CCR8在卵巢癌浸润性Treg上的表达与意义

目的:分析趋化因子受体8(C⁃C motif chemokine receptor 8,CCR8)在卵巢癌肿瘤浸润性调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)中的表达,探讨CCR8对Treg分化的作用。方法:构建C57BL/6小鼠卵巢癌细胞ID8荷瘤模型;流式细胞术检测小鼠肿瘤组织、脾脏和外周血中Treg上CCR8的表达比例,CCR8^(+)Treg上免疫检查点相关蛋白程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD⁃1)、细胞素性T淋巴细胞抗原4(cytotoxic T⁃lymphocyte antigen 4,CTLA⁃4)、可诱导的T细胞共刺激分子(inducible T cell costimulators,ICOS)、淋巴细胞激活基因3(lymphocyte activation gene 3,LAG⁃3)的表达;流式细胞术检测CCR8变构抑制剂AZ084加入前后对C57BL/6小鼠脾脏中初始CD4^(+)T细胞向Treg分化的影响。结果:卵巢癌荷瘤小鼠肿瘤中Treg上的CCR8表达相比脾脏、外周血的Treg显著增高;相比CCR8^(-)Treg,CCR8^(+)Treg上免疫检查点相关蛋白表达更高;AZ084有效抑制小鼠脾脏中初始CD4^(+)T细胞向Treg的分化。结论:CCR8^(+)Treg在肿瘤浸润性Treg中占主要比例,CCR8作为卵巢癌浸润性Treg的主要标志物,变构CCR8蛋白可以抑制Treg的分化。靶向消除CCR8^(+)Treg可为改善卵巢癌肿瘤微环境的免疫抑制状态提供新思路。

基于多学科交叉的染色体分析实验带教的PDCA模式应用

医学遗传学课程是研究遗传因素在人类疾病进展过程中的遗传学分支学科,是连接基础医学与临床医学学科的桥梁课程。遗传学实验课程则是培养医学检验专业学生动手能力的一门重要的实践课程。染色体分析实验作为医学遗传学课程的重要组成部分,实践性、应用性较强,与临床染色体遗传疾病密切相关。高质量的实验教学是学生掌握染色体核型分析理论及实践的基础,也是系统学习人类染色体疾病的基础,但传统单一的教学模式已不能满足当下医学实验的教学要求。为了适应新形势,南京医科大学医学检验系对原有染色体实验教学模式进行改革,在多学科交叉背景下创造性地将PDCA理论应用到实验教学体系的管理中去,在学生个性化自主设计为主的基础上,构建全新的实验教学方法,优化完善染色体核型分析实验教学,最终提升了整体实验教学水平和教学效果。

术前D-二聚体、血小板/淋巴细胞比值对乳腺癌临床诊断及预后的预测价值

目的探讨D-二聚体、血小板/淋巴细胞比值(PLR)与乳腺癌患者临床特征及预后的关系。方法回顾性分析2018年9月至2020年3月于南京医科大学第一附属医院住院治疗的乳腺癌患者67例,选取同期体检健康者30例作为健康人对照组,检测两组血浆D-二聚体、血小板(PLT)及淋巴细胞(L)数值,并计算PLR。分析D-二聚体、PLR水平与乳腺癌患者临床特征及预后之间的关系。结果乳腺癌组术前D-二聚体[1.13(0.62,2.18)mg/L]、PLR[135.2(106.6,166.5)]水平显著高于健康人对照组[D-二聚体:0.35(0.16,0.59)mg/L,PLR:102.9(88.4,115.8),P均<0.001]。术后复发组的术前D-二聚体[1.39(0.78,2.33)mg/L、PLR152.2(118.0,169.3)]水平显著高于术后未复发组[D-二聚体:0.35(0.16,0.59)mg/L,PLR:102.9(88.4,115.8),P均<0.001]。D-二聚体用于乳腺癌筛查及区分乳腺癌复发的ROC下面积(AUC^(ROC))分别为0.891、0.724,PLR的AUC^(ROC)分别为0.735、0.689,二者联合的AUC^(ROC)分别为0.907、0.762。D-二聚体与乳腺癌淋巴结转移(P=0.02)、远处转移(P=0.03)显著相关,而PLR与淋巴结转移显著相关(P<0.001)。二者联合高值组的无病生存率(DFS)显著低于低值组(中位生存时间:24.8个月vs 30.5个月,P=0.048)。结论术前D-二聚体、PLR水平与乳腺癌的淋巴转移及远处转移显著相关,且可以预测乳腺癌患者的预后。

