例如内皮细胞粘附分子表达水平降低、白细胞粘附作用减弱、抗原递呈功能不良、抗自由基损伤能力增强、合成大量的细胞外基质等。由于肿瘤血管内皮细胞是免疫细胞和免疫治疗药物进入肿瘤组织的第一道屏障,因此肿瘤血管内皮细胞的免疫学特性可能与肿瘤细胞逃避免疫监视、抵抗免疫杀伤有关。本文简要综述有关肿瘤血管内皮细胞免疫学特性,并分析这些特性与肿瘤免疫逃逸的关系。

MGMT在神经胶质瘤中表达的临床意义及联合应用STZ对愈后的影响

目的:通过观察神经胶质瘤中O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6methylguanineDNAmethyltransferaseMGMT)的表达状态,探讨MGMT在胶质瘤中的表达与亚硝脲(ACNU/BCNU)耐药之间的关系;同时对于部分MGMT阳性患者给予链脲菌素(STZ)联合ACNU/BCNU治疗,观察疗效。方法:采用免疫组化法对神经胶质瘤石蜡标本检测MGMT,并与临床亚硝脲的随访结果进行比较;对8例MGMT阳性率高且对亚硝脲治疗无效的难治性脑瘤患者,开展STZ联合ACNU治疗。结果:68例神经胶质瘤,MGMT表达的总阳性率为55.9%。在使用亚硝脲治疗的患者中,除8例加用STZ联合治疗外,余60例中,27例MGMT(-)者,使用ACNU治疗绝大部分有效;30例MGMT(+～++)者,使用ACNU治疗后绝大部分复发或死亡,表明MGMT表达与亚硝脲化疗呈负相关;另外8例MGMT阳性患者在进行了STZ联合ACNU治疗后,1例可测肿瘤全部消失,2例肿瘤体积缩小在50%以上,4例肿瘤体积消退<50%,1例无效。结论:MGMT阳性的胶质瘤患者比MGMT阴性的患者明显耐药,且耐药程度与MGMT表达强度无关,仅与其是否阳性有关。对于MGMT阳性患者,可选择ACNU/BCNU联合STZ使用,以提高亚硝脲的疗效。因此,化疗前检测胶质瘤MGMT的表达情况,预测化疗敏感性,对指导临床化疗具有重要意义。

胰腺干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的实验研究

目的研究大鼠胰腺组织干细胞向胰岛内分泌细胞分化及其在实验性糖尿病治疗中的应用。方法应用Nestin结合的免疫磁珠从大鼠胰腺导管细胞中分离和纯化干细胞,经体外扩增及诱导分化形成胰岛样结构,进行体外和体内的功能评价。结果大鼠胰腺干细胞经体外扩增和诱导分化后,表达胰岛素mRNA,并形成胰岛样结构。免疫荧光染色显示胰岛结构内含有大量胰岛素阳性细胞和少量胰高糖素阳性细胞。在葡萄糖刺激下干细胞分化出胰岛,有胰岛素释放,其释放量约为正常胰岛的39.4%。将干细胞分化来的胰岛移植到免疫缺陷的糖尿病小鼠后可以明显改善糖代谢的紊乱。结论胰腺组织干细胞可以在体外诱导分化成为具有治疗糖尿病功能的胰岛细胞。

靶向肿瘤血管内皮细胞抑制人肝癌移植瘤生长的功能性抗体的研制

背景与目的:肿瘤的生长依赖于新生血管形成,阻断其血管形成可有效治疗肿瘤。本研究旨在研制抗人肝癌血管内皮细胞的功能性单克隆抗体,确定其抑制人肝癌移植瘤生长的作用。方法:用从新鲜人肝癌组织中分离、鉴定、培养的人肝癌血管内皮细胞免疫10只BALB/c小鼠。免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后采用甲基纤维素选择培养。使用活细胞免疫荧光、细胞增殖、内皮成管实验及“人源化血管”动物模型体内抑瘤实验筛选和鉴定有治疗潜力的功能性抗体。结果:细胞融合产生1442个单个集落的杂交瘤株,获得119株阳性克隆,其中53株是具有抑制人肝癌血管内皮细胞增殖、成管的功能性抗体,2株被证实能抑制人肝癌移植瘤在BALB/c裸鼠体内的生长,抑瘤率为66.7%～76.5%。结论:建立了高通量制备、筛选、鉴定内皮细胞功能性单抗技术,获得了2株具有靶向血管内皮细胞抑制人肝癌移植瘤生长的功能性单抗。

