蛋白酶体抑制剂MG132诱导HL-60细胞凋亡前G_2/M期阻滞及机制

背景和目的:蛋白酶体(proteasome)抑制剂能够诱导多种肿瘤细胞凋亡,是一种潜在的有应用前景的抗肿瘤剂。本研究旨在探讨蛋白酶体抑制剂MG132(Z-Leu-Leu-Leu-CHO)诱导白血病细胞HL-60凋亡和G2/M期阻滞的机制。方法:采用荧光显微镜观察、流式细胞术和免疫印迹研究测定MG132诱导HL-60细胞凋亡和周期阻滞及机制。结果:2μmol/L的MG132能够有效地诱导HL-60细胞凋亡,用药后24h就显现有细胞凋亡;在MG132诱导HL-60细胞凋亡出现之前有一个明显的G2/M期阻滞,加MG132后12h时G2/M期时相百分比为63.42±2.02;24h时加MG132组细胞凋亡为16.67±1.48,与对照组G2/M期时相百分比为7.29±3.01及细胞凋亡为0相比,两者之间有显著性差别(P<0.01);咖啡因CAF能够减少MG132诱导HL-60细胞出现的G2/M期阻滞,同时也减少凋亡细胞的比例;细胞周期检查点的负调控因子p21waf/cip1蛋白在加MG132处理后3h有明显的表达,但并未能检测到p53和p27蛋白。结论:MG132诱导HL-60细胞凋亡之前有一个明显的G2/M期阻滞,p21蛋白表达明显上调提示:是p21waf/cip1而不是p53或其同源蛋白参与了其中的调控。

从人白细胞cDNA文库筛选凋亡素相互作用蛋白

来源于鸡贫血病毒的小分子蛋白 凋亡素 (apoptin)能够选择性诱导肿瘤细胞凋亡 ,为研究其选择性诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制 ,利用酵母双杂交系统筛选从人白细胞cDNA文库筛选apoptin相互作用蛋白 ,核酸序列分析及同源性检索表明 ,其中一个与ABP2 80 (actin bindingprotein 2 80 )有高度同源性 .细胞免疫共沉淀实验结果显示 :在哺乳动物细胞水平仍能够检测到apoptin与ABP2 80片段的特异的相互作用 .分别构建缺失C端 11个氨基酸、中间 33～ 46位氨基酸和二者均缺失的apoptin的 3个突变体 ,突变体与ABP2 80相互作用研究表明 :apoptin的 33～ 46位氨基酸 (核外运信号 )对于apoptin与ABP2 80的相互作用是必需的 ,而C端核定位信号 /DNA结合序列对于apoptin与ABP2

DNA损伤生物学反应中ATM对p21^(WAF1/CIP1)蛋白的直接磷酸化

毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白 (mutatedinataxiatelangiectasia ,ATM)是直接感受DNA双链断裂损伤并起始诸多DNA损伤信号反应通路的主开关分子 .已有研究发现 ,DNA损伤生物学反应中 ,ATM可通过磷酸化活化p5 3,继而转录活化细胞周期检查点蛋白p2 1WAF1 CIP1的表达 ,而对于ATM是否直接参与p2 1WAF1 CIP1的早期活化迄今尚无实验证明 .通过免疫共沉淀反应 ,检测到细胞电离辐射 (ionizingradiation ,IR)反应早期ATM与p2 1WAF1 CIP1蛋白存在相互作用 .将p2 1WAF1 CIP1蛋白编码基因全长克隆入原核表达载体pGEX4T 2 ,经诱导表达及亲和层析纯化获取GST p2 1融合蛋白作为磷酸化底物 .体外磷酸化实验检测证明 ,IR活化的ATM具磷酸化p2 1WAF1 CIP1蛋白的功能 ,并且此磷酸化功能可被PI3K家族特异性抑制剂Wortmannin所抑制 .结果揭示了IR后ATM可通过直接磷酸化p2 1WAF1 CIP1蛋白 ,在IR致DNA损伤生物学反应早期调控p2 1WAF1

抑制端粒酶催化亚基的表达促进Survivin蛋白的降解

背景与目的:研究表明,在肿瘤细胞中端粒酶催化亚基(hum antelom erase reverse transcriptase,hTERT)与存活素(Survivin)的表达具有相关性,本研究拟探索肿瘤细胞中hTERT与Survivin在功能上是否存在相互调控作用。方法:采用反义核酸分别抑制survivin与hTERT在H eLa S3细胞中的表达,端粒重复扩增法检测细胞中端粒酶活性的变化,并分别采用W estern印迹与RT-PCR分析细胞中Survivin蛋白水平与m RNA水平的变化,M TT法检测H eLa S3细胞的增殖变化。结果:采用反义核酸抑制H eLa S3细胞中survivin的表达对端粒酶的活性没有影响,但是采用反义核酸No.14抑制hTERT的表达可以显著降低细胞中Survivin蛋白水平,而m RNA水平未受影响。而且当反义核酸No.14的浓度在200～1000nm ol/L范围内时,Survivin蛋白水平的下降与反义寡核苷酸的浓度呈正相关,这种下降可以被泛素化蛋白酶抑制剂lactacystin和M G132所抑制。此外,在H eLa S3细胞中同时抑制hTERT与survivin的表达可以协同性地抑制细胞增殖。结论:抑制H eLa S3细胞中hTERT的表达可以促使Survivin蛋白通过泛素蛋白酶体途径降解。