血清抗M型磷脂酶A2受体抗体对特发性膜性肾病的诊断价值

目的研究血清抗M型磷脂酶A2受体(PLA2R)抗体对特发性膜性肾病(IMN)的诊断价值。方法回顾性分析纳入2019年1月至2020年1月于南京医科大学第一附属医院住院且经肾组织活检病理诊断为IMN的75例患者的临床资料(IMN组)。另选取同期于本院住院治疗的35例非IMN的肾病患者(非IMN组)。采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测患者血清抗PLA2R抗体。比较2组血清、尿液中生化及免疫指标水平。结果IMN组血清抗PLA2R抗体水平、抗PLA2R抗体阳性率均显著高于非IMN组[101.30(56.90,219.80)RU/ml比1.36(1.24,8.34)RU/ml、97.3%(73/75)比11.4%(4/35)](均P<0.01)。2组血清总蛋白、白蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、IgA、IgM、补体C3、补体C4及尿游离κ轻链、尿游离λ轻链水平比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。Pearson相关性分析结果显示,IMN患者血清抗PLA2R抗体与尿游离κ轻链、尿游离λ轻链呈正相关(均P<0.01)。结论IMN患者血清抗PLA2R抗体水平显著升高,可作为特异性血清学检测指标。

血清胃蛋白酶原、胃泌素-17、CA19-9和CA72-4水平与不同类型胃炎和胃癌关系的分析

目的:探讨胃蛋白酶原(PGs)、胃泌素-17(G-17)及肿瘤标志物CA19-9、CA72-4与不同类型胃炎及胃癌的关系。方法:2016年8月至2019年3月在南京医科大学第一附属医院初次就诊,并确诊为浅表性胃炎、萎缩性胃炎及胃癌的患者纳入研究,分析比较PGs、G-17、CA19-9、CA72-4水平。结果:胃蛋白酶原Ⅰ(PGⅠ)在浅表性胃炎组[122.4(100.1,182.8)μg/L]显著高于胃癌组[69.1(41.7,116.9)μg/L,P<0.05]和萎缩性胃炎组[68(53.25,88.5)μg/L,P<0.001]。胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ)在浅表性胃炎组[13.9(8.9,21.9)μg/L]显著高于胃癌组[9.2(4.7,12.45)μg/L,P<0.001]和萎缩性胃炎组[7.6(5.9,12.1)μg/L,P<0.001];在胃癌组显著高于萎缩性胃炎组(P<0.001)。G-17在浅表性胃炎组、萎缩性胃炎组、胃癌组之间无显著性差异(P>0.05)。CA19-9在胃癌组[(36.93±17.84)kU/L]显著高于萎缩性胃炎组(P<0.05)和浅表性胃炎组(P<0.01);且CA19-9在萎缩性胃炎组[(22.04±14.33)kU/L]显著高于浅表性胃炎组(P<0.01)。CA72-4在胃癌组[(8.69±5.42)kU/L]显著高于浅表性胃炎组(P<0.01),且在萎缩性胃炎组[(8.02±2.18)kU/L]也显著高于浅表性胃炎组(P<0.01)。PGⅠ阳性率在胃癌组显著高于浅表性胃炎组(P<0.001),在萎缩性胃炎组显著低于浅表性胃炎组(P<0.05);PGⅡ阳性率在胃癌组、萎缩性胃炎组显著低于浅表性胃炎组(P<0.05或P<0.001);CA19-9阳性率在胃癌组显著高于萎缩性胃炎组和浅表性胃炎组(P<0.05)。PGR、G-17、CA72-4阳性率在3组之间无显著性差异(P>0.05)。结论:联合胃蛋白酶原、胃泌素-17、CA19-9、CA72-4指标检测,可对胃炎、胃癌的鉴别诊断提供帮助。