抑制食管癌与肺血管内皮黏附的功能性抗体的制备

目的制备抑制食管癌细胞与肺血管内皮黏附的功能性单克隆抗体,为研究食管癌转移的靶向治疗剂打下基础。方法以人食管癌新鲜组织分离的肿瘤细胞免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后,采用活细胞荧光、ELISA、免疫组化、肿瘤细胞-内皮细胞黏附实验、Weasternbloting等方法筛选并鉴定抑制肿瘤细胞黏附的功能性单克隆抗体。结果共融合获得了1134株杂交瘤克隆,在能与食管癌细胞膜反应的486株克隆中,有294株与正常食管上皮不反应或低反应;筛选到15株单抗显著地抑制食管癌细胞与人正常肺血管内皮黏附,其中2株单抗识别的黏附分子相对分子质量分别为30000和60000。结论成功获得了多株具有抑制食管癌细胞与肺血管内皮黏附的功能性抗体,其中2株单抗具有治疗食管癌转移的潜在应用价值。

C肽对GK大鼠糖尿病肾病的影响

目的研究C肽对糖尿病肾病GK大鼠肾脏病理和肾脏功能的影响及相关机制。方法 SPF级自发性糖尿病GK大鼠,在糖尿病发病并且24小时尿蛋白超过300mg后,随机分为3组:C肽治疗组、空白对照组和胰岛素治疗组,每组8只,持续治疗12周。以同龄的正常Wistar大鼠作为正常组。治疗前及治疗后每4周检测各组大鼠血糖、24小时尿蛋白以及24小时尿白蛋白。治疗结束后,取各组大鼠肾脏,透射电子显微镜观察大鼠肾脏肾小球病理改变。采用实时定量PCR、western blot以及免疫组织化学的方法检测肾小球RAGE、PKC-β和PKA的表达。采用单因素方差分析评价各组间的差异。结果与正常组相比,空白对照组的血糖、24小时尿蛋白和24小时尿白蛋白都明显升高;虽然C肽治疗组大鼠的血糖没有明显改变,但24小时尿蛋白和24小时尿白蛋白与空白对照组相比都明显减少;胰岛素治疗组的血糖明显降低,但24小时尿蛋白和24小时尿白蛋白与空白对照组相比没有明显差异。病理学检查显示,与空白对照组相比,C肽治疗组大鼠的肾小球硬化、肾小球系膜增生、基底膜厚度和足细胞的形态都明显改善,而胰岛素治疗不具有类似的作用。实时定量PCR、western blot和免疫组织化学结果显示,C肽能够显著下调RAGE和PKC-β在糖尿病肾病大鼠肾小球的表达,并显著上调PKA的表达;而胰岛素仅能明显下调RAGE,对PKC、PKA的表达没有明显调节作用。结论 C肽可能通过下调肾小球毛细血管RAGE、PKC-β的表达和上调PKA的表达而改善GK大鼠的糖尿病肾病。

神经生长因子脂质体跨血脑屏障体内外研究

目的 研究神经生长因子 (nervegrowthfactor,NGF)脂质体在体外血脑屏障 (blood brainbarrier,BBB)模型上的通透性以及在体内脑组织的分布 ,并对体内外结果进行相关性分析。方法 用小鼠脑微血管内皮细胞 (BMVEC)建立的BBB体外实验模型 ,研究NGF脂质体在体外模型上的通透率 ;1 2 5I NGF和SDS PAGE法联合使用研究NGF脂质体在脑组织的分布。结果 NGF脂质体的最高包封率为 34% ,平均粒径小于 10 0nm。脂质体能够增加NGF在BBB模型上的通透率 ,以NGF SSL T为最大。脑组织药物浓度次序为NGF SSL T >NGF SSL +RMP 7>NGF SSL。体内外结果具有良好相关性。结论 脂质体能够增加NGF跨越BBB的能力 ,RMP 7偶联在脂质体上 (NGF SSL T)效果好于RMP 7与脂质体的简单混合 (NGF SSL +RMP 7)。