亚细胞蛋白质组学技术分析MG132诱导HL-60细胞G_2/M期阻滞的分子机制

背景与目的:蛋白酶体抑制剂能够诱导多种肿瘤细胞凋亡,是一种有应用前景的抗肿瘤制剂。本研究通过对蛋白酶体抑制剂——MG132诱导G2/M期阻滞的HL-60细胞核蛋白进行蛋白质组学分析,探索参与HL-60细胞G2/M期阻滞调控的相关蛋白。方法:流式细胞术分析MG132处理的HL-60细胞周期,选取合适的时间点,提取细胞核,光镜和Westernblot检测细胞核纯度,裂解制样,通过二维电泳和MALDI-TOF-TOF串联质谱分析,鉴定表达显著差异的细胞核蛋白。结果:HL-60细胞在被2.5μmol/LMG132诱导凋亡之前8h,有明显的G2/M期阻滞发生;提取阻滞发生时和阻滞发生前的HL-60细胞核蛋白,二维电泳分析获得23个差异表达的蛋白点,质谱鉴定了8个核蛋白。结论:质谱鉴定的eIF5A、mRNA前体剪接因子等蛋白可能参与HL-60细胞的G2/M周期阻滞调控,为研究蛋白酶体抑制剂诱导白血病细胞周期阻滞及凋亡的分子机制提供了一些线索。

人外周血活化淋巴细胞survivin基因的转录激活和表达相关的信号转导通路研究

Survivin是与细胞增殖和细胞凋亡调控密切相关的重要功能蛋白质 ,也是肿瘤临床诊断的分子标志物及治疗研究的理想靶标 .由于发现人外周血活化淋巴细胞存在Survivin蛋白的显著表达 ,故以植物血凝素 (PHA)和IL 2共刺激培养的正常人外周血单个核细胞为实验材料 ,采用RT PCR、蛋白质印迹以及细胞周期分析等实验方法 ,观察淋巴细胞活化与Survivin蛋白表达之间的相互关系 ,并利用 3种激酶抑制剂探索了淋巴细胞活化所致Survivin蛋白表达相关的信号转导通路 .实验结果表明 :人外周血单个核细胞在刺激培养 36h前后出现survivin基因的明显转录激活和蛋白质的起始表达 ,表达产物的水平随培养时间的延长而增加 ,且具有明显的细胞周期和周期时相依赖性 .JAK2的抑制剂AG4 90阻断细胞周期的运行 ,且强烈抑制survivin基因的转录激活和蛋白质表达 ,PI3K和MEK的抑制剂Wortmannin和PD980 5 9也有一定程度的抑制作用 .所得实验结论是 :survivin基因的转录激活和蛋白质表达与淋巴细胞活化相关联 ,代表细胞处在增殖状态 .JAK2介导的JAK STAT信号通路是淋巴细胞活化 ,Survivin蛋白表达必需和最重要的信号转导通路 ,PI3K和MEK介导的信号通路也具有一定的影响作用 .

HeLa细胞中Skp2的表达调控p21WAFCIP1稳定性

泛素 蛋白酶体抑制剂MG 132处理的HeLa和SaoS 2细胞中 ,低表达的p2 1WAF CIP1受泛素 蛋白酶体通路调控 .为探讨肿瘤细胞中高表达的E3连接酶底物结合亚基 Skp2和低表达的p2 1WAF CIP1之间的关系 ,在HeLa细胞中转染Skp2的反义寡核苷酸后 ,p2 1表达水平明显升高 .同时 ,相对于转染空载体和Skp2ΔF(Skp2的F box缺失突变体 )的真核表达载体 ,转染全长Skp2的HeLa细胞中 ,p2 1表达水平显著下降 ,说明肿瘤细胞中Skp2调节p2 1的稳定性 ,并且这种调控作用依赖于Skp2蛋白中的F box结构 .免疫荧光结果表明 ,Skp2和p2 1共定位于细胞核 ,这为两者间的相互作用提供了前提 ;体内相互免疫共沉淀结果表明 ,p2 1和其它SCFSkp2 的底物一样与Skp2直接结合 ,并且它们之间的结合区不在F box结构域 ,这一结果在体外的GST