PBMC中TLR1、TLR2、TLR6在卵巢癌微环境中的作用研究

目的观察卵巢癌患者外周血单个核细胞(PBMC)与卵巢癌细胞共生长环境中,PBMC中Toll样受体(TLR)信号通路活化情况及前炎症细胞因子表达水平,研究TLR1、TLR2及TLR6在卵巢癌发生发展中的可能机制。方法采用密度梯度离心法分离PBMC,利用PBMC和卵巢癌细胞系SK-OV-3共培养体系及抗TLR1、TLR2、TLR6抗体中和实验,RT-PCR法检测细胞中前炎症细胞因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8,肿瘤坏死因子(TNF)-αmRNA表达水平;利用免疫印迹试验检测MyD88、TRAF6、TANK、核因子(NF)-κB和P-NF-κB的表达水平。结果卵巢癌患者PBMC+SK-OV-3Transwell共培养组较PBMC单独培养组,TLR信号通路蛋白MyD88、TRAF6、TANK及P-NF-κB表达上调,IL-1β、IL-6及IL-8前炎症细胞因子的mRNA表达水平明显增加(Fold=1.74,Fold=1.92,Fold=1.65,P<0.05),而TNF-a mRNA表达水平无明显改变;与PBMC单独培养组比较,良性疾病患者及健康对照者IL-1βmRNA表达水平明显下调(Fold=0.71,P<0.05;Fold=0.72,P<0.05),TNF-α、IL-6、IL-8mRNA及TLR信号通路蛋白MyD88、TRAF6、TANK及P-NF-κB均无明显改变。抗体中和实验显示,卵巢癌患者PBMC+SK-OV-3+Anti-hTLR1-IgG Transwell共培养组、PBMC+SK-OV-3+Anti-hTLR2-IgG Transwell共培养组、PBMC+SK-OV-3+Anti-hTLR6-IgG Transwell共培养组中前炎症细胞因子IL-1β(Fold=0.16,Fold=0.31,Fold=0.29,P<0.05)、IL-6(Fold=0.14,Fold=0.20,Fold=0.28,P<0.05)mRNA表达水平较PBMC+SK-OV-3Transwell共培养组明显下调。结论卵巢癌生长微环境中,TLR1/TLR2/TLR6介导的信号通路活化是诱导卵巢癌患者PBMC中前炎症细胞因子表达上调的主要途径,在卵巢癌的发生、发展中发挥一定作用。

卵巢癌患者外周血单个核细胞Toll样受体2的表达及其诱导的IL-10表达

目的:观察Toll样受体2(Toll-like receptors 2,TLR2)在卵巢癌患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中的表达及其诱导IL-10的表达水平,初步探索TLR2在卵巢癌发生发展中的作用机制。方法:收集20例卵巢癌患者、20例妇科良性疾病患者及20例同期健康体检女性EDTA抗凝外周全血,采用荧光定量PCR技术检测3组PBMC中TLR2的表达水平,并比较3组表达差异情况。TLR1、TLR2和TLR6相应配体刺激PBMC,细胞中细胞因子IL-10表达水平采用荧光定量PCR技术进行检测;流式细胞技术(FACS)检测各组IL-10分泌水平。结果:各组PBMC中TLR2均有表达;卵巢癌组PBMC中TLR2表达量显著高于良性疾病组和健康对照组(P<0.05),良性疾病组TLR2表达水平与健康对照组间无显著性差异;各组PBMC经TLR2的配体HKLM刺激24 h后,卵巢癌组IL-10 mRNA表达明显增强,分别为良性疾病组和健康对照组的2.25、2.33倍,妇科良性疾病组IL-10 mRNA表达水平与健康对照组间无显著差异;TLR6配体FSL-1刺激后,卵巢癌组IL-10mRNA表达水平分别为良性疾病组和健康对照组的1.95、2.16倍,差异具有统计学意义(P<0.05),而良性疾病组与健康对照组间无显著差异。FACS结果显示各组PBMC经TLR1的配体Pam3CSK4刺激24 h后,卵巢癌组、良性疾病组及健康对照组IL-10分泌水平中位值(M)分别为46.70、61.53、31.11 pg/ml,差异无统计学意义;经TLR2配体HKLM刺激24 h后,卵巢癌组IL-10分泌水平(M=150.46 pg/ml)显著高于良性疾病组(M=38.86 pg/ml)及健康对照组(M=44.93 pg/ml),差异有统计学意义(P<0.05),良性疾病组与健康对照组间无显著性改变;TLR6配体FSL-1刺激24 h后,卵巢癌组、良性疾病组及健康对照组IL-10分泌水平中位值分别为20.20、31.12、35.48 pg/ml,3组间无显著差异。结论:卵巢癌患者PBMC中TLR2表达水平显著增高,经其介导的细胞因子IL-10表达水平的改变可能与卵巢癌的免疫抑制相关,在卵巢癌的肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。