体外血脑屏障模型的建立与鉴定

目的应用原代分离培养BALB/c小鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMVEC)建立体外血脑屏障模型,探讨跨血脑屏障(blood brainb arrier,BBB)电阻与屏障渗透功能的动态关系以及最佳构建条件。方法用酶消化、机械分离结合密度离心的方法得到原代BALB/c小鼠脑血管内皮细胞,通过培养在具有特殊质材和孔径的Transwell小室上建立BBB体外实验模型,采用倒置显微镜、电镜观察细胞形态结构和生长规律,紧密连接ZO-1蛋白免疫组化检测,比较血脑屏障形成前后膜两侧电阻动态变化与3H葡萄糖通透性的关系等方法,探讨血脑屏障模型的建立及生长特性。结果BMVEC培养至汇合后具有典型的"铺路石"样外观;扫描电镜显示细胞形成致密单层,透射电镜、ZO-1蛋白免疫组化证实细胞间形成光滑、连续、高密度的紧密连接;3H葡萄糖的通透量与实时电阻呈负相关,内皮细胞电阻随着通透性的增加而降低,通透率最低时跨细胞电阻为(346±10)Ω/cm2。结论建立的BBB体外模型在形态学、电阻和通透性方面具备了BBB的基本特性。

清开灵注射液对血脑屏障模型通透性的影响

目的通过观察清开灵注射液对血脑屏障(BBB)模型通透性的影响,探究其抗脑缺血再灌注损伤作用的可能机制及靶点。方法采用细胞插入器培养单层脑微血管内皮细胞,建立体外BBB模型,三气培养箱中1%O2模拟缺氧培养24 h,分为正常组、缺氧组、清开灵小剂量组和大剂量组,通过对跨内皮细胞电阻(TEER)和辣根过氧化物酶(HRP)透过率的测定,观察清开灵注射液对缺氧损伤BBB通透性的影响。结果清开灵注射液可改善缺氧对BBB造成的损伤,提高TEER,降低跨内皮细胞通透性,并且有剂量依赖的趋势,清开灵注射液大剂量组与缺氧组比较,差异有统计学意义(P<0.01),清开灵注射液小剂量组改善作用虽不如大剂量组显著,但亦能减少HRP透过BBB(P<0.05)。结论清开灵注射液能有效改善缺氧损伤造成的BBB功能受损。

胰岛α细胞对β细胞功能的影响

众多研究表明,胰岛移植的短期效果较显著,但长期效果仍不尽人意。在胰岛移植的早期,绝大多数病人可以获得明显的治疗效果,而后大多数的病人发生进行性的胰岛功能丧失,产生这种现象的原因至今仍不甚明了。如何解决移植胰岛的长期存活问题对于胰岛移植的临床应用至关重要。近年来人们对胰岛移植失败的原因进行了不断探索,发现胰岛移植后期的失败不仅与免疫反应有关,而且与移植物的细胞组成有密切关系,即胰岛细胞间的相互作用对移植物的功能维持可能有重要影响。因此,本文就胰岛α细胞及其分泌的胰高血糖素对β细胞功能的影响作一综述。

TNF-αⅠ型受体对小鼠脑血管内皮细胞iNOS和HO-1基因表达的影响

目的探讨TNFαⅠ型受体(TNFR1)对小鼠脑血管内皮细胞iNOS、HO1基因表达水平的影响。方法体外培养TNFR1基因敲除的小鼠脑血管内皮细胞(BVECTNFR1)和野生型小鼠脑血管内皮细胞(BVEC),分别给予5ngmLTNFα刺激24h后,用实时荧光定量PCR技术及Westernblot方法检测两种细胞iNOS基因和HO1mRNA和蛋白表达量。结果给予TNFα刺激后,iNOSmRNA和蛋白表达仅在野生型脑血管内皮细胞内明显增高,而在受体敲除脑血管内皮细胞无明显变化。HO1mRNA和蛋白表达量在野生型小鼠脑血管内皮细胞和受体敲除小鼠脑血管内皮细胞均明显增高。结论TNFα可能作用于脑血管内皮细胞TNFR1,增加iNOS表达,HO1表达增高并非由TNFR1介导,而由TNFα的其他受体介导。