Skp2参与HeLa细胞G_2/M周期检查点的调控

具癌基因特性的Skp2在大多数肿瘤组织和肿瘤细胞中异常高表达,它作为SCFSkp2复合物的底物识别亚基调控p27KIP蛋白的稳定性而促进细胞G1/S期转换.为进一步明确Skp2与G2/M周期检查点的关系,在HeLa细胞中过表达Skp2以及通过反义寡核苷酸抑制Skp2表达.结果发现:Skp2能促进细胞周期运转,表现为S期细胞增多和G2/M期细胞减少,其中F-box结构域具有重要的功能意义;反义寡核苷酸抑制Skp2表达后,HeLa细胞发生显著的G2/M期阻滞;MTT检测结果表明,400nmol/L的Skp2的反义寡核苷酸能明显抑制HeLa细胞的增殖活性;Western印迹结果表明,HeLa细胞中Skp2可能通过负调控p21WAF的稳定性来参与G2/M检查点调控,这在用放线菌素D处理HeLa细胞的实验中得到验证.这些结果初步揭示了Skp2参与HeLa细胞G2/M周期检查点调控的分子机制.

TSA诱导MOLT-4细胞中p21^(WAF1/Cip-1)表达的功能机制研究

为了研究去乙酰化酶抑制剂TSA诱导MOLT-4细胞周期阻滞和凋亡反应中p21WAFl/Cip-1的表达及其功能, 以组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理急性淋巴细胞白血病细胞系MOLT-4,流式细胞仪和细胞吖啶橙染色、瑞士染 色检测细胞周期和凋亡,Western检测p21p21WAFl/Cip-1的表达。结果表明:组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA可有效的诱导 MOLT-4细胞发生G2／M阻滞和凋亡,并且呈现明显的剂量效应关系和时间效应关系;在此周期阻滞与凋亡反应过 程中,p21WAFl/Cip-1蛋白的表达水平在周期阻滞前快速增高,而在凋亡早期开始下降。p21WAFl/Cip-1分子在细胞中的表 达规律与TSA诱导的细胞G2／M阻滞和凋亡反应间存在明显的剂量效应关系和时间效应关系;蛋白酶体抑制剂 MG-132提升p21WAFl/Cip-1分子在细胞中的表达可以增进细胞的G2／M阻滞反应而延缓凋亡。结论:蛋白酶体途径参 与TSA诱导的MOLT-4细胞周期阻滞向凋亡转换过程中p21WAFl/Cip-1分子的降解调控;p21WAFl/Cip-1在TSA诱导的 MOLT-4细胞G2／M阻滞和凋亡反应中起着重要调节作用。

一种快速mRNA差异显示技术及用于分离辐射诱导转录子

介绍一种从不同类型细胞或不同生长状态细胞中分离差异表达基因的快速ｍＲＮＡ差异显示技术．其特点是不用同位素标记，操作简便，在普通琼脂糖凝胶电泳中就能分辨差异显示的ｃＤＮＡ带，便于ＤＮＡ回收和进一步重组克隆．用此方法成功地分离到电离辐射诱导转录子．

城市基础设施PPP项目治理策略研究

从多中心治理理论的视角出发,阐述PPP项目中各主体行为选择的差异,分析城市基础设施PPP项目运行的困境,提出健全立法、加强监管、企业自身提升、加强金融和咨询服务等策略,以提高城市基础设施PPP项目的治理水平。

浅析汽车发动机散热器溢水故障的分析与排除

汽车发动机的散热器是汽车运行使用的关键,导致散热器溢水故障的原因有很多种,其中我们将主要的原因总结为三种,分别是发动机温度过高、水道中存有气体、散热器出现故障。这三点虽是导致汽车发动机散热器溢水的主要原因,但造成溢水的根本因素还需要进一步的分析和研究。本文将对汽车发动机散热器溢水故障进行仔细的排查与探讨,并逐一提出排除故障隐患的方法。

凋亡素的克隆及诱导HeLa细胞凋亡

目的 :克隆凋亡素 (apoptin)的全长基因 ,在肿瘤细胞HeLa中表达并诱导其凋亡。方法 :从CAV病毒基因组TK580 3中通过PCR技术扩增凋亡素基因 ,直接克隆至真核表达载体pCDNA3.1/His/Topo ,序列测定证实其正确性 ,并克隆至pCIneo真核表达载体构建重组表达载体。采用脂质体转染HeLa细胞 ,转染 3d后Honchest332 58染色并于荧光显微镜下观察细胞状态。结果与讨论 :核酸序列分析证实所克隆的凋亡素基因与文献报道的一致 ,将其成功克隆至真核表达载体pCDNA3.1/His/Topo和pCIneo ,构建了真核重组质粒pCIneo apoptin和pCDNA3.1/His/Topo apoptin ,转染HeLa细胞 3d后可见明显的细胞凋亡 ,而只转染空质粒的对照组则较少。表明凋亡素能够有效地诱导HeLa细胞凋亡。