血浆DNA定量用于监测成人急性淋巴细胞白血病患者化疗疗效

目的监测成人急性淋巴细胞白血病(ALL)患者化疗过程中的血浆DNA水平,初步探讨其与ALL化疗疗效的关系。方法采集55例成人ALL患者化疗前及其中45例患者化疗一疗程后的静脉血,根据骨髓象、血象及临床体征进行疗效分组。以80名体检健康者作为对照。用磁珠法提取血浆DNA和内参照质粒DNA,双重荧光定量PCR技术进行DNA定量检测。结果 ALL患者化疗前血浆DNA含量[M(P25,P75)]为248.1(97.1,448.7)ng/mL,显著高于健康对照组19.1(12.7,25.8)ng/mL(Z=8.916,P<0.01);化疗一疗程后血浆DNA含量为35.5(17.7,83.0)ng/mL,显著低于化疗前水平(Z=6.322,P<0.01);不同疗效化疗前组血浆DNA水平有显著性差异(χ2=6.960,P<0.05),不同疗效组化疗后血浆DNA水平有显著性差异(χ2=11.145,P<0.01)。完全缓解组化疗前、后血浆DNA水平有显著性差异(Z=3.92,P<0.01),部分缓解组、未缓解组化疗前、后无显著性差异。生存曲线分析显示,化疗一疗程后血浆DNA水平<50 ng/mL的ALL患者生存率高于血浆DNA水平≥50 ng/mL的患者(χ2=3.860,P<0.05)。结论血浆DNA定量检测对ALL的化疗疗效评价及预后评估有重要意义。血浆DNA水平降低提示预后良好。

肺癌细胞促进单核吞噬细胞MAPK相关通路活化诱导炎性细胞因子表达上调的研究

目的通过建立人单核吞噬细胞系(THP-1)和人肺腺癌细胞系(SPC-A1)共培养体系,检测共培养体系中THP-1的炎性细胞因子mRNA表达水平和丝裂原活化蛋白激酶通路(MAPK)的表达情况,初步阐明肺癌微环境对THP-1中炎性细胞因子表达的影响。方法体外培养SPC-A1细胞系、THP-1细胞系,并建立二者共培养体系,设置THP-1单独培养组为对照组。24h后,收集各组THP-1细胞,实时荧光定量聚合酶链式反应(RealTime PCR)检测白细胞介素(IL)-1β、-6、-8及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA表达水平;Western blot检测MAPK通路蛋白c-Jun氨基末端激酶及其磷酸化形式(JNK/p-JNK)、丝裂原活化蛋白激酶p38亚单位及其磷酸化形式(p38 MAPK/p-p38 MAPK)、细胞外调节蛋白激酶及其磷酸化形式(ERK/p-ERK)的表达。结果共培养24h后,共培养组THP-1的IL-1β、IL-8mRNA表达水平均明显高于对照组(P<0.05),分别为对照组的5.81、4.21倍;Western blot结果显示共培养组p38 MAPK、p-p38MAPK的表达水平均明显高于对照组(P<0.05)。结论肺癌细胞可引起肺癌环境中单核吞噬细胞中p38 MAPK通路的活化,进而诱导IL-1β、IL-8mRNA表达上调,有利于肿瘤炎症微环境的维持和促进肿瘤的进展。

microRNA与Toll样受体在NF-κB信号通路中的相互调控作用

Toll样受体（toll．1ikereceptors，TLRs）是一种模式识别受体,参与慢性炎症反应及肿瘤微环境的形成。当其识别相应配体后,可以通过活化一系列信号转导分子激活TLRs通路，介导相应免疫反应。在此过程中，研究发现microRNA（miRNA）家族成员在TLRs通路中发挥了重要作用。一方面TLRs可以诱导miRNA的表达或上调其表达水平,同时miRNA也可调控TLRs通路。