凋亡素选择性诱导肿瘤细胞凋亡及其分子机制

来源于鸡贫血病毒（ＣＡＶ）的凋亡素（Ａｐｏｐｔｉｎ） 能够选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，且不依赖于ｐ５３ 介导，对ｂｃｌ－２ 过表达不敏感的特点，使其成为一种非常有前景的抗肿瘤剂。该文介绍了凋亡素诱导细胞凋亡的作用特点，并对其凋亡选择性诱导研究的分子机制进行了探讨。

DNA错配修复基因MutS的克隆和表达

目的：克隆ＭｕｔＳ基因并构建高效表达菌株，为建立ＤＮＡ错配突变检测系统和应用于临床肿瘤的检测等打下重要的基础。方法与结果：通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）从Ｅ．ｃｏｌｉ基因组中扩增得到ＭｕｔＳ基因（２．６ｋｂ），克隆在ｐＧＥＭ－Ｔ载体上，构建了重组质粒载体ｐＧＥＭ－Ｔ／ＭｕｔＳ，核酸序列分析表明所克隆的基因与Ｇｅｎｂａｎｋ的ＭｕｔＳ一致。然后亚克隆到原核表达载体ｐＢＶ２２０上，构建了重组菌株ＤＨ５α／ｐＢＶ２２０－ＭｕｔＳ，４２℃热诱导表达ＭｕｔＳ蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示在相对分子质量９７×１０３左右处出现一条表达量高达３０％以上的表达蛋白带，而对照菌株表达量很低。将重组质粒ｐＢＶ２２０－ＭｕｔＳ转化到ＭｕｔＳ缺陷菌株ＥＳ１３０１互补了该菌株ＭｕｔＳ的缺陷，使其链霉素、利福平抗性（Ｓｔｒｒ，Ｒｉｆｒ）的突变频率分别降低９９％、９６％。结论：克隆得到ＭｕｔＳ基因并在大肠杆菌中得到高效表达。

存活素基因表达调控机制的研究

目的 :阐明凋亡抑制蛋白存活素 (survivin)的基因表达调控机制。方法 :采用PCR的方法从人HeLaS3细胞基因组DNA中扩增得到survivin基因上、下游侧翼序列 ,将它们分别克隆至报告基因表达载体中 ,依据报告基因的瞬时表达结果确定它们对survivin基因的表达调控作用 ,进而采用定向缺失的方法确定其核心启动子 ,并通过凝胶阻滞实验进行验证。结果与结论 :survivin基因起始密码子上游 2 6 8bp的序列是指导其在肿瘤细胞中周期性表达的最小核心启动子 (mini_promoter)。此外 ,体外培养的正常人外周血淋巴细胞经PHA_P与IL_2的刺激增殖的同时 ,survivin基因也得以表达 ,提示survivin基因的表达与细胞的增殖过程密切相关。

PKA磷酸化p21^(WAF)后对其泛素化修饰和稳定性的影响

目的:探索p21被蛋白激酶A(PKA)磷酸化修饰后对其泛素化修饰和稳定性的影响。方法:构建p21可能磷酸化位点的突变体p21 T145A,观察PKA体外磷酸化修饰p21;W estern印迹分析PKA特异性抑制剂H89对p21稳定性的影响;通过免疫沉淀分析H89对p21泛素化修饰的影响以及p21 Thr 145突变前后和Skp2结合能力的变化。结果:PKA体外磷酸化修饰p21的Thr 145;PKA特异性抑制剂H89能够提高p21的稳定性并抑制p21的泛素化修饰;野生型(w ild)p21比p21 T145A结合Skp2的能力强。结论:PKA磷酸化修饰p21的Thr145后导致其结合E3连接酶结合亚基Skp2的能力增强,从而促进p21的泛素化修饰,导致p21稳定性的降低。

53BP1蛋白对P53转录调控活性的影响

目的 :探索含有BRCT结构域的P5 3分子结合蛋白 5 3BP1调控P5 3转录活性的机制。方法 :通过PCR的方法获得缺失不同结构域的 5 3BP1基因突变体 5 3BP1Δ1,5 3BP1Δ2 ,5 3BP1Δ3与 5 3BP1Δ4 ,并采用双荧光素酶报告基因系统分析了它们对P5 3蛋白转录活性的影响。结果与结论 :野生型 5 3BP1蛋白可以明显提高P5 3的转录活性 ,其C端的BRCT结构域与核定位信号的存在为必不可少 ,而N端与P2 0 2蛋白相互结合结构域的存在也可以促进P5 3的转录活性 ,提示 5 3BP1蛋白不同功能结构域之间的协同作用是保证其行使正常生理功能的前提条件。