酶联免疫测定法免疫学检验实习带教体会

酶联免疫吸附试验(ELISA)是临床免疫常用的检测方法,其快速、敏感、简便,对医院的仪器设备要求不高,在各级医院均可开展。在该院实习的学生毕业后面向全国各地各种等级的医院的工作,因此ELISA是每一位检验学生必须掌握的实验方法之一。但是笔者发现由于各种原因,导致学生对这部分内容接触和操作较少,因此,对这部分内容无法熟练掌握,针对此现象,笔者通过加强ELISA的基本知识学习、临床病例实验结果的综合分析和质量控制培训3个方面进行带教,让学生理论结合实际操作,为临床提供有扎实理论基础、规范的操作技能,以及有独立思考和解决临床问题能力的高级检验人才。

顺铂诱导的人肺腺癌细胞凋亡过程中miR-638的表达水平研究

目的探讨体内外顺铂(DDP)给药后miR-638表达水平及变化,评价miR-638表达在DDP诱导人肺腺癌细胞凋亡中的意义。方法建立荷SPC-A1瘤的BALB/c裸鼠移植瘤模型,经尾静脉注射DDP后,检测各组裸鼠血清miR-638表达水平。体外培养SPC-A1并经DDP作用不同时间后,检测培养上清miR-638表达水平及细胞凋亡率。收集60例肺腺癌患者DDP化疗前后的血清样本,检测miR-638在化疗前后的表达改变情况并分析其与预后的关系。结果体外DDP处理SPC-A1细胞后凋亡率在24、48和72 h时均显著高于同时间点对照组(P均<0.01),且随时间延长显著增高(任意两组间P<0.01);DDP作用后培养上清中miR-638表达水平呈时间依赖性增高,且在24、48、72 h均显著高于相应对照组(P均<0.05);且SPC-A1培养上清中miR-638水平与凋亡率呈正相关(r=0.711,P<0.01);DDP治疗组裸鼠血清miR-638表达水平明显高于生理盐水处理组和未治疗对照组(P均<0.05),而后两组间差异无统计学意义(P>0.05);接受DDP化疗后血清miR-638表达上调的患者总体生存率明显高于表达下调者(P<0.05)。结论 miR-638在体内和体外DDP诱导的人肺腺癌细胞凋亡中均出现表达上调,提示miR-638可能对肺癌DDP化疗中判断预后及疗效观察具有一定价值。

不同实验室环境下ELISA法检测血清GM结果的可靠性研究

目的探讨半乳甘露聚糖(galactomannan,GM)检测的实验室环境影响因素以及如何降低假阳性,提高检测的准确性。方法选择2016年6月～2017年4月在南京医科大学第一附属医院初诊为疑似侵袭性真菌病的住院患者为研究对象,在不同的实验室环境下进行ELISA法检测血清GM。在一般环境下检测3 407例样本,进行随机空气培养,观察培养结果并鉴定出菌落种类,并以培养菌落制备混悬液进行处理取上清进行GM检测。在严格控制环境下检测1 167例样本,并进行两组之间的比较。结果在一般环境下检测的真阳性率为3.38%,敏感度为63.0%(34/54),特异度为40.9%(56/137),阳性预测值(positive predictive value,PPV)为29.6%;在严格控制环境下真阳性率为3.94%,敏感度和特异度分别为79.4%(27/34)和34.5%(10/29),PPV为58.7%(27/46)。两者之间,后者PPV明显高于前者,差异有统计学意义(χ~2=11.85,P<0.001)。空气培养、鉴定结果及GM检测结果表明,随机污染的曲霉菌属导致较强的假阳性结果,毛霉菌属导致中度的假阳性结果,而枯草芽孢杆菌导致轻度假阳性结果。结论环境中的枯草芽孢杆菌,曲霉菌和毛霉菌对检测环境的随机污染是导致GM检测假阳性结果的重要原因,通过对检测环境严格的控制和消毒措施可以降低假阳性,改善检测结果,提高检测结果的敏感性。

肿瘤相关M2型巨噬细胞在卵巢癌组织中的分布及意义

目的探讨卵巢癌组织中M2型巨噬细胞的分布及其对卵巢癌侵袭转移相关基质金属蛋白酶(MMPs)表达的影响。方法免疫组织化学法检测上皮性卵巢癌(34例)、交界性卵巢肿瘤(16例)和卵巢良性肿瘤(18例)组织切片中CD68、CD206和MMP-9的表达,比较卵巢癌样本中阳性表达细胞数与患者年龄、病理类型、FIGO分期、组织学分化和淋巴结转移的关系。并利用流式细胞术比较其中12例上皮性卵巢癌和11例卵巢良性肿瘤新鲜组织中CD68+~CD206+~细胞比例。实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印记(Western blot)方法分别评价卵巢癌和卵巢良性肿瘤组织内MMP-2、MMP-9和MMP-10水平。结果卵巢癌组织中CD68+~、CD206+~和MMP-9+~细胞数量明显高于交界性卵巢肿瘤和卵巢良性肿瘤组织(P<0.05),卵巢癌组织中CD68+~、CD206+~和MMP-9+~细胞数与患者FIGO分期和淋巴结转移均有统计学关系(P<0.05)。卵巢癌组织中CD68+~和CD206+~细胞数量呈正相关关系(r=0.508,P<0.05),且MMP-9+~与CD68+~和CD206+~细胞数量也分别呈正相关(r=0.611,P<0.001;r=0.744,P<0.001)。卵巢癌新鲜组织中CD68+~CD206+~细胞比例明显高于良性卵巢肿瘤(P<0.05),且卵巢癌组织MMP-2、MMP-9和MMP-10 m RNA和蛋白表达水平较卵巢良性肿瘤具有统计学意义(P<0.05)。结论卵巢癌组织中具有较高水平的M2型巨噬细胞,与卵巢癌侵袭转移和临床进展有重要的联系。

miR-638对人肺腺癌细胞凋亡的影响

目的:探讨miR-638在肺腺癌中的表达及其与肺腺癌细胞凋亡的关系。方法:应用real-time RT-PCR的方法检测了miR-638在肺腺癌细胞株SPC-A1中的表达情况,并采用脂质体法将miR-638模拟物瞬时转染入SPC-A1。实验设置空白对照组、无关miRNA阴性对照组和miR-638转染组,转染后在荧光显微镜下观察转染效率,实时荧光定量RT-PCR检测miR-638的表达,流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果:与正常细胞相比,miR-638在肺腺癌细胞中低表达。SPC-A1细胞转染miR-638模拟物后,细胞凋亡率相对于空白组和阴性对照组显著升高(P<0.05)。结论:miR-638在肺腺癌中低表达,且能够促进肺腺癌细胞凋亡,可作为后续肺癌生物治疗的新分子靶标。

卵巢癌患者CD8^+ T细胞中调节性T细胞相关分子标志物的表达率及临床意义

目的 :检测卵巢癌患者组织及外周血CD8^+T细胞中调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)相关分子标志物的表达率,探讨其在卵巢癌发生发展中的临床意义。方法:用流式细胞术检测31例卵巢癌患者、31例卵巢良性肿瘤患者和31例健康对照者的外周血,以及14例卵巢癌组织和12例卵巢良性肿瘤组织CD8^+T细胞中Foxp3、CD25、CD28、CTLA-4及GITR的表达率。结果:Foxp3和CTLA-4在卵巢癌组织CD8^+T细胞中的表达率显著高于卵巢良性肿瘤组织(P<0.05);CD28在卵巢癌组织CD8^+T细胞中的表达率显著低于卵巢良性肿瘤组织(P<0.05)。卵巢癌患者外周血CD8+T细胞中Foxp3、CD25、CTLA-4的表达率显著高于卵巢良性肿瘤患者和健康对照者(P<0.05),CD28的表达率显著低于卵巢良性肿瘤患者和健康对照者(P<0.05)。结论:卵巢癌组织及外周血CD8^+Treg所占的比例显著高于卵巢良性肿瘤组及健康对照组,且CD8^+T细胞中Foxp3的表达率可能对了解卵巢癌进展状况有一定帮助。

TGF-β1调控卵巢癌微环境中CD8^+Treg的表型及功能初探

目的初步探讨TGF-β1在卵巢癌微环境中对CD8+Treg诱导过程的作用。方法建立卵巢癌细胞系SKOV3与健康人外周血CD8+T细胞体外Transwell共培养系统,实验组为SKOV3与健康人外周血CD8+T细胞共培养组,对照组为健康人外周血CD8+T细胞单独培养组,培养5 d后收集2组共培养上清。ELISA法检测2组上清中TGF-β1水平。在上述共培养体系基础上增加anti-TGF-β1中和组,即在SKOV3与健康人外周血CD8+T细胞共培养体系中加入anti-TGF-β1中和抗体,共培养5 d后收集3组CD8+T细胞。流式细胞术检测各组CD8+T细胞中Treg相关标志物(CD25、Foxp3、CD28)的表达率。将3组CD8+T细胞和na?ve CD4+T细胞按照1∶0、1∶1、1∶5、1∶10、0∶1的比例进行共培养,并在体系中加入anti-CD3及辐照的PBMCs,培养56 h后加入3H-Td R,继续培养16 h后收集细胞,液体闪烁仪检测CPM值。结果与CD8+T细胞单独培养组相比,SKOV3/CD8共培养组上清中高表达TGF-β1(P<0.01)。在共培养体系中加入anti-TGF-β1中和抗体后,与SKOV3/CD8共培养组相比,anti-TGF-β1中和组CD8+CD28-Treg、CD8+CD25+Treg和CD8+Foxp3+Treg细胞比例显著下降,但相比CD8+T细胞单独培养组仍然升高。功能抑制试验结果显示,共培养组CD8+T细胞能抑制na?ve CD4+T细胞的增殖,anti-TGF-β1中和组仅在CD8+T细胞和na?ve CD4+T细胞比例为1∶1时对na?ve CD4+T细胞增殖呈现抑制作用,而单独培养组CD8+T细胞不能抑制na?ve CD4+T细胞的增殖。结论 anti-TGF-β1可部分中和卵巢癌微环境诱导的CD8+Tregs表型及功能,TGF-β1是卵巢癌细胞生长微环境诱导CD8+Treg分化过程重要的作用因素之一。

卵巢癌患者CD4^+T细胞中调节性T细胞相关分子标志物的表达特点及临床意义

目的:探讨卵巢癌患者外周血和肿瘤组织CD4+调节T细胞中性T细胞相关分子标志物(Foxp3、CD25、CD127、CTLA-4及GITR)的表达特点及其临床意义。方法 :流式细胞术检测31例卵巢癌患者,26例卵巢良性肿瘤患者和20例健康对照者的外周血,以及14例卵巢癌组织和12例卵巢良性肿瘤组织CD4+T细胞中Foxp3、CD25、CD127、CTLA-4及GITR的表达水平。结果:卵巢癌组织CD4+T细胞中的Foxp3、CD25、CTLA-4及GITR的表达水平显著高于卵巢良性肿瘤组织(P<0.05);CD127在卵巢癌组织CD4+T细胞中所占的比例显著低于卵巢良性肿瘤组织(P<0.01);卵巢癌患者外周血CD4+T细胞中Foxp3、CD25、CTLA-4及GITR的表达水平均显著高于卵巢良性肿瘤患者和健康对照者(P<0.01),CD127的表达水平显著低于卵巢良性肿瘤患者和健康对照者(P<0.01);Ⅲ/Ⅳ期卵巢癌患者外周血CD4+T细胞中Foxp3的表达水平显著高于Ⅰ/Ⅱ期患者(P<0.05);Ⅲ/Ⅳ期卵巢癌患者外周血CD4+T细胞中CD127的表达水平显著低于Ⅰ/Ⅱ期患者(P<0.05)。结论:卵巢癌患者外周血及肿瘤组织中CD4+Treg细胞的表达水平显著高于卵巢良性肿瘤组和健康对照组,Foxp3和CD127的表达水平与肿瘤分期有关,提示这两种标志物可作为判断卵巢癌疾病进展的重要指标。

Toll样受体在卵巢癌发生发展中作用机制的初步探讨

目的:观察卵巢癌患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中Toll样受体(Toll-likereceptors,TLRs)mRNA的表达水平,研究高表达TLRs在卵巢癌发病中的可能机制。方法:研究对象包括卵巢癌24例、妇科良性疾病22例及同期健康体检女性22例。采用密度梯度离心法分离PBMC后,提取总RNA,并逆转录为cDNA,采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)方法检测TLR1～TLR9 mRNA的表达水平;选择mRNA高表达的TLRs的相应激动剂刺激PBMC,采用Real-time PCR检测PBMC中前炎症细胞因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-12P40的mRNA表达水平。结果:各组PBMC中TLR1～TLR9均有表达;卵巢癌组PBMC中TLR2、TLR6表达量显著高于健康对照组(TLR2:F=3.27,P<0.05;TLR6:F=2.21,P<0.05);卵巢癌组TLR2的表达量明显高于妇科良性疾病组(F=3.24,P<0.05);良性疾病组TLRs表达水平与健康对照组间无显著性差异;各组PBMC经TLR2的激动剂HKLM刺激24 h后,卵巢癌组IL-1β、IL-6、IL-12P40 mRNA表达明显增强,分别为健康对照组的2.24、2.94、2.35倍(P<0.05),为良性疾病组的2.02、2.50、2.85倍(P<0.05);良性疾病组与健康对照组比较无显著改变(F=1.11,F=1.18,F=0.82,P>0.05)。结论:卵巢癌患者PBMC中TLR2、TLR6表达水平显著增高,经其介导的炎症因子IL-1β、IL-6、IL-12P40 mRNA表达水平的改变可能在卵巢癌的发生发展中发挥作用。

卵巢癌患者TLR1、TLR2、TLR6信号通路活化诱导PBMC前炎症细胞因子分泌

目的观察卵巢癌(OC)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中Toll样受体1(Toll-like receptors 1,TLR1)、TLR2及TLR6信号通路活化后前炎症细胞因子分泌水平,研究其在OC发病中的可能机制。方法纳入OC患者、女性妇科良性疾病(BC)患者及同期体检健康女性(NC)各13例,用密度梯度离心法分离PBMC并用TLRs的相应配体刺激PBMC,用CBA免疫荧光法检测细胞中前炎症细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌水平;用western blot检测MyD88、TRAF6、TANK、NF-κB和P-NF-κB的表达水平。结果 OC组、BC组、NC组未加配体刺激前,PBMC中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α分泌水平差异均无统计学意义(P>0.05)。与未经配体刺激PBMC相比,OC组PBMC经TLR1配体Pam3CSK4刺激24 h后,IL-1β分泌水平增高,差异具有统计学意义(t=-2.667,P<0.05);TLR2配体HKLM刺激24 h后,OC组IL-1β、TNF-α分泌水平亦增高,差异有统计学意义(t分别为-5.391和-3.564,P均<0.05);相较于未经配体刺激时,BC组、NC组的PBMC在相应TLRs配体刺激后,IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α分泌水平变化无统计学意义。OC患者PBMC经Pam3CSK4、HKLM、FSL-1刺激后,TLRs信号通路蛋白MyD88、TRAF6、TANK及P-NF-κB表达上调。结论 OC患者PBMC中TLR1、TLR2、TLR6经相应配体刺激后可活化TLR信号通路,并诱导前炎症细胞因子IL-1β、TNF-α分泌水平增加,在OC的发生发展中发挥作